Uji serologi dengan sampel serum sapi perah menunjukkan hasil 8 positif terhadap paratuberkulosis, yaitu 2 dari Kabupaten Bandung dan 6 dari Kabupaten Banyumas. Sedangkan 176 sampel yang lain menunjukkan hasil negatif. Uji ini menggunakan ruminants serum paratuberculosis confirmation kit (LSI, Perancis), jika nilai % E/P sama dengan atau diatas 40 menunjukkan hasil positif terhadap paratuberkulosis, sedangkan nilai % E/P dibawah 40 adalah negatif. Hasil kultur dari sampel feses dengan HEYM yang ditambah mycobactin J setelah diinkubasikan selama 24 minggu menunjukkan hasil 2 positif M. paratuberculosis setelah dikonfirmasi dengan uji PCR, yaitu 1 dari Kabupaten Bandung dan 1 dari Kabupaten Banyumas. Sedangkan uji PCR dengan sampel feses menunjukkan hasil negatif. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil uji serologi, kultur dan PCR terhadap paratuberkulosis Metode uji
PCR Feses PCR Isolat
ELISA Kultur
IS900 F57 IS900 F57
Asal sampel Jumlah
sampel + - + - + - + - + - + - Pangalengan 66 1 65 0 66 0 66 0 66 0 66 0 66 Kab. Bandung Lembang 100 1 99 1* 99 0 100 0 100 1 99 1 99 Kab. Banyumas Baturaden 18 6 12 1* 17 0 18 0 18 1 17 1 17 Total 184 8 176 2 182 0 184 0 184 2 182 2 182
*) kultur positif ini hasil dari sampel yang ELISAnya positif, yaitu dari Kabupaten Bandung dengan angka positif + dan Kabupaten Banyumas dengan angka positif ++
Ada beberapa tahapan dalam perkembangan infeksi M. paratuberculosis pada sapi perah, yaitu bahwa infeksi awal pada sapi muda akan ditandai dengan dapat dideteksinya gama interferon. Hal ini terjadi karena bakteri yang masuk akan
21
difagositosis oleh makrofag, dan mengalami multiplikasi didalamnya. Limfosit akan mengeluarkan zat kimia yang dinamakan sitokin untuk menarik makrofag lebih banyak lagi ke tempat infeksi untuk meningkatkan daya fagositosisnya. Makrofag – makrofag ini selanjutnya akan berfusi menjadi giant cell untuk meningkatkan daya bunuh terhadap mycobacteria (Collins 2003; Wu et al. 2007).
Pada tahap pertengahan infeksi, ditandai dengan banyaknya infiltrasi limfosit dan makrofag ke jaringan yang terinfeksi sehingga menyebabkan terjadinya penebalan dari usus, terutama ileum dan juga terjadi dilatasi dari pembuluh limfe. Pembuluh inilah yang akan mengalirkan M. paratuberculosis ke limfo nodus, dimana hanya di Peyer’s patches inilah bakteri tidak dapat dirusak oleh makrofag dan melakukan multiplikasi di limfo nodus. Karena itu, perubahan patologi yang paling banyak terjadi hanya di saluran usus (terutama ileum – sekum) dan limfo nodus lokal (Buergelt et al. 2000; Collins 2003).
Tahap akhir dari perkembangan penyakit ditandai dengan mulai meningkatnya antibodi, tetapi antibodi ini tidak mampu mencegah multiplikasi dari bakteri ini. Perubahan patologi pada usus dengan adanya radang granuloma akan menyebabkan
terjadinya diare, malabsorbsi protein dan hewan akan mengalami kekurusan.
M. paratuberculosis akan banyak tersebar di ileum dan limfo nodus lokal, karena itu bakteri ini dapat diisolasi dari limpa, hati, glandula mamaria dan juga uterus. Pada fase ini antibodi akan tinggi, jumlah bakteri yang dikeluarkan melalui feses juga banyak, tetapi respon dari gama interferon akan sangat sedikit bahkan tidak ada. Dapat dideteksinya antibodi dengan titer tinggi dan banyaknya bakteri dalam feses sebagai
indikator bahwa fase penyakit sudah memasuki tahap klinis (Collins 2003; Waters et al. 2003).
Uji serologi untuk paratuberkulosis menurut OIE (2004) antara lain : ELISA,
complement fixation test (CFT) , agar gel immunodifussion (AGID). ELISA mempunyai tingkat sensitivitas dan spesifitas yang lebih baik jika dibandingkan dengan kedua metode tersebut, yaitu 31 – 88 % dan 91 – 97 % (Collins et al. 2006; Roussel et al. 2007), tetapi pada kasus subklinis sensitivitasnya hanya 15 % (Stabel et al. 2002). Umumnya antigen yang digunakan untuk coating adalah
22
protoplasmik, ekstraks seluler ataupun lipoarabimanan (LPA), dan penggunaan antigen – antigen tersebut masih sering menimbulkan reaksi silang dengan infeksi mycobacteria lain sehingga untuk meningkatkan spesifitasnya biasanya serum diabsorbsi terlebih dahulu menggunakan M. phlei (Ferreira et al. 2002; Cho & Collins 2006), dan akhir – akhir ini telah dikembangkan ELISA dengan antigen yang lebih spesifik seperti MP-34kd-C ataupun culture filtrate, penggunaan kedua antigen ini dilaporkan dapat meningkatkan sensitivitas dan spesivitas uji (Cho & Collins 2006; Malamo et al. 2006). Metode uji ini sering digunakan dan direkomendasikan untuk program screening dan kontrol paratuberkulosis karena biaya lebih murah dan relatif lebih cepat dibandingkan dengan kultur maupun PCR, tetapi untuk kasus subklinis dan pada fase awal sekali kejadian penyakit, teknik ELISA ini kurang sensitif, disamping itu juga masih sering terjadi reaksi silang dengan Mycobacterium avium complex dan menghasilkan positif palsu. Pada kasus klinis dan adanya pengeluaran bakteri yang cukup banyak di dalam fesesnya, metode ini mempunyai tingkat sensitivitas dan spesifitas yang tinggi (Mc Kenna et al. 2005; Malamo et al. 2006; Waters et al. 2003). Untuk menentukan status infeksi suatu peternakan, bisanya uji serologi dengan ELISA diikuti dengan uji lain yaitu Fecal Culture dan PCR (Collins et al. 2006).
Data di atas memperlihatkan bahwa dari 8 sampel yang positif secara serologi dan hanya 2 isolat yang positif M. paratuberculosis. Isolat tersebut berasal dari sampel yang serologinya positif + (% E/P 41) dan positif ++ (% E/P 283). Hal ini karena respon imun humoral (antibodi) terhadap paratuberkulosis dapat dideteksi 6 bulan pasca infeksi
tanpa diikuti dengan adanya bakteri yang dikeluarkan melalui feses (Waters et al. 2003), disamping itu mungkin juga karena jumlah bakteri yang
dikeluarkan melalui feses belum cukup banyak, sehingga hasil isolasinya negatif (Collins et al. 2006). Hal lain karena kejadian penyakit paratuberkulosis terbagi dalam 3 tahap, yaitu preklinis tanpa shedding bakteri melalui feses, preklinis dengan shedding
dan klinis dengan shedding, dalam kasus ini mungkin respon imun humoral sudah dapat dideteksi pada kasus preklinis tanpa shedding ataupun preklinis dengan shedding,
karena itu kemungkinan hanya 2 sampel di atas yang mengandung M. paratuberculosis
23
semakin tinggi seiring dengan tingkat keparahan penyakit terutama pada kasus klinis yang diikuti dengan pengeluaran bakteri melalui feses dalam jumlah yang banyak (Carpenter et al. 2004). Hubungan antara respon imun humoral dengan shedding bakteri dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil positif secara ELISA mungkin juga karena adanya reaksi silang dengan infeksi M. avium dan M. intraseluler sehingga menimbulkan positif palsu (Osterstock et al. 2007). Uji serologi dalam penelitian ini menunjukkan bahwa sensitivitas ELISA terhadap kultur 25 % dengan tingkat spesifitas 96,8 %. Uji serologi dengan ELISA dapat digunakan untuk screening awal terhadap infeksi paratuberculsosis pada sapi perah, tetapi untuk penentuan status infeksi pada kelompok ternak perlu tambahan uji berupa kultur dan PCR untuk konfirmasi.
Gambar 2. Respon imun humoral dan shedding bakteri (Kurade et al. 2004)
Isolasi dan identifikasi bakteri penyebab penyakit dengan metode kultur masih merupakan gold standard uji. Metode kultur yang konvensional dengan menggunakan media padat (HEYM dengan mycobactinJ ) memerlukan waktu yang relatif lebih lama, yaitu antara 12 – 24 minggu, tetapi dengan media ini morfologi koloni dapat diamati
dan masih merupakan acuan dari beberapa teknik kultur lain (OIE 2004; Ristow et al. 2006). Sedangkan teknik kultur yang lain yaitu menggunakan media cair
24
M. tuberculosis, yaitu (1) Bactec system (Radiometric) , metode ini memerlukan waktu tumbuh yang lebih singkat, yaitu 8 – 16 minggu, tetapi cara ini memerlukan biaya yang cukup tinggi, alat untuk membaca, penanganan radioisotop, tingkat kontaminasi tinggi
jika sampel langsung dari feses dan tidak dapat melihat morfologi koloni (Whittington et al. 1998; Collins & Manning 2004; Shin et al. 2007) dan (2) Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT), metode ini lebih murah, lebih cepat,
lebih akurat dan lebih sensitif dibandingkan dengan Bactec system, tetapi cara ini juga mempunyai tingkat kontaminasi yang tinggi, harus memerlukan alat untuk inkubasi dan
pembacaan hasil serta tidak dapat melihat morfologi kultur secara langsung (Shin et al. 2007). Untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh adalah
M. paratuberculosis, maka memerlukan uji konfirmasi berupa sifat ketergantungan terhadap mycobactin dan deteksi material genetiknya dengan PCR (Shin et al. 2004). Kultur memerlukan waktu yang lebih lama dan mahal jika dibandingkan dengan ELISA dan PCR, tetapi cara ini direkomendasikan untuk penentuan status infeksi suatu peternakan dan program eradikasi (Collins et al. 2006)
Hasil kultur dari sampel feses memperlihatkan adanya beberapa bakteri tahan asam yang tumbuh pada media HEYM dengan mycobactin J (12 isolat) , tetapi setelah dikonfirmasi dengan PCR hanya 2 isolat yang positif M. paratuberculosis, yaitu 1 isolat berasal dari sapi perah di daerah Lembang dengan umur 3,5 tahun dan kondisi berat badan yang relatif kurus, sedangkan isolat yang lain berasal dari sapi perah di daerah Baturaden dengan umur 4 tahun dan kondisi berat badan yang cukup baik . Inkubasi dari dua isolat tersebut memerlukan waktu yang sangat lama yaitu masing – masing
19 minggu (isolat Baturaden) dan 22 minggu (isolat Lembang). Isolat
M. paratuberculosis yang tumbuh dan gambaran mikroskopik acid fast bacteria (AFB) dapat dilihat pada Gambar 3 dan Gambar 4.
25
Gambar 3. Morfologi isolat M. paratuberculosis pada HEYM
dengan mycobactin J. Sebelah kiri merupakan isolat acuan (A6/Jerman) dan sebelah kanan isolat dari sampel (MAP/BTR 53/08)
Gambar 4. Mikroskopik M. paratuberculosis isolat sampel dengan pewarnaan Ziehl – Neelsen (warna merah)
26
Shedding bakteri melalui feses pada kasus paratuberculosis terbagi dalam 3 kategori, yaitu : low shedder ( kurang dari 3 x 102 cfu/g), moderate shedder (3 x 102- 3 x 103 cfu/g) dan high shedder (lebih dari 3 x 103 cfu/g) (Stabel et al. 2002). Pada kejadian klinis bakteri M. paratuberculosis yang dikeluarkan
melalui feses mencapai 106 – 108 cfu/g (Wu et al. 2007). Data hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa mycobateria yang ada di lingkungan terutama dalam feses dapat
tumbuh pada media HEYM, sehingga ini mungkin dapat menggangu pertumbuhan
M. paratuberculsosis yang waktu inkubasinya sangat lama (lebih lama daripada jenis mycobacteria lain) (Roussel et al. 2007), disamping itu juga ada kontaminasi dari jamur ataupun bakteri lain yang ada di feses sehingga sangat menganggu dan berpengaruh pada kemampuan tumbuhnya (Ristow et al. 2006). Hal lain mungkin karena pada beberapa kasus terutama awal kejadian penyakit ataupun kasus subklinis, shedding
bakteri melalui feses sering tidak teratur dengan jumlah bakteri yang sangat sedikit serta prosesing sampel yang bertahap, ini mungkin menyebabkan bakteri akan kehilangan kemampuan tumbuhnya (Stabel et al. 2002). Terjadinya kontaminasi dan penurunan viabilitas bakteri yang dapat tumbuh pada HEYM dengan mycobactin J sangat tergantung pada proses sampling, penyimpanan, prosesing sampel serta metode kultur yang digunakan, karena dilaporkan metode kultur dengan HEYM mempunyai sensitivitas 60 % dengan spesifitas 99,5 % dan jumlah bakteri yang terdapat dalam feses minimal harus mengandung 10 cfu/g (Ristow et al. 2006; Collins et al. 2006).
Metode diagnosis dengan PCR pada umumnya berdasarkan urutan basa yang ada pada insertion squence dari M. paratuberculsosis, sehingga primers yang umum digunakan adalah IS900, tetapi beberapa peneliti melaporkan masih ada reaksi silang dengan Mycobacterium avium complex, karena itu ada beberapa primers yang dikembangkan berdasarkan sequence yang ada pada IS900 untuk mengeliminasi adanya reaksi silang dengan mycobacteria lain. Pada penelitian ini menggunakan primers
IS900 dengan urutan basa yang berbeda (TJ1-TJ2), karena uji dengan menggunakan
primers ini dilaporkan tidak menunjukkan reaksi silang dengan Mycobacterium avium complex (Bull et al. 2003), dan juga menggunakan primers F57 untuk memastikan hasil yang didapat dengan primers sebelumnya. Primers F57 dilaporkan mempunyai
27
spesifitas dan sensitifitas yang tinggi, karena mampu mendeteksi sampai 1 cfu (Vansnick et al. 2004), sehingga PCR dengan dua primers ini sangat direkomendasikan untuk meningkatkan validitas uji. Teknik ini dapat langsung digunakan untuk sampel
feses ataupun susu dan cukup baik untuk konfirmasi terhadap kultur (Wells et al. 2006; Collins et al. 2006). Hasil PCR dari sampel feses baik menggunakan
primers IS900 atupun F57 semuanya menunjukkan hasil negatif. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 5 dan Gambar 6.
Gambar 5. Hasil PCR IS900 (TJ1-TJ2) sampel feses, pada kolom 1 – 22 adalah sampel, kontrol positif pada kolom 24 dan 25 (M. paratuberculois A6/German dan ATCC 19698), sedangkan kontrol negatif pada kolom 23 dan 26 (M. avium B6/German dan TE buffer).
28
Gambar 6. Hasil PCR F57 sampel feses, pada kolom 1 – 22 adalah sampel, kontrol positif pada kolom 24 dan 25 (M. paratuberculois A6/German dan ATCC 19698), sedangkan kontrol negatif pada kolom 23 dan 26 (M. avium B6/German dan TE buffer).
Hasil PCR feses semuanya negatif, tetapi dari hasil kultur ada 2 yang positif
paratuberculosis, ini karena kemampuan metode ini untuk mendeteksi
M. paratuberculsosis dalam feses sangat terbatas, yaitu hanya mampu mendeteksi kandungan bakteri dalam feses minimal 102 cfu/g (Stabel & Bannantie 2005). Disamping itu ekstraksi DNA dari sampel feses sangat sulit karena banyaknya material
feses, sehingga terkadang bakteri tidak bisa keluar dari material tersebut. Selain itu,
M. paratuberculosis mempunyai struktur dinding yang kompleks, dan mengandung zat lilin yang tebal sehingga sangat sulit untuk dilysiskan. Hal ini dapat menyebabkan konsentrasi DNA yang didapat kemungkinan juga rendah dan akan mempengaruhi dalam hasil PCR (Amita et al. 2002)
29
Hasil PCR konvensional dengan primers IS900 memperlihatkan adanya pita DNA pada kolom 5 (isolat Lembang) dan 6 (isolat Baturaden) merupakan isolat yang tumbuh pada HEYM dengan mycobactin J, sedangkan pada kolom 14 dan 15 merupakan kontrol positif (M. paratuberculosis A6/German dan ATCC 19698) serta kontrol negatif pada kolom 13 dan 16 (M. avium B6/German dan TE buffer). Amplifikasi dengan primers F57 juga memperlihatkan adanya pita DNA pada kolom 5 (isolat Baturaden) dan 7 (isolat Lembang) yang merupakan isolat yang sama dengan yang diuji dengan primers IS900, sedangkan kontrol positif pada kolom 14 dan 15 dan kontrol negatif pada kolom 13 dan 16. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 7 dan Gambar 8.
Gambar 7. Hasil PCR IS900, pada kolom 5 (isolat Lembang) dan 6 (isolat Baturaden) terlihat adanya pita DNA, sedangkan pada kolom 14 dan 15 kontrol positif serta kolom 13 dan 16 kontrol negatif.
30
Gambar 8. Hasil PCR F57, pada kolom 5 (isolat Baturaden) dan 7 (isolat Lembang) terlihat adanya pita DNA, sedangkan pada kolom 14 dan 15 kontrol positif serta kolom 13 dan 16 kontrol negatif.
Berdasarkan data hasil PCR terhadap isolat yang tumbuh pada media HEYM terlihat bahwa metode ini untuk konfirmasi isolat yang tumbuh cukup bagus dan akurat. Hal ini sesuai yang dilaporkan oleh Shin et al. (2004) bahwa PCR dapat digunakan dan cukup bagus untuk uji konfirmasi terhadap kultur dan dapat mendeteksi bakteri kurang dari 20 cfu untuk primers IS900 (Taddei et al. 2004) serta dapat mendeteksi 1 cfu untuk F57 (Vansnick et al. 2004). Hasil ini juga tidak menunjukkan adanya reaksi silang dengan M. avium karena tidak adanya pita DNA pada kolom kontrol negatif.
Penelitian ini memberikan gambaran bahwa telah terjadi infeksi
M. paratuberculosis pada sapi perah di Kabupaten Bandung dan Banyumas. Prevalensi penyakit tersebut berkisar 2%, karena dari 184 sampel yang diambil ada 2 yang positif paratuberkulosis. Hal ini sesuai dengan asumsi waktu pengambilan sampel, yaitu prevalensi 2 % akan terpenuhi jika dari jumlah sampel tersebut minimal ada 1 yang menunjukkan positif paratuberkulosis.
31
Adanya program pengembangan sapi perah untuk meningkatkan produksi susu nasional, maka kasus infeksi paratuberkulosis sangat perlu diperhatikan. Mengingat sifat penyakit ini kejadiannya kronis dan dapat mengakibatkan kerugian ekonomi serta sangat susah dalam pengendaliannya.
32