Hasil
Deteksi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Lele Transgenik F3
Deteksi transgen (PhGH) dilakukan pada embrio dan larva ikan lele transgenik F3 dan non-transgenik (pooling).
Kualitas dan kuantitas genom DNA Embrio dan Larva
Cek kualitas genom DNA dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan loading dye sebagai pemberat dan pewarna molekul DNA. Hasil elektroforesis pada genom embrio dan larva menunjukkan bahwa ekstraksi DNA berhasil dilakukan, dimana semua genom sampel muncul dengan ketebalan pita DNA yang berbeda (Gambar 3).
Gambar 3. A = genom DNA Embrio. B = genom DNA larva
Cek kuantitas DNA dilakukan untuk mengukur konsentrasi genom hasil ekstraksi dengan kemurnian berkisar antara 1,8–2,0. Konsentrasi DNA mempengaruhi ketebalan pita DNA melalui elektroforesis. Berdasarkan cek Qubit fluorometri (invitrogen) yang terdapat pada Lampiran 4, maka diperoleh beberapa data konsentrasi DNA embrio dan larva pada tabel berikut :
Tabel 1. Cek Konsentrasi DNA pada Beberapa Genom Embrio Ikan Lele Transgenik F3
Sampel Rata-rata konsentrasi (ng/mL) Kemurnian (Absorban 280/260) Embrio Larva 1 1494 ± 45,60 83340 ± 1304,99 1,8 – 2,0 2 3716 ± 70,92 86160 ± 433,58 3 1664 ± 32,86 59720 ± 549,54
Tabel 1 menunjukkan jumlah konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi embrio dan larva, dimana jumlah rata-rata konsentrasi tertinggi yaitu pada sampel larva 2 dengan rata-rata 86160 ng/mL dan rata-rata terendah yaitu pada sampel embrio 1 dengan rata-rata 1494 ng/mL.
Hasil Deteksi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3
Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terdeteksi pada beberapa embrio dan larva pada ikan lele transgenik F3 dengan ukuran fragmen sebesar 1500 bp, sementara pada ikan non-transgenik tidak terdeteksi (Gambar 4).
Gambar 4. Hasil deteksi transgen (PhGH) pada embrio dan larva ikan lele transgenik F3 menggunakan metode PCR. M= Marker DNA (100-3000 bp) (Vivantis). Tanda (+) = kontrol positif plasmid (pCcBa-PhGH). Tanda (-) = kontrol negatif. E = embrio. L= larva. Ukuran fragmen gen PhGH = 1500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp k.positif Deteksi transgen 1500 bp Deteksi transgen b
Analisis ekspresi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Lele Dumbo Transgenik F3
Analisis ekspresi transgen (PhGH) dilakukan pada embrio dan larva ikan lele transgenik F3 dan non-transgenik (pooling).
Kualitas dan kuantitas genom RNA Embrio dan Larva
Cek kualitas genom RNA dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan loading dye sebagai pemberat dan pewarna molekul RNA. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa ekstraksi RNA berhasil dilakukan, dimana genom sampel muncul dengan ketebalan pita RNA yang berbeda dan terdapat dua baris pita RNA dengan ukuran 18S rRNA dan 28S rRNA (Gambar 5).
Gambar 5. Genom RNA embrio dan larva ikan lele Transgenik F3. M adalah marker DNA (100-3000 bp) (Vivantis). E = embrio. L = larva. Ukuran fragmen = 18S rRNA dan 28S rRNA.
Cek kuantitas RNA dilakukan untuk mengukur konsentrasi genom hasil ekstraksi RNA dengan kemurnian berkisar antara 1,8–2,0. Berdasarkan cek Qubit fluorometri (invitrogen) yang terdapat pada Lampiran 5, maka diperoleh data konsentrasi RNA embrio dan larva pada tabel berikut :
100 bp Genom RNA 1500 bp Genom RNA 800 b 1500 bp 1000 bp 500 bp
Tabel 2. Cek Konsentrasi RNA Genom Embrio Ikan Lele Transgenik F3 Sampel Rata-rata konsentrasi (ng/mL) Kemurnian
(Absorban 280/260) Embrio Larva 1 1792000 ± 53572,38 1111000 ± 42485,29 1,8 – 2,0 2 1410000 ± 64420,49 960000 ± 51478,15 3 2201000 ± 105261,57 1112000 ± 28853,07 4 1190000 ± 41683,33 1665000 ± 47565,74 5 1537000 ± 47775,51 1235000 ± 32015,62 6 2040000 ± 68282,50 1360000 ± 23184,04
Tabel 2 menunjukkan jumlah rata-rata tertinggi konsentrasi RNA yaitu pada sampel embrio 3 dengan rata-rata konsentrasi sebesar 2201000 ng/mL dan rata-rata terendah yaitu pada sampel larva 2 dengan rata-rata konsentrasi sebesar 1190000 ng/mL.
Hasil ekspresi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3
Transgen dapat terekspresi pada beberapa embrio dan larva pada populasi ikan lele transgenik F3, sementara pada ikan non-transgenik tidak terekspresi. Hasil ekspresi transgen dibandingkan dengan gen β-actin sebagai internal kontrol (Gambar 6).
Gambar 6. Ekspresi transgen pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik
F3. A = amplifikasi primer β-aktin. B = amplifikasi primer ACT 107
& PhGH2. M= Marker DNA (100-3000 bp) (Vivantis). Tanda (+) = kontrol positif plasmid (pCcBa-PhGH). Tanda (-) = kontrol negatif. E1-E5 = embrio transgenik. L1-L5 = larva transgenik. E6 dan L6 = embrio dan larva Ikan lele dumbo non-transgenik. Ukuran fragmen RNA = 300 bp. 1000 b 500 bp 100 bp Β-act 300 bp Ekspresi larva Ekspresi embrio
A B
K.positifPembahasan
Deteksi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Ikan Lele dumbo Transgenik F3
Kualitas dan kuantitas genom DNA Embrio dan Larva
Hasil penelitian menunjukkan ekstraksi DNA dari sampel embrio dan larva (pooling) berhasil dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (GeneJet Genomic DNA Purification, Thermo Scientific). Hal tersebut dibuktikan dari hasil cek genom melalui elektroforesis dimana semua genom muncul dengan memiliki ketebalan pita DNA yang berbeda.
Hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA pada sampel embrio lebih tipis dibandingkan dengan pita DNA pada sampel larva. Adanya perbedaan pada ketebalan pita DNA tersebut terjadi karena perbedaan jumlah konsentrasi DNA hasil ekstraksi, dimana jumlah konsentrasi DNA pada sampel larva lebih tinggi dibanding DNA sampel embrio. Noer dan Marsia. (2007) melaporkan bahwa semakin besar konsentrasi templat akan semakin terang dan tebal pita DNA yang dihasilkan, namun konsentrasi templat yang terlalu tinggi juga akan mengakibatkan terbentuknya pita yang smear, sebaliknya konsentrasi templat terlalu rendah akan menyebabkan terbentuknya pita yang terlalu tipis untuk dapat dideteksi dengan cara elektroforesis gel agarosa. Restu dkk. (2012) menambahkan bahwa produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih serta pita DNA yang menyala.
Kualitas genom embrio dan larva didukung oleh kuantitasnya. Hasil pengukuran konsentrasi DNA menunjukkan bahwa semua sampel mempunyai kemurnian yaitu 1,8 – 2,0. Hal ini membuktikan bahwa kualitas semua genom sampel baik. Menurut Gallagher. (2004), konsentrasi DNA hasil ekstraksi yang
baik berkisar antara 1,8-2. Rasio 1,8-1,9 dan 1,9-2,0 menunjukkan persiapan yang sangat murni dari masing-masing DNA dan RNA.
Kemurnian DNA didapatkan dengan Absorbance 280/260. Menurut Gallagher. (2004), penyerapan sampel diukur pada beberapa panjang gelombang yang berbeda untuk menilai kemurnian dan konsentrasi asam nukleat. Pengukuran kuantitatif untuk Absorban 260 relatif murni pada persiapan asam nukleat dalam jumlah mikrogram. Pembacaan absorbansi tidak bisa membedakan antara DNA dan RNA. Namun, rasio Absorban 260 nm dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian asam nukleat. Kontaminan pada 280 nm (misalnya protein) akan menurunkan rasio ini. Absorbansi pada 230 nm mencerminkan kontaminasi sampel oleh fenol atau urea, sedangkan absorbansi pada 325 nm menunjukkan kontaminasi oleh partikulat dan cuvettes kotor. Penghamburan cahaya pada 325 nm dapat diperbesar 5 kali lipat pada 260 nm.
Hasil Deteksi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3
Deteksi transgen dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui apakah transgen (PhGH) tersebut masih dapat terdektesi dan diwariskan dari induk transgenik F2 ke generasi F3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terdeteksi pada beberapa embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F3. Hasil penelitian yng sama dialporkan oleh Marnis dkk., (2013), bahwa transgen dapat terdeteksi pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F1, kemudian dilanjutkan dengan deteksi terhadap generasi F2, dimana transgen terdeteksi pada larva dan sirip ekor ikan lele dumbo transgenik F2 dengan persentase transmisi 8,11-50%. Hal ini mengindikasikan bahwa transgen masih stabil diturunkan hingga pada generasi F3.Kinoshita dkk., (2003) melaporkan bahwa transgen pada
ikan medaka transgenik diwariskan dengan stabil pada generasi F1 hingga generasi F4 sesuai dengan kaidah Mendel. Hasil penelitian yang sama juga dilaporkan oleh Martinez dkk., (1999), dimana hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen ditransmisikan pada generasi F1 hingga F4 dengan stabil sesuai kaidah Mendel.
Namun hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak semua embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik membawa transgen. Hal ini terjadi karena embrio dan larva dihasilkan dari induk ikan lele dumbo transgenik F2 yang bersifat heterozigot. Hal ini sesuai dengan hukum Mendel, dimana apabila suatu spesies dikawinkan antara sesama spesies dengan kromosom heterozigot, maka keturunan yang dihasilkan terdapat 25 % normal. Apabila perkawinan dilakukan antara spesies yang bersifat heterozigot dengan spesies normal, maka akan menghasilkan 50 % keturunan normal.
Analisis ekspresi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Ikan Lele Transgenik F3
Kualitas dan kuantitas genom RNA Embrio dan Larva Ikan Lele Dumbo Transgenik F3
Hasil penelitian menunjukkan ekstraksi RNA dari sampel embrio dan larva (pooling) berhasil dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi RNA (Tri Reagent Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA). Hal tersebut dilihat dari hasil cek genom melalui elektroforesis dimana semua genom muncul dan terdapat dua baris pita RNA dengan ukuran fragmen yang berbeda yaitu 18S rRNA dan 28S rRNA. Hal ini mengindikasikan bahwa total RNA hasil ekstraksi terintegrasi dengan baik dan mRNA tidak terdegradasi, karena band 28S rRNA dan 18S rRNA muncul dan menunjukkan kualitas yang bagus pada semua sampel.
Menurut Sambrook dan Russel. (2001) bahwa kualitas 28S rRNA dan 18S rRNA pada prokariota mencerminkan kualitas mRNA.
Kualitas genom RNA tersebut didukung oleh kuantitasnya yang diukur dengan Qubit fluorometri (invitrogen). Hasil pengukuran konsentrasi RNA menunjukkan bahwa semua sampel mempunyai kemurnian 1,8 – 2,0. Hal ini membuktikan bahwa kualitas semua genom RNA sampel bagus.
Hasil ekspresi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3
Analisis ekspresi transgen dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui apakah transgen (PCcBA-PhGH) pada ikan lele transgenik F3 terdeteksi dan terekspresi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terekspresi pada beberapa embrio dan larva. Hal tersebut diketahui melalui amplifikasi primer β -actin yang dibandingkan dengan hasil amplifikasi primer ACT107 dan PhGH2. Hasil penelitian yang sama juga dilaporkan oleh Marnis dkk., (2013 dan 2014), dimana transgen PhGH terekspresi pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F1 dan F2.
Amplifikasi melalui PCR menunjukkan bahwa penggunaan primer β-actin sebagai kontrol internal berfungsi dengan baik, dimana total RNA pada semua sampel muncul dengan ukuran fragmen 300 bp. Terekspresinya transgen pada generasi ikan transgenik dipengaruhi oleh promotor β-actin. Menurut Alimuddin dkk. (2008) promoter β-actin memiliki sifat yang dapat aktif pada semua jaringan/ sel otot. Liu dkk., (1990) menambahkan bahwa gen β-actin yang berasal dari ikan mas dikendalikan oleh beberapa unsur regulasi, dimana unsur promotor proksimal mengarahkan tingkat ekspresi yang cukup tinggi sehingga dapat digunakan dalam transfer gen pada ikan. Dewi dkk., (2013) menambahkan bahwa promoter β-actin
ikan mas mampu mengendalikan ekspresi gen PhGH pada ikan lele dan telah terjadi over ekspresi gen PhGH yang berpotensi meningkatkan pertumbuhan ikan lele dumbo transgenik hingga hampir dua kali lipat dari ikan lele non-transgenik.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen (PhGH) terekspresi pada beberapa keturunan ikan lele transgenik F3. Hal yang sama didapatkan dalam penelitian Huang dkk., (2005), dimana transgen (GFP) dapat terekspresi pada generasi F3 ikan zebra transgenik (Danio rerio). Hal ini mengindikasikan bahwa transgen masih stabil ditransmisikan hingga pada generasi ikan lele transgenik F3.
Namun hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen hanya dapat terekspresi pada beberapa sampel embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F3. Hal ini terjadi karena sifat heterozigot dari induk ikan lele transgenik F2, dimana kemungkinan beberapa keturunan yang dihasilkan tidak membawa transgen pada jaringan tubuhnya seperti yang telah dijelaskan pada hasil deteksi transgen, dengan demikian transgen juga kemungkinan tidak terekspresi.
Marnis dkk., (2013) menambahkan bahwa meskipun transgen dapat terintegrasi ke dalam semua jaringan tubuh ikan target, namun transgen tersebut kemungkinan tidak terekspresi di seluruh jaringan tubuh ikan. Berdasarkan hal tersebut maka besar kemungkinan bahwa transgen bisa saja terdeteksi dalam seluruh jaringan dan organ tubuh ikan, namun transgen tersebut belum tentu terekspresi pada jaringan atau organ tubuh ikan target. Sehingga dengan demikian ada juga kemungkinan bahwa transgen berhasil diturunkan pada generasi F3 namun tidak terekspresi pada jaringan tubuhnya.