Telur ayam kampung yang diujikan merupakan telur yang berasal dari ayam kampung yang dipelihara secara ekstensif. Telur–telur tersebut berasal dari lima daerah, yaitu Cibanteng, Ciampea, Cijahe, Gang Menteng dan Pabuaran (Tabel 4).
Tabel 4 Asal Telur
No Daerah Telur ∑ Telur
1 Cibanteng A 4 butir 2 Ciampea B 4 butir 3 Cijahe C 4 butir 4 Gang Menteng D 4 butir
5 Pabuaran E 4 butir
Seluruh telur ayam kampung tersebut dipurifikasi dengan metode sederhana dan Water Soluble Fraction (WSF) untuk mendeteksi keberadaan IgY spesifik E. coli dan Salmonella sp. serta di hitung konsentrasi IgY dengan spektrofotometer.
4. 1 Deteksi Keberadaan IgY Spesifik E. coli pada Telur Ayam Kampung Seluruh telur ayam kampung dari lima daerah tersebut menunjukkan hasil positif pada uji Agar Gel Precipation Test (AGPT). Hasil positif pada uji AGPT berarti telur ayam kampung yang dikoleksi tersebut mengandung Ab spesifik terhadap E. coli. Hasil AGPT kuning telur ditunjukkan pada Tabel 5 dan Gambar 5.
Pada uji AGPT dengan ekstraksi sederhana dan WSF sama-sama menghasilkan reaksi positif. Reaksi positif dari uji AGPT menunjukan adanya antibodi dalam kuning telur. Reaksi positif tersebut ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi diantara dua sumur yang berisi antigen dan antibodi. Hal ini terjadi karena antigen dan antibodi yang berdifusi akan bertemu dan membentuk antigen antibodi komplek dimana satu molekul antibodi berikatan silang dengan
dua determinan antigen dalam satu waktu dan akan membentuk endapan ikatan komplek antigen antibodi. Faktor-faktor yang mempengaruhi terbentuknya antibodi diantaranya adalah umur hewan yang digunakan, ukuran molekul antigen, kerumitan struktur kimiawi antigen, konstitusi genetik, metode pemasukan antigen dan dosis antigen yang digunakan (Mustopa 2004).
Tabel 5 Hasil Uji AGPT terhadap E. coli
No Daerah Kode telur
Hasil uji AGPT kuning telur di ekstraksi sederhana Hasil uji AGPT WSF 1 Cibanteng A + + 2 Ciampea B + + 3 Cijahe C + + 4 Gang Menteng D + + 5 Pabuaran E + + a b b b P P P
Gambar 5 Reaksi positif dari uji AGPT, (P) garis presipitasi, (a) antigen
Escherichia coli, (b) antibodi IgY ekstraksi sederhana.
Dengan munculnya garis presipitasi maka berarti bahwa ayam kampung tersebut pernah terpapar oleh E. coli. Ayam kampung terpapar oleh E. coli dapat terjadi karena lingkungan yang tidak bersih, sehingga E. coli masuk ke dalam
tubuh kemudian terjadi reaksi kekebalan. Mengingat bahwa ayam kampung dipelihara secara ekstensif maka kemungkinan terpapar oleh bakteri sangat besar.
4. 2 Deteksi Keberadaan IgY Spesifik Salmonella sp. pada Telur Ayam Kampung
Seluruh telur ayam kampung dari lima daerah tersebut menunjukkan hasil positif pada uji Agar Gel Precipation Test (AGPT). Hasil positif pada uji AGPT berarti telur ayam kampung yang dikoleksi tersebut mengandung Ab spesifik terhadap Salmonella sp.. Hasil AGPT kuning telur ditunjukkan pada Tabel 6 dan Gambar 6.
Tabel 6 Hasil Uji AGPT terhadap Salmonella sp.
No Daerah Kode telur
Hasil uji AGPT kuning telur di ekstraksi sederhana Hasil uji AGPT WSF 1 Cibanteng A + + 2 Ciampea B + + 3 Cijahe C + + 4 Gang Menteng D + + 5 Pabuaran E + +
Pada uji AGPT terhadap Salmonella sp. juga dihasilkan reaksi postif. Ayam kampung yang diambil telurnya untuk penelitian ini, pernah terpapar oleh
Salmonella sp.. Ayam kampung terpapar oleh Salmonella sp. dapat terjadi karena lingkungan yang tidak bersih, sehingga Salmonella sp. masuk ke dalam tubuh kemudian terjadi reaksi kekebalan. Kekebalan tersebut menurun ke anak ayam yang akan ditetaskan. Mengingat bahwa ayam kampung dipelihara secara ekstensif maka kemungkinan terpapar oleh bakteri sangat besar. Burgess (1995) menyatakan bahwa ayam yang telah terpapar oleh antigen lain menyebabkan dalam kuning telur terdapat juga antibodi terhadap antigen lain tersebut. Pada unggas imunoglobulin Y ditransferkan ke dalam folikuler epithelium ovary dan terakumulasi pada kuning telur selama oogenesis memberikan kekebalan maternal
bagi anak-anak ayam yang ditetaskan (Loeken dan Roth 1983). Selain pada kuning telur, IgY juga didapatkan pada duodenum, trakhea dan seminal plasma (Carlender 2002). a b b b P P P
Gambar 6 Reaksi positif dari uji AGPT, (P) garis presipitasi, (a) antigen
Salmonella sp., (b) antibodi IgY ekstraksi sederhana.
4. 3 Penentuan Konsentrasi IgY pada Telur Ayam Kampung
Jumlah IgY yang ada pada telur ayam kampung ditunjukkan pada Tabel 7. Ekstraksi IgY di lakukan dengan metode WSF untuk mendapatkan IgY dalam jumlah yang lebih besar. Menurut Shin et al. (2002) ekstraksi IgY dengan WSF akan menghasilkan 9.9 mg lebih besar dibandingkan hasil yang diperoleh Akita et al. (1992) sebesar 93-96% IgY. Poly ethylene glycol (PEG) 6.000 digunakan untuk memisahkan lemak, sedangkan ammonium sulfat digunakan untuk memisahkan protein, metode ini juga dikenal dengan metode salting-out (Anonim 2005, 2007e). Metode salting-out ini memisahkan protein dalam konsentrasi garam yang tinggi, yang kemudian dapat dilakukan dialisis untuk menghilangkan garam tersebut (Anonim 2007f).
Ekstrak IgY yang dihasilkan mempunyai rata-rata konsentrasi 3.225 mg/ml. Dalam laporan penelitian European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) bahwa jumlah antibodi unggas adalah 50-100 mg dalam satu butir telur (Schade et al. 2004). Zhang (2003) menyebutkan bahwa dalam sebutir telur ayam mengandung 100-150 mg IgY. Nilai perolehan yang rendah sampai tahap pengendapan amonium sulfat dialami pula oleh Peek et al.
(1992) sebesar 30% dan Wahyuntari et al. (2000) sebesar 28.9%. Triwijayanti (2001) menunjukkan hasil yang lebih besar yaitu 5.37 mg/ml. Namun hasil purifikasi yang dilakukan oleh Carlender (2002) dengan metode yang sama menunjukkan total IgY yang lebih rendah, yaitu 2.21 mg/ml. Metode purifikasi dengan Hidroxy Propylmethyl Celullose Pthalate (HPMCP) yang dilakukan Yokohama et al. (1993) menghasilkan konsentrasi total IgY 48.5%. Pada hasil purifikasi dengan metode Eggstract IgY yang dilakukan oleh Ester (2004) didapat konsentrasi berkisar antara 0.25-1.8 mg/ml.
Tabel 7 Hasil Konsentrasi IgY
No Daerah Sampel Konsentrasi 1 Cibanteng A 1.50 mg/ml 2 Ciampea B 4.21 mg/ml
3 Cijahe C -
4 Gang Menteng D 3.33 mg/ml 5 Pabuaran E 3.86 mg/ml
Rata-rata konsentrasi IgY 3.225 mg/ml
Rendahnya konsentrasi IgY yang diperoleh dapat terjadi karena beberapa
faktor, misalnya IgY hilang pada proses pencucian, tertinggal dalam tabung dan atau alat-alat lain. Sehingga untuk mendapatkan konsentrasi yang tinggi, diperlukan ketelitian dalam purifikasi. Namun begitu hasil konsentrasi yang diperoleh lebih tinggi dibandingkan dengan metode Eggstract IgY yang dilakukan oleh Ester. Akan tetapi metode Eggstract IgY ini memerlukan biaya yang cukup besar karena Eggstract IgY berupa kit dan setiap kit hanya dapat dipakai lima kali.
Beberapa penelitian telah dilakukan dan dilaporkan bahwa antibodi yang dihasilkan oleh telur akibat pemaparan antigen ke dalam tubuh induk memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap antigen yang telah disuntikkan (Kool 2001).