Hasil
Sampel udang vaname (L.vannamei) diperoleh dari tambak udang di kabupaten Pesawaran (Lampung Selatan). Sampel udang vaname diambil dari petak tambak yang sama, dengan status klinis yang berbeda. Sampel berukuran 16-17 gram/ekor dengan gejala klinis dan sub klinis infeksi myonecrosis (Gambar 13). Udang dengan gejala klinis terinfeksi myonecrosis ditandai dengan hilangnya transparansi jaringan otot udang menjadi berwana keputihan (nekrosis), khususnya pada ruas abdominal ke-6, gerakan lemah, kecenderungan berenang di tepi tambak. Udang vaname sub klinis tidak menunjukkan gejala infeksi myonecrosis dengan transparasi jaringan otot terlihat jelas, respon terhadap pakan masih baik dan gerakan udang yang terlihat aktif.
Gambar 13 Udang vaname (L.vannamei). (a) Udang vaname kondisi normal; (b) Nekrosis pada ruas abdominal ke-6(gejala klinis infeksi myonecrosis)
Deteksi fragmen gen ORF1 IMNV
Hasil pengujian sampel udang vaname dari Situbondo dengan nested RT-PCR (OIE, 2010) menunjukkan beberapa sampel udang vaname tersebut positif IMNV. Selanjutnya sampel udang positif IMNV digunakan sebagai salinan dalam seleksi fragmen gen ORF1 IMNV. Produk PCR yang dihasilkan pada first step RT-PCR dengan primer 4587F-4914R adalah 328 bp, dan produk PCR dengan primer nested PCR IMNV 4725F-4863R adalah sebesar 139 bp (Gambar 14). Ekstrak RNA positif IMNV berdasar pengujian dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010) digunakan dalam seleksi fragmen gen ORF1 IMNV. Produk PCR hasil amplifikasi dengan kedua pasang primer fragmen gen ORF1 tersebut digunakan untuk keperluan sekuensing dan kloning. Seleksi fragmen dimulai dengan merubah RNA sampel udang positif IMNV menjadi cDNA melalui reaksi transkripsi balik (reverse transcription) menggunakan kit Impron-II RT System (PromegaTM). Menggunakan primer tunggal 218F sebagai primer spesifik IMNV, cDNA hasil transkripsi balik RNA positif IMNV digunakan sebagai tuntuk mengamplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV. Amplifikasi untuk deteksi fragmen gen ORF1 IMNV pada urutan basa nukleotida 218-682 menggunakan dua pasang primer kombinasi 218F-545R yang menghasilkan produk PCR 327 bp, dan primer 412F-682R yang menghasilkan produk PCR 270 bp (Andrade et al., 2007).
29
Gambar 14 Gel elektroforesis nested RT-PCR IMNV (OIE,2010). (A) first step RT-PCR IMNV: M(marker 100 bp), line1-4 (328 bp); (B)nested PCR IMNV: M(marker 100bp) line 1-4 (139 bp) Produk PCR fragmen IMNV sebesar 327 bp dan 270 bp (Gambar 15), yang dihasilkan dari kombinasi kedua primer tersebut selanjutnya dipurifikasi menggunakan purifikasi ethanol absolut, dan diukur konsentrasinya dengan GenQuant spectrofotometer. Pengukuran konsentrasi DNA ini bertujuan untuk menentukan rasio antara sisipan (insert) dan vektor plasmid pada saat pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV). Hasil pengukuran konsentrasi purifikasi DNA adalah 125,3 ng/µl, konsentrasi produk PCR ini cukup tinggi dan mencukupi sebagai insert ligasi. Rasio antara vektor dan insert dalam kloning ini adalah 1:5 dengan konsentrasi vektor 50 ng/µl, panjang insert 327 bp, dan panjang vektor 3851 bp maka hanya diperlukan sekitar 21,22 ng/µl.
Gambar 15 Gel elektroforesis produk PCR fragmen gen ORF1 IMNV urutan nukleotida 218-682. M (marker 100 bp), line 2-3 (327 bp), line 4-5 (270 bp)
Sekuensing fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang Situbondo dan Lampung bertujuan untuk melihat kemiripan dari kedua isolat tersebut. Hasil sekuensing diharapkan dapat memberikan informasi seberapa banyak perubahan basa fragmen gen ORF1 IMNV isolat Lampung dan Situbondo dengan IMNV GenBank accesion no.EF061744 dan acc. no.AY570982. Perubahan basa pada nukleotida dapat mempengaruhi ketepatan primer dalam mengamplifikasi gen target. Fragmen fragmen gen ORF1 IMNV sepanjang 327 bp dan 270 bp adalah produk PCR yang menjadi kandidat kontrol positif. Berada pada urutan nukleotida 218-682 fragmen gen ORF1 IMNV, produk PCR ini akan digunakan sebagai gen
30
sisipan pada pembuatan kontrol positif IMNV untuk real time RT-PCR IMNV TaqMan probe dan qRT-PCR IMNV SYBR green (Andrade et al., 2007; de Silva et al., 2011).
Sekuensing isolat lapang Situbondo dan Lampung
Hasil sekuensing fragmen gen ORF1 IMNV isolat Situbondo dan isolat Lampung dianalisa menggunakan software BioEdit (fasta file). Analisa sekuensing produk PCR 327 bp dan 270 bp fragmen gen ORF1 IMNV digabungkan membentuk panjang sekuen 460 bp. Hasil pensejajaran (pairwaise allingment) antara isolat Situbondo dan isolat Lampung dengan sekuen genom IMNV isolat Indonesia dan Brazil disajikan pada Gambar 14.
Gambar 16 Multiple Pairwaise alignment fragmen gen ORF1 IMNVisolat lapang Situbondo dan Lampung dengan IMNV Genbank acc.no.EF061744 dan acc. no.AY570982. Primer 218F-682R ( ); primer 412F-545R ( ); primer probe ( )
31 Analisa hasil sekuensing pada produk PCR 327 bp dan 270 menggunakan menunjukkan bahwa sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang dari Situbondo dan Lampung 99% sama dengan genom Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus (IMNV) isolat Indonesia GenBank accession no. EF061744 dan IMNV isolat Brazil GenBank accession no.AY570982 (Gambar 16). Hasil pensejajaran (pairwaise alignment) total basa nukleotida 460 fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang Situbondo dan Lampung menunjukkan terdapat beberapa basa yang berbeda. Pensejajaran sekuen kedua isolat dengan sekuen genom IMNV yaitu isolat IMNV Indonesia (GenBank accession no. EF061744) dan isolat IMNV Brazil (accession no.AY570982) menunjukkan terdapat lima basa yang berbeda pada sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat Situbondo. Pada sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat Lampung terdapat perbedaan dua basa nukleotida dengan sekuen isolat Situbondo dan kedua sekuen genom IMNV isolat Indonesia dan Brazil.
Limit deteksi (LOD) qRT-PCR IQ RealTM, qRT-PCR IMNV TaqMan probe,
dan nested RT-PCR IMNV
Limit deteksi (Limit of Detection/ LOD) qRT-PCR kit IQ-RealTM Quantititave System (Farming Intelligene) adalah satuan konsentrasi terendah yang dapat dideteksi dengan reagen tersebut. Untuk mendapatkan limit deteksi, dilakukan serial pengenceran kontrol positif IMNV kit IQ-RealTM
. Kontrol positif yang tersedia dalam kit tersebut memiliki konsentrasi 106 salinan/ µl. Serial pengenceran kontrol positif IMNV dimulai dari konsentrasi 105, 104, 103, 102, dan 101salinan/µl. Keseluruhan konsentrasi pengenceran tersebut diamplifikasi dengan qRT-PCR IQ-Real, hasil amplifikasi menunjukkan perbandingan nilai Ct dengan jumlah siklus. Kurva yang berbentuk sigmoid menandakan primer mampu mengamplifikasi kontrol positif IMNV. Konsentrasi salinan virus yang tinggi akan menaikkan kurva lebih cepat pada siklus amplifikasi awal. Dengan kata lain konsentrasi salinan berbanding terbalik dengan nilai Ct. Kurva yang terbentuk menjadi standar kurva setelah dianalisis dengan software RotorGene Q series (Gambar 17) dan Tabel 6.
Gambar 17 Limit deteksi (LOD) qRT-PCR IMNV IQ Real (Farming Intelligene); (a) Standar kurva nilai curve threshold (Ct); (b) Nilai konsentrasi salinan dan nilai Ct
32
Tabel 5 Konsentrasi salinan virus berdasar nilai Ct qRT-PCR IQ RealTM IMNV
No Warna Nama Ct Given Conc
(Salinan) Calc Conc (Salinan) 1 Standar IMNV 10^6 22,23 1.000.000,0 826.551,2 2 Standar IMNV 10^5 24,95 100.000,0 121.329,6 3 Standar IMNV 10^4 28,44 10.000,0 10.260,2 4 Standar IMNV 10^3 31,51 1.000,0 1.167,6 5 Standar IMNV 10^2 35,28 100,0 81,2 6 Standar IMNV 10^1 38,21 10,0 10,2 7 NTC
Limit deteksi qRT-PCR IMNV TaqMan probe adalah nilai konsentrasi terendah dari sampel positif IMNV yang dapat dideteksi dengan teknik qRT-PCR tersebut. Sampel RNA udang vaname yang positif terdeteksi IMNV secara nested RT-PCR, digunakan sebagai sampel yang diencerkan untuk mencari limit deteksi uji. Sampel C5 adalah sampel positif IMNV yang memiliki konsentrasi RNA tertinggi, sehingga digunakan untuk qRT-PCR maupun nested RT-PCR. Hasil pengukuran konsentrasi RNA sampel C5 (udang positif IMNV) adalah 44,1 ng/µl dengan kemurnian (A260/A230) sebesar 1.789. Selanjutnya sampel RNA dibuat seri pengencerannya mulai 10-1 hingga 10-4. Hasil pengenceran sampel RNA tersebut digunakan sebagai template pada kedua uji tersebut. Hasil uji dengan qRT-PCR IMNV TaqMan probe pada serial pengenceran sampel disajikan pada Tabel 7 dan Gambar 18.)
Tabel 6 Nilai Ct qRT-PCR IMNV TaqMan probe pada pengenceran sampel C5 (klinis)
No Warna Nama Tipe Ct
1 NTC NTC 2 C5 pengenceran10-4 Unknown 3 C5 pengenceran10-3 Unknown 29,95 4 C5 pengenceran10-2 Unknown 29,58 5 C5 pengenceran10-1 Unknown 28,48 6 C5 Unknown 27,73
Hasil pengujian dengan qRT-PCR TaqMan probe menunjukkan bahwa konsentrasi RNA 44,1 ng/µl setelah pengenceran hingga 10-4 sampel positif IMNV sudah tidak dapat dideteksi dengan qRT-PCR. Terdapat perbedaan nilai Ct antar sampel RNA yang telah diencerkan, dimana sampel dengan konsentrasi tinggi (pengenceran terendah) memiliki nilai Ct lebih kecil dibandingkan dengan sampel positif IMNV konsentrasi terendah (pengenceran tertinggi). Limit deteksi qRT-PCR IMNV TaqMan probe adalah pengenceran 10-3. Pengenceran sampel
33 RNA (C5) konsentrasi 44,1 ng/µl hingga 104 untuk pengujian dengan nested RT-PCR. Hasil deteksi produk PCR dengan elektroforesis menunjukkan pada nested RT-PCR sudah tidak dapat mendeteksi sampel positif IMNV pada pengenceran 10-2. Limit deteksi deteksi IMNV dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010) pada pengenceran 10-1 (Gambar 19).
Gambar 19 Limit analitik pada serial pengenceran sampel C5 dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010); M (marker 100 bp), line 1: Kontrol positif IMNV (139 bp), line 2: NTC, line 3: sampel C5, line 4: sampel C5 10-1, line 5:sampel C5 10-2, line 6: sampel C5 10-3, line 7: sampel C5 10-4
Sensitifitas diagnostik nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV pada sampel udang vaname (klinis dan sub klinis)
Rata-rata konsentrasi RNA yang berhasil diisolasi menggunakan kit Silica Extraction (Farming Intelligene Tech. Corp., Taiwan) adalah 20-50 ng/µl dengan kemurnian (A260/A230) berkisar antara 1.700-1.900. Sampel dengan gejala klinis (kode : C5.K1-C5K3; K1-K4; HK4) dan sub klinis (kode :C5.N1-N3; SK1-SK4; HK4) diuji dengan nested RT-PCR (primer 4587F-4914R; 4725NF-4863NR) (Gambar 20) dan qRT-PCR IQ Real IMNV. Hasil pengujian keseluruhan sampel disajikan pada Tabel 7.
Gambar 18 Limit Deteksi (LOD) qRT-PCR IMNV dengan TaqMan probe
34
Gambar 20 Hasil nested RT-PCR IMNV (139 bp), sampel klinis dan sub klinis IMNV; (A) LineM (Marker 100 bp), line1 (kontrol +IMNV), line 2 (NTC), line 3-10 (sampel 1-8), line 11-13 (sampel 9-11). (B) line M (marker 100 bp), line 1(kontrol + IMNV,139 bp), line 2 (NTC), line 3-7(sampel 12-16)
Tabel 7 Hasil pengujian sampel klinis dan sub klinis dengan nested RT-PCR dan qRT-RT-PCR IQ Real No Sampel Kode Kondisi qRT-PCR (Ct) Salinan Nested RT-PCR 1. C5.K1 Klinis 29,31 7.300 + 2. C5.K2 Klinis 33,56 193 + 3. C5.K3 Klinis 30,12 2.217 + 4. K.1. Klinis 33,47 206,39 + 5. K.2. Klinis 35,48 49,7 + 6. K.3. Klinis 35,43 51,41 + 7. K.4. Klinis 32,71 353,72 + 8. H.K4 Klinis 34,71 85,54 + 9. C5.N.1 Sub Klinis 35,46 50 - 10. C5.N.2 Sub Klinis 38,68 5 - 11. C5.N.3 Sub Klinis 39,43 3 - 12. SK1 Sub Klinis - - - 13. SK2 Sub Klinis - - - 14 SK3 Sub Klinis - - - 15 SK4 Sub Klinis - - - 16 HSK2 Sub Klinis - - -
Hasil pengujian dengan qRT-PCRmenunjukkan hasil yang berbeda dengan nested RT-PCR. Keseluruhan sampel dengan gejala klinis menunjukkan hasil positif IMNV baik dengan qRT-PCR maupun dengan nested RT-PCR. Dari keseluruhan sampel sub klinis yang diuji terdapat tiga sampel yang terdeteksi positif IMNV dengan qRT-PCR namun negatif IMNV dengan nested RT-PCR. Kisaran salinan virus myonecrosis yang terdeteksi pada sampel sub klinis adalah 3-50 salinan (Tabel 7).
35 Penghitungan nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT-PCR dan qRT-PCR IQ RealTMadalah :
Tabel 8 Perhitungan nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT-PCR dan qRT-PCR IQ RealTM
Nested RT-PCR IMNV
Positif Negatif JUMLAH
rRT- PCR IMNV
Positif 8 4 12
Negatif 0 4 4
JUMLAH 8 8 16
Penghitungan akurasi berdasar rumus sebagai berikut :
Berdasar hasil pengujian sampel, nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT-PCR dan qRT-RT-PCR IQ RealTM100%, dengan limit deteksi hingga 1 salinan/ µl. Metoda nested RT-PCR hanya mampu membaca hingga 103 salinan/ µl.
Deteksi IMNV dengan qRT-PCR TaqMan probe dan qRT-PCR IQ Real TM
Hasil pengujian IMNV pada sampel udang dengan qRT-PCR TaqMan probe dan qRT-PCR IQ Real TM disajikan pada Gambar 21 a,b,c. Konsentrasi salinan virus dan nilai Ct qRT-PCR disajikan pada Tabel 9.
Gambar 21 Pengujian sampel IMNV dengan qRT-PCR IMNV TaqMan probe dan qRT-PCR IQ RealTM. (a) Kurva Ct qRT-PCR IQ Real. (b) Kurva Ct qRT-PCR IMNV TaqMan (c) Perbandingan nilai Ct dengan konsentrasi salinan qRT-PCR IQ Real.
Sensitifitas = True positiveX 100% True Positive+False Negative = 8/ 8+0 X 100%
36
Tabel 9 Konsentrasi salinan dan nilai Ct qRT-PCR IQ real dan TaqMan probe
No. Warna Name
qRT-PCR IQ Real TaqMan probe Ct Ct Con.salinan 1 Stand.IMNV 104/ pIMNV 28,76 10.000,00 29,39 2 sampel 174a 37,08 27,3 35,19 3 sampel 174b 37,46 20,8 36,99 4 sampel 175a 36,54 40,1 34,55 5 sampel 175b - - 36,34 6 sampel 175c 36,84 32,4 33,42 7 sampel 175d - - - 8 sampel 175e - - 37,32 9 NTC - - -
Hasil pemeriksaan dengan jumlah sampel terbatas menunjukkan sampel 175b negatif IMNV dengan IQ Real, dan positif IMNV pada Ct 36,34 dengan TaqMan probe. Sampel 175e negatif IMNV dengan TaqMan probe dan IQ Real. Rata-rata nilai Ct yang dihasilkan oleh Taqman probe dan IQ Real tidak banyak berbeda (setara).
Kloning fragmen gen ORF1 IMNV sebagai kandidat kontrol positif
Tahapan dalam kloning dimulai dari ligasi, transformasi, seleksi koloni dan perbanyakan. Untuk mengetahui sel bakteri telah mengandung DNA rekombinan, maka sel bakteri ditumbuhkan dalam medium padat yang mengandung antibiotik, X-gal (zat kimia yang berfungsi sebagai indikator) dan IPTG (zat kimia yang berfungsi sebagai inducer). Jika sel bakteri tersebut mengandung DNA rekombinan, maka terdapat koloni berwarna putih pada kultur medium padat. Adanya perubahan yang terjadi pada koloni digunakan untuk memastikan keberhasilan membuat DNA rekombinan dan penggandaan jumlah gen yang disisipkan ke dalam plasmid (Azhar, 2008). Konsentrasi plasmid yang dihasilkan dari purifikasi plasmid DNA Rekombinan IMNV menggunakan QIAprep® miniprep (Qiagen)disajikan pada Tabel 11.
Tabel 10 Konsentrasi plasmid DNA rekombinan IMNV
Kode Plasmid Konsentrasi Plasmid (ng/ µl) Puritas plasmid A260/A280 218 A 81,1 1,630 218B 95,9 1,796 218Bb 69,2 1,648 412 B 32,5 1,562 412 C 57,0 1,733
37 Primer gen spesifik digunakan untuk memastikan ketepatan insersi gen target pada plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV). Amplifikasi PCR dengan gen spesifik memunculkan pita 327bp dan 270 bp sesuai dengan primer fragmen gen ORF1 IMNV (Gambar 22).
Gambar 22 Plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV); M (marker 100 bp); line 1-8: pIMNV 218-545 (327 bp); line 7-8: pIMNV 412-545 (270 bp).
Hasil sekuensing pIMNV 218 dan pIMNV 412 dengan gen spesifik 99% sesuai dengan genome IMNV isolat Indonesia GenBank accession no. EF061744 dan IMNV isolat Brazil GenBank accession no.AY570982. Analisa BLAST GenBank pIMNV dengan primer T7 promoter dan Sp6 promoter menunjukkan terdapat 2 jenis urutan nukleotida pada hasil sequence yaitu gen IMNV (GenBank accession no.EF061744 dan no.AY570982), dan gen pDRIVE cloning vectorgenome Acc.no. DQ996013 sesuai dengan vektor plasmid yang digunakan.
Tabel 11 Nilai Ct plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV) dengan rPCR IMNV TaqMan probe
No. Warna Sampel Ct
1 pIMNV 218A 26,51
2 pIMNV 218 B 19,73
3 pIMNV 218 Bb 22,11
4 pIMNV 412 B 34,07
5 pIMNV 412 C 22,84
6 cDNA sampel positif IMNV (C5.K1)
26,87
7 NTC
Keseluruhan plasmid DNA rekombinan IMNNV (pIMNV) berhasil diamplifikasi dengan real time PCR IMNV TaqMan Probe bersama dengan sampel positif IMNV (cDNA). Konsentrasi pIMNV berpengaruh terhadap nilai Ct real time PCR (Tabel 12). Konsentrasi plasmid berbanding terbalik dengan nilai Ct pada kurva qPCR. Plasmid dengan konsentrasi rendah nilai Ct pada qPCR
38
akan lebih tinggi dibanding plasmid dengan konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 23).
Gambar 23 Kurva nilai Ct plasmid DNA rekombinan (pIMNV) pengujian rPCR IMNV TaqMan probe
Gambar 24 Peta plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV) 327 bp pada pDrive cloning vector
39
Pembahasan
Infeksi IMNV pertama kali muncul pada budidaya udang vaname (L.vannamei) di Pernambuco di Brasil pada tahun 2002, dan selanjutnya menyebar ke seluruh pesisir wilayah utara-timur Brazil, Indonesia, Thailand dan Provinsi Hainan di Cina (Lightner et al., 2004b; Senapin et al., 2007; Andrade et al., 2007). Sumber asli infeksi tidak diketahui, tetapi penyebaran trans-benua hampir dapat dipastikan karena tingginya frekwensi perdagangan induk udang L. vannamei (Walker et al., 2010). Gejala klinis yang menyertai infeksi myonecrosis pada umumnya muncul dengan derajat nekrosis otot udang yang berbeda-beda (Tang et al., 2005; Walker et al., 2010). Infeksi myonecrosis pertama kali masuk ke Indonesia pada tahun 2006 menjadi wabah di tambak-tambak udang di Situbondo Jawa Timur. Gejala klinis oleh infeksi myonecorsis pada budidaya udang vaname berupa hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis, infeksi lanjutan (berat) ditandai dengan perubahan jaringan otot di bagian distal abdomen udang dari warna putih suram menjadi merah seperti udang rebus (Andrade et al., 2008). Gejala klinis yang ditimbulkan akibat infeksi myonecrosis di Indonesia memiliki kemiripan dengan gejala klinis myonecrosis di Brazil (Senapin et al., 2007; OIE, 2012; Senapin et al., 2011)
Hasil pengamatan sampel udang vaname dengan gejala klinis infeksi myonecrosis, terdapat perubahan jaringan otot berwarna putih (nekrosis) pada ruas abdomen ke-6. Nekrosis jaringan otot udang vaname hanya pada ruas abdomen ke-6 dan tidak merata keseluruh tubuh. Warna udang juga tidak mengalami perubahan menyerupai udang rebus, dimana infeksi myonecrosis berat ditandai dengan adanya perubahan nekrosis jaringan otot udang dari warna putih suram menjadi merah menyerupai udang rebus (Lightner et al., 2004). Pada umumnya infeksi awal ditandai dengan hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis dan infeksi lanjutan ditandai dengan nekrosis pada jaringan otot di bagian distal abdomen (Lightner et al.,2004a,b; Poulos et al., 2006). Perubahan nekrosis jaringan otot dari warna putih suram menjadi merah (seperti udang rebus) menyebabkan mortalitas udang hingga 70% (Andrade et al., 2008).
Pengambilan sampel dilakukan pada saat tambak tidak dalam kondisi terjadi kematian masal akibat infeksi myonecrosis. Infeksi myonecrosis dicurigai menjadi penyebab kematian beberapa ekor udang vaname di tambak berdasar gejala klinisnya. Kematian udang vaname oleh infeksi myonecrosis tersebut relatif tidak banyak, hal ini kemungkinan disebabkan status infeksi myonecrosis masih tahap infeksi awal. Seperti dikemukakan oleh Andrade et al., (2007) sifat infeksi myonecrosis adalah komulatif progresif, dimana udang vaname yang diinfeksi buatan dengan virion murni IMNV menunjukkan perkembangan infeksi yang lambat, dan rata-rata waktu kematian udang hingga 50% (LT50) setelah hari ke-43 paska infeksi (p.i.)
Hasil pemeriksaan sampel udang dari Situbondo yang dicurigai terinfeksi IMNV dengan nested RT-PCR (OIE, 2012) menunjukkan sampel positif IMNV. Sampel positif IMNV tersebut digunakan untuk deteksi fragmen ORF 1 IMNV. Primer 218F-682R adalah primer yang didesain untuk mengamplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV sepanjang 464 bp, namun demikian primer tersebut ternyata sulit mengamplifikasi cDNA positif IMNV untuk menghasilkan pita 464 bp.
40
Kesulitan mendapatkan pita 464 bp sesuai target fragmen gen ORF1 IMNV mungkin dikarenakan kualitas primer yang kurang baik, sehingga sulit mengamplifikasi gen target. Untuk mendapatkan target fragmen gen ORF1 sepanjang 464 bp digunakan kombinasi primer 218F-682R dengan primer real time RT-PCR Taqman probe 412F-545R. Amplifikasi fragmen gen ORF1 mengkombinasikan primer 218F-545R agar dapat menghasilkan produk PCR sepanjang 327 bp, dan primer 412F-682R yang menghasilkan produk PCR sepanjang 270 bp. Kombinasi primer ini dilakukan agar dapat mengamplifikasi basa nukeotida fragmen gen ORF1 pada sekuen 218-682. Urutan basa nukleotida fragmen gen ORF1 218-682 adalah daerah yang digunakan untuk desain primer real time RT-PCR IMNV TaqMan probe (Andrade et al., 2007; OIE, 2012).
Deteksi fragmen gen ORF1 sangat penting karena daerah tersebut adalah conserve region virus myonecrosis. Gen ORF1 adalah daerah terpanjang dari sekuen genom virus myonecrosis (136-4953) dibandingkan gen ORF2 (5241-7541) (Nibert, 2007; Tang et al., 2008). Gen ORF1 mengkode protein yang mengikat putative RNA dan mengkode protein capsid virus myonecrosis (Lightner et al., 2004; Tang et al., 2005) sehingga daerah ini yang sering digunakan untuk mendeteksi keberadaan virus myonecrosis. Urutan basa nukleotida 218-545 dan urutan basa nukleotida 412-682 adalah urutan basa nukleotida yang akan disisipkan pada vektor plasmid untuk keperluan pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (IMNVp) sebagai kontrol positif real time RT-PCR IMNV TaqMan probe. Urutan nukleotida tersebut sesuai dengan desain primer qRT-PCR IMNV, yaitu daerah fragmen gen ORF1 myonecrosis virus yang mengambil daerah 412-545 (Andrade et al., 2007; da Silva et al., 2011; OIE, 2012). Desain primer probe qRT-PCR dimulai dari sekuen 467-500, sehingga kedua urutan nukleotida yang disisipkan dalam plasmid masih dapat dikenali oleh probe qRT-PCR IMNV.
Berdasar hasil sekuensing sampel IMNV isolat lapang yang berasal dari Situbondo dan Lampung, kedua isolat memiliki kemiripan (similiarity) dengan genome IMNV dari Brazil dan Indonesia hingga 99%. Isolat lapang dari Lampung memiliki kemiripan dengan isolat Indonesia 99,12%, dan dengan isolat Brazil 98,90%. Isolat Situbondo memiliki kemiripan dengan isolat Indonesia 99,55% dan isolat Brazil 99,33%. Dibandingkan dengan IMNV isolat Lampung, IMNV isolat Situbondo lebih banyak memiliki kemiripan basa dengan isolat Indonesia dan isolat Brazil. Hal ini dimungkinkan mengingat isolat Indonesia (GenBank accession no.EF061744) berasal dari Situbondo (Senapin et al., 2007). Kemiripan antar kedua isolat lapang dari Lampung dan Situbondo berdasar pensejajaran (alignment) dari kedua sekuens fragmen adalah 98,90%. Terdapat perbedaan 5 pasang basa dari total 457 pasang basa diantara kedua isolat tersebut. Hasil BLAST menunjukkkan bahwa urutan nukleotida tersebut mengkode fragmen gen ORF1 IMNV (Lampiran 1 dan 2). Meskipun terdapat perbedaan basa, secara umum kedua isolat tersebut masih memiliki kemiripan dengan genom IMNV isolat Brazil maupun Indonesia yang terdaftar di GenBank. Seperti dikemukakan Senapin et al (2007) homologi antara isolat Indonesia dan Brazil dibuktikan dengan sekuen keduanya yang memiliki kemiripan hingga 99,6% dimana hanya terdapat 29 basa yang berbeda dalam urutan genome dari total 7,5 kb basa nukleotida. Salah satu perbedaan tersebut adalah adanya penyisipan basa tunggal pada nukleotida urutan 7431 yang berperan pada penyusunan asam amino
41 dalam pembentukan protein RdRp (RNA dependent RNA polymerase). Meskipun terjadi mutasi pergeseran frame (frame shift) asam amino pada posisi 731 dan terjadi 3 mutasi lainnya pada ORF2, tidak mengubah asam amino di delapan motif sekuen RdRp yang berada di 46-513 (Poulos et al., 2006; Senapin et al., 2007).
Sampel udang vaname yang diambil dari tambak di Lampung menunjukkan gejala klinis berupa hilangnya transparansi jaringan otot udang menjadi berwana keputihan (nekrosis) khususnya pada ruas abdominal ke-6. Tidak ditemukan kondisi nekrosis lanjutan pada jaringan otot udang vaname berupa perubahan warna putih suram menjadi merah. Berdasarkan gejala klinis yang diamati dan hasil pengujian dengan nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV, mengindikasikan infeksi yang terjadi pada udang masih pada tahap infeksi awal. Infeksi awal ditandai dengan hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis dan infeksi lanjutan ditandai dengan nekrosis pada jaringan otot di bagian distal abdomen (Lightner et al.,2004a,b; Poulos et al., 2006).
Pemeriksaan sampel udang dengan gejala klinis dan sub klinis IMNV menunjukkan hasil yang berbeda antara pemeriksaan dengan nested RT-PCR maupun qRT-PCR. Nested RT-PCR hanya mampu mendeteksi sampel dengan kondisi klinis terinfeksi IMNV meskipun pada tahap awal infeksi, dan tidak dapat mendeteksi sampel udang sub klinis. Berbeda dengan qRT-PCR yang dapat mendeteksi sampel klinis maupun sub klinis. Sensitivitas uji qRT-PCR IQ Real IMNV (Farming Intelligene) adalah 100%, dengan limit deteksi hingga <101 salinan/µl. Sesuai dengan penelitian Andrade et al., (2007) yang menyatakan bahwa nested RT-PCR hanya mampu mendeteksi IMNV saat jumlah salinan virus tinggi >1500 salinan, sedangkan qRT-PCR IMNV mampu mendeteksi
