Penelitian dilakukan dalam dua tahap; tahapan pertama adalah penambatan antara protein hormon GLP-1 (PDB ID: 1D0R) dan analognya yaitu exenatide
(PDB ID: 1JRJ) dan liraglutide (PDB ID: 4APD) dengan protein trans-membran GLP-1R (PDB ID: 3C59). Hasil penambatan GLP-1 dengan GLP-1R, exenatide
dengan GLP-1R dan liraglutide dengan GLP-1R dianalisis dan dipilih satu formasi penambatan dari masing-masing pasangan untuk dilakukan tahapan berikutnya. Tahapan kedua, simulasi dinamika molekul dengan masing-masing hasil penambatan yang terpilih pada suhu 310K.
Proses penambatan protein dengan server ZDOCK 3.0.2 dari masing-masing pasangan protein menghasilkan 10 formasi penambatan, sehingga secara keseluruhan didapatkan 30 hasil formasi penambatan. Simulasi dinamika molekul dengan NAMD 2.9 dilakukan hanya pada formasi penambatan yang terpilih dari masing-masing pasangan, sehingga diperoleh 3 hasil simulasi dinamika molekul untuk dianalisis.
Analisis hasil penambatan
Setelah dilakukan proses penambatan protein hormon GLP-1, exenatide dan
liraglutide terhadap protein trans-membran GLP-1R, diperoleh 10 formasi penambatan untuk masing-masing pasangan protein hormon dan protein trans-membran. Selanjutnya dilakukan identifikasi asam amino yang menjalin interaksi dari masing-masing formasi penambatan dengan menggunakan analisis dan visualisasi VMD. Hasil identifikasi ini kemudian digunakan untuk memilih satu formasi yang memiliki pasangan asam amino aktif paling banyak untuk selanjutnya dilakukan pengujian terhadap kestabilan interaksi dengan NAMD.
Protein hormon GLP-1 adalah protein yang dihasilkan oleh tubuh manusia dalam sel epitel usus halus. GLP-1 berperan sebagai regulator dalam sekresi insulin oleh pankreas. Protein GLP-1 berikatan dengan protein GLP-1R pada membran pankreas untuk selanjutnya bekerja merangsang pembentukan insulin. Mengingat protein hormon GLP-1 adalah hormon alami yang dihasilkan oleh tubuh, maka protein ini dianggap sebagai protein wild type. Formasi hasil penambatan antara protein hormon GLP-1 dengan protein trans-membran GLP-1R diberi label WR1 (wild type– reseptor), WR2 dan seterusnya sampai WR10. Perbedaan antara ke-sepuluh formasi penambatan yang diamati terdapat pada perbedaan binding site
atau lokasi penambatan pada protein reseptor GLP-1R dan juga perbedaan residu pada protein hormon GLP-1 yang berinteraksi atau menempel pada reseptor. Perbedaan lokasi penambatan dan juga residu protein hormon GLP-1 yang menambat menghasilkan formasi penambatan yang berbeda-beda (Gambar 4.1). Analisis lebih lanjut terhadap setiap formasi penambatan diperoleh beberapa pasangan residu dari protein GLP-1 dan protein GLP-1R yang melakukan interaksi (tabel 4.1).
Analisis ke-10 hasil penambatan antara GLP-1 dan GLP-1R menunjukkan bahwa rata-rata terdapat 7,3 pasangan interaksi dengan rata-rata jarak terdekat setiap pasangan 2,0067 Å. Analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa asam amino pada protein hormon yang aktif melakukan interaksi adalah L14, Q17, A18 dan F22
16
dengan muncul pada 6 formasi penambatan, sedangkan E21 dan W25 muncul pada 5 formasi penambatan. Residu E15 dan R30 dapat dikatakan memiliki keaktifan menengah karena dapat ditemukan di 4 formasi penambatan. Asam amino pada protein trans-membran GLP-1R yang paling aktif melakukan interaksi adalah W120 dengan muncul pada 6 formasi penambatan, F80 muncul pada 5 formasi penambatan dan Y101 muncul pada 4 formasi penambatan. Selanjutnya F103 dan L111 muncul pada 3 formasi penambatan. Berdasarkan hasil ini, dapat dilihat bahwa formasi penambatan WR1 memiliki paling banyak pasangan asam amino aktif dibandingkan dengan formasi yang lain.
WR1 WR2 WR3 WR4 WR5
WR6 WR7 WR8 WR9 WR10
Gambar 4.1 Formasi hasil penambatan GLP-1 (merah) dengan GLP-1R (biru) Tabel 4.1 Analisis hasil penambatan protein hormon GLP-1 dengan GLP-1R
WR1 WR2 WR3 WR4 WR5 WR6 WR7 WR8 WR9 WR10 L14-Y101 Q17-F80 Q17-W120 A18-F103 A18-F80 E21-L111 F22-F103 R30-L111 L14-V81 L14-N82 Q17-P73 A18-H99 F22-P96 G29-W87 R30-W87 E15-R48* E15-R44* A18-Q45 I23-D53 W25-C71 W25-Y42 L26-P73 L26-C71 G29-S84 L14-W120 Q17-Y101 A18-E125 E21-Q125 E21-E125 F22-S124 F24-S124 W25-K130 R30-S94 Y13-F80 L14-F103 Q17-F80 Q17-W120 E21-R121* F22-Q112 F22-S116 W25-L118 F6-V81 F6-Y101 D9-F80 V10-F80 Y13-F103 Y13-L111 L14-G78 L14-F80 E15-K113* Q17-W120 Q17-D122 A18-W120 F22-S117 L26-N115 E21-Q68 W25-P90 G29-Q89 R30-Y69 S11-W120 E15-R121 W25-T35 K28-L32 G29-L32 L14-N82 E15-F80 Q17-E125 Q17-Y101 A18-F80 E21-W120 E21-D122 F22-L111 F22-W120 Rata-rata jumlah pasangan interaksi = 7,3
Rata-rata jarak terdekat setiap pasangan = 2,0067 Å
Catatan: asam amino di sebelah kiri dari masing-masing pasangan berasal dari protein GLP-1 dan asam amino sebelah kanan dari protein GLP-1R, interaksi hidrofobik (tanpa label), interaksi polar (garis bawah), jembatan garam (asteriks)
Pada formasi WR1, dari 8 pasangan interaksi yang berinteraksi, 7 diantaranya melibatkan asam amino aktif. Residu L14, Q17, A18, E21 dan F22 pada protein hormon GLP-1 adalah merupakan asam amino yang aktif berinteraksi. Demikian juga dengan residu aktif pada GLP-1R yaitu F80, Y101 dan W120, ketiganya dapat ditemukan pada formasi penambatan WR1. Residu L14 berinteraksi dengan Y101, Q17 berinteraksi dengan F80 dan W120, A18 berinteraksi dengan F80 dan F103, E21 berinteraksi dengan L111, F22 berinteraksi dengan F103, dan R30 berinteraksi dengan L111. Binding site atau lokasi penambatan antara protein protein GLP-1 dengan GLP-1R adalah pada residu ke-80 sampai residu ke-120 yang merupakan daerah beta-sheet, coil dan turn. Sedangkan residu protein GLP-1 yang aktif berinteraksi adalah residu ke-14 sampai ke-25 yang berada pada rantai alpha-helix. Protein hormon GLP-1 menambat dengan sempurna pada protein reseptor GLP-1R (Gambar 4.2) dimana hampir sepanjang molekul GLP-1 berimpitan dengan sepenuhnya dengan protein GLP-1R.
17
Hasil analisis VMD tidak menemukan adanya ikatan hidrogen dan jembatan garam antara protein GLP-1 dengan GLP1-R. Interaksi yang terbentuk adalah interaksi non-ikatan antara residu polar (Q17, Y101, Y120), residu bermuatan positif (R30), residu bermuatan negatif (E21) dan sebagian besar adalah residu non-polar. Interaksi yang terbentuk antara residu non polar dengan residu polar atau bermuatan adalah interaksi Van der Waals. Interaksi ini terjadi karena keberadaan residu polar atau bermuatan menginduksi residu non-polar di sekelilingnya sehingga bersifat polar untuk sementara. Interaksi Van der Waals tidak sekuat ikatan hidrogen atau jembatan garam, namun banyaknya gaya Van der Waals yang bekerja dapat menghasilkan interaksi yang cukup kuat.
Proses penambatan selanjutnya dilakukan antara protein yang merupakan analog protein hormon GLP-1 yaitu exenatide dengan protein trans-membran GLP-1R. Sepuluh formasi hasil penambatan exenatide dengan GLP-1R diberi label ER1 (exenatide – reseptor), ER2, dan seterusnya sampai ER10 (Gambar 4.3), analisis hasil penambatan menunjukkan perbedaan residu yang berinteraksi (Tabel 4.2).
ER1 ER2 ER3 ER4 ER5
ER6 ER7 ER8 ER9 ER10
Gambar 4.3 Formasi hasil penambatan exenatide (merah) dengan GLP-1R (biru)
Gambar 4.2 Interaksi antar asam amino pada hasil penambatan protein GLP-1 dan GLP-1R formasi WR1
18
Tabel 4.2 Analisis hasil penambatan protein hormon exenatide dengan GLP-1R ER1 ER2 ER3 ER4 ER5 ER6 ER7 ER8 ER9 ER10 V19-D122 F22-F80 F22-W120 W25-F80 P37-L111 P37-F103 S39-K113 S39-W120 E15-R121* F22-V36 P31-L89 P37-Y69 S39-E68 E15-R40* F22-V36 P31-L89 S32-E127 P36-D67 P37-E68 S39-R43 S39-W39 S39-E68 E15-G78 F22-F80 F22-L111 W25-W120 W25-D122 L26-W120 S39-F80 P31-F80 S39-K113 E15-L111 E16-K113* F22-W120 F22-L111 S39-F103 V19-G78 F22-L111 F22-F80 W25-W120 P37-D122 P38-F80 S39-Y101 V19-D122 F22-F80 L26-Y101 P38-F80 S39-F103 E15-R40* V19-W39 F22-E68 P31-R121 P31-L118 S39-E68 E15-A106 F22-F80 P31-E125 P31-D122 S39-F80 S39-G78
Rata-rata jumlah pasangan interaksi = 5,9 Rata-rata jarak terdekat setiap pasangan = 1,8297 Å
Catatan: asam amino di sebelah kiri dari masing-masing pasangan berasal dari protein exenatide dan asam amino sebelah kanan dari protein GLP-1R, interaksi hidrofobik (tanpa label), interaksi polar (garis bawah), jembatan garam (asteriks)
Hasil analisis masing-masing formasi penambatan menunjukkan bahwa ada dua residu protein exenatide yang sangat aktif melakukan interaksi dengan GLP-1R, yaitu S39 yang muncul di kesepuluh formasi penambatan dan F22 yang muncul di 9 formasi penambatan. Residu lain yang dapat dikategorikan aktif berinteraksi adalah E15 yang teridentifikasi di 6 formasi penambatan, dan P31 yang muncul di 5 formasi penambatan. Sedangkan V19 dan P37 masing-masing muncul dalam 4 formasi penambatan. Aktivitas yang tinggi ditunjukkan oleh residu S39 yang muncul di semua formasi penambatan, hal ini menunjukkan pentingnya residu S39 dalam interaksi antara protein exenatide dengan GLP-1R. Demikian juga dengan residu F22, memiliki peranan besar dalam interaksi ligand-reseptor. Pada protein GLP-1R, hasil yang tidak jauh berbeda dengan hasil penambatan antara GLP-1 dengan GLP-1R didapat, yaitu residu F80 termasuk paling aktif dengan muncul pada 7 formasi penambatan, D122 muncul pada 5 formasi penambatan. Sedangkan E68, L111 dan W120 masing-masing muncul dalam 4 pasangan penambatan. Formasi ER1 diidentifikasi memiliki pasangan residu aktif paling banyak dibandingkan dengan formasi penambatan yang lain.
Pada formasi penambatan ER1, teridentifikasi 9 pasangan interaksi dan 7 diantaranya melibatkan asam amino aktif baik dari molekul protein exenatide
maupun dari molekul protein GLP-1R. Pasangan interaksi dari residu yang kurang aktif adalah P37-F103 dan pasangan S39-K113. Residu yang paling aktif berinteraksi, S39 terlihat berinteraksi dengan K113 dan W120 (Gambar 4.4). F22 berinteraksi dengan F80 dan W120, sedangkan P37 berinteraksi dengan L111 dan F103. Keseluruhan pasangan residu ini melibatkan residu non polar hydrophobic, kecuali S39 yang bersifat polar berinteraksi dengan W120 yang juga bersifat polar. Diduga interaksi Van der Waals S39 dengan W120 lebih kuat dari pada pasangan yang lain, namun masih perlu dibuktikan lebih lanjut melalui simulasi dinamika molekul. Hasil analisis VMD tidak menemukan ikatan hidrogen antara protein
exenatide dengan protein GLP-1R dan ditemukan satu jembatan garam antara residu E15 pada exenatide dengan R121 pada GLP-1R. Residu E15 merupakan salah satu residu yang aktif berinteraksi karena juga muncul pada formasi penambatan yang lain, namun interaksi yang berupa jembatan garam hanya dapat diidentifikasi pada formasi penambatan ER3 dan ER9 dimana di kedua formasi ini E15 berinteraksi dengan R40. Sedangkan interaksi dengan R121 hanya diidentifikasi pada formasi penambatan ER1. Peranan jembatan garam dalam menstabilkan interaksi ligand-reseptor dapat dilihat pada analisis hasil simulasi dinamika molekul.
19
Gambar 4.4 Interaksi antar asam amino pada hasil penambatan protein
exenatide dan GLP-1R formasi ER1
Berbeda dengan GLP-1 dan exenatide, struktur protein liraglutide dimulai dari H7 sampai G37 serta terdiri dari dua alpha-helix yang dihubungkan oleh koil yang tersusun dari residu G22, Q23 dan A24. Hasil penambatan antara liraglutide
dan protein trans-membran GLP-1R diberi label LR1 (liraglutide– reseptor), LR2 dan seterusnya. Seperti halnya dua protein sebelumnya yaitu GLP-1 dan exenatide, protein liraglutide menambat pada protein reseptor GLP-1R pada lokasi penambatan yang berbeda-beda, residu liraglutide yang berinteraksi juga berbeda sehingga dihasilkan sepuluh formasi penambatan yang berbeda (Gambar 4.5). Analisis terhadap ke-sepuluh formasi penambatan liraglutide pada GLP-1R menunjukkan adanya variasi yang cukup besar antara masing-masing hasil penambatan (Tabel 4.3). Formasi penambatan LR1 dan LR7 hanya memiliki 6 pasangan interaksi, sedangkan formasi penambatan LR6 dan LR10 memiliki 14 pasangan interaksi. Interaksi yang terbentuk antara protein liraglutide dengan protein GLP-1R didominasi oleh interaksi polar, antara residu yang bersifat polar atau yang terpolarisasi.
LR1 LR2 LR3 LR4 LR5
LR6 LR7 LR8 LR9 LR10
Gambar 4.5 Formasi hasil penambatan liraglutide (merah) dengan GLP-1R (biru)
20
Tabel 4.3 Analisis hasil penambatan protein hormon liraglutide dengan GLP-1R LR1 LR2 LR3 LR4 LR5 LR6 LR7 LR8 LR9 LR10 F12-T105 D15-F103 Y19-F80 A25-Y101 K26-Y101 F28-H99 F12-A106 Y19-L111 Q23-F80 A25-Y101 K26-Y101 F28-Y101 F28-E125 W31-Q97 G10-W120 F12-W120 F12-P119 D15-R121 Y19-L118 A24-E68 A24-W39 A25-E68 F28-W39 W31-V36 R34-L32 H7-Q97 F12-F80 F12-Y101 D15-F80 Y19-G78 Y19-F103 F28-K113 E9-K130* E10-K130* T11-R131 F12-E127 F12-S129 Y19-Q97 Y19-E125 A24-D122 A25-D122 A25-Q125 F28-F80 E9-T29 G10-T29 T11-P90 F12-T35 F12-E34 D15-W87 Y19-W87 Q23-W87 E27-S84 E27-V83 F28-D53 W31-P73 R36-P55 R36-P56 V30-R36 W31-Y88 W31-P90 L32-L32 L32-T35 R36-E34* F12-F80 D15-F80 V16-Y101 Y19-F80 Y19-N82 Y19-Y101 F12-S94 Y19-H99 Y19-Q97 A24-D122 A25-Y101 K26-F80 F28-F80 F28-F103 Y19-W120 Y19-Q112 L20-L118 G22-R121 A24-E127 A25-Y69 K26-R121 F28-E68 F28-Y88 W31-W39 W31-V36 R34-L32 R36-R40 R36-V36 Rata-rata jumlah pasangan interaksi = 9,1
Rata-rata jarak terdekat setiap pasangan = 1,94739 Å
Catatan: asam amino di sebelah kiri dari masing-masing pasangan berasal dari protein liraglutide dan asam amino sebelah kanan dari protein GLP-1R, interaksi hidrofobik (tanpa label), interaksi polar (garis bawah), jembatan garam (asteriks)
Proses penambatan antara protein liraglutide dengan GLP-1R tidak menunjukkan kecenderungan adanya binding site yang tetap. Binding site pada GLP-1R dari 10 formasi penambatan yang diamati menyebar di beberapa tempat, namun ada dua residu yang diidentifikasi cukup aktif menjalin interaksi, yaitu residu F80 dan Y101. Kedua residu ini berperan dalam menjalin interaksi pada 5 formasi penambatan. Di luar kedua residu tersebut, tidak ditemukan residu yang cukup menonjol dalam berinteraksi dengan protein ligand dalam hal ini liraglutide. Sebaliknya pada protein liraglutide, ditemukan beberapa residu yang cukup aktif dalam menjalin interaksi dengan reseptor; Y19 ditemukan di 9 formasi penambatan, F12 dan F28 muncul di 8 formasi penambatan, A25 muncul dalam 6 formasi penambatan, sedangkan D15 dan W31 ditemukan di 5 formasi penambatan. Ketiadaan binding site yang tetap menyebabkan sulitnya memilih satu formasi penambatan yang paling disukai untuk dilakukan tahapan penelitian berikutnya. Formasi penambatan LR1 dipilih karena meskipun jumlah pasangan residu yang berinteraksi tidak banyak namun jumlah pasangan residu aktifnya relatif lebih banyak dibandingkan formasi penambatan yang lain .
Pada formasi penambatan LR1 ditemukan 6 pasangan interaksi dan ke-enam pasangan interaksi tersebut seluruhnya melibatkan residu aktif baik dari protein
liraglutide maupun protein GLP-1R. Lima residu liraglutide yang sangat aktif melakukan interaksi yaitu F12, D15, Y19, A25, dan F28 dapat ditemukan pada formasi penambatan ini, demikian juga dua residu aktif dari protein GLP-1R yaitu F80 dan Y101 juga ditemukan pada formasi penambatan ini. Karena hanya enam residu liraglutide yang teridentifikasi berinterikasi dengan GLP-1R pada formasi LR1, maka tidak keseluruhan molekul protein liraglutide menambat atau berimpitan pada protein GLP-1R. Area interaksi terlihat hanya pada sebagian kecil molekul liraglutide (Gambar 4.6). Hal ini berbeda dengan formasi penambatan GLP-1 dan GLP-1R, dimana hampir sepanjang molekul GLP-1 berimpitan dengan GLP-1R. Belum ada penelitian yang mengaitkan jumlah pasangan interaksi dengan kekuatan interaksi, untuk itu akan dilakukan analisis lebih lanjut terhadap afinitas
liraglutide terhadap GLP-1R dari hasil simulasi dinamika molekul terutama terhadap energi interaksi non-ikatan antara kedua molekul ini.
21
Gambar 4.6 Interaksi antar asam amino pada hasil penambatan protein
liraglutide dan GLP-1R formasi penambatan LR1
Setelah membandingkan formasi penambatan dari tiga pasangan ligan-reseptor yaitu: GLP-1 dengan GLP-1R, exenatide dengan GLP-1R dan liraglutide
dengan GLP-1R, ditemukan bahwa binding site terletak pada daerah residu F80 sampai residu E125 dengan pemeran utama F80, Y101, D122 dan W120 yang aktif melakukan interaksi (Gambar 4.7). Pada beberapa formasi, daerah penambatan dapat diperluas dari E68 sampai E128. Hasil ini sejalan dengan penelitian sebelumnya bahwa binding site GLP-1R berada pada daerah E68-E128 (Runge et al, 2008). Residu F103, L111, D122 dan E125 memiliki keaktifan interaksi yang mendukung terbentuknya binding site di area ini.
22
Visualisasi VMD dengan metode penggambaran surface menunjukkan bahwa residu F80, Y101 dan W120 membentuk semacam celah yang menjadikannya sebagai lokasi yang tepat untuk berikatan. Residu-residu ini terletak pada struktur betha-sheet sehingga memberikan permukaan yang luas bagi protein lain yang akan berikatan. Dengan struktur ini memungkinkan protein ligand untuk berikatan dengan residu lain selain ketiga residu di atas. Ditinjau dari sifatnya, Fenilalanina dan Leusina adalah asam amino yang bersifat non-polar hydrophobic, Triptofan adalah asam amino non-polar namun memiliki kecenderungan polar, Tirosina adalah asam amino polar sedangkan asam aspartat dan asam glutamat memiliki muatan negatif. Dengan melihat sifat residu aktif ini, interaksi yang dapat terbentuk adalah interaksi Van der Waals, interaksi hidrofobik, jembatan garam dan ikatan hidrogen. Hasil analisis VMD tidak menemukan adanya ikatan hidrogen antara ligand dengan reseptor dan hanya ditemukan satu jembatan garam antara protein exenatide dengan GLP-1R yaitu antara E15 dengan R121. R121 bukan residu yang aktif berinteraksi meskipun berada pada daerah binding site, untuk itu analisis lebih lanjut difokuskan pada interaksi Van der Waals dan interaksi hidrofobik dalam simulasi dinamika molekul.
Pada protein ligand GLP-1, binding site berada pada residu L12 sampai residu F22, dengan pemeran utama L14, Q17, A18 dan F22. GLP-1 memiliki 30 asam amino, residu L14 sampai F22 terletak pada struktur alpha-helix pada bagian tengah asam amino. Hasil visualisasi memperlihatkan bahwa residu L14 dan F22 lebih menonjol dibandingkan permukaan yang lain, hal ini menyebabkan kedua residu ini mampu memasuki celah pada molekul protein GLP-1R dan menjalin interaksi (Gambar 4.8). Morfologi residu fenilalanina yang memanjang membentuk tonjolan pada permukaan molekul sehingga memudahkan residu tersebut untuk memasuki celah atau kantong pada molekul reseptor, seperti terlihat pada F22 dari exenatide, F12 dan F28 dari liraglutide (Gambar 4.8).
a)
b)
c)
Gambar 4.8 Residu aktif protein a) GLP-1, b) exenatide dan c) liraglutide
23 Protein exenatide memiliki 39 asam amino dari H1 sampai S39. Binding site
berada pada residu P22 sampai S39 dengan pemeran utama P22 dan S39, residu lain yang juga berperan aktif adalah P31 dan P37. Yang menarik dari exenatide
adalah residu kunci yang paling aktif berinteraksi, S39, dan residu P31 dan P37 terletak pada rantai tambahan atau rantai terakhir. Sedangkan asam amino pada rantai awal exenatide tidak terlalu berperan dalam menjalin interaksi dengan protein GLP-1R. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan rantai pada exenatide berperan penting dalam afinitas protein ini dengan reseptornya. Pada Gambar 4.8.b terlihat bahwa residu P22, P37 dan S39 membentuk tonjolan untuk berinteraksi dengan molekul lain.
Protein liraglutide memiliki 31 asam amino dari H7 sampai G37. Binding site berada pada residu F12 sampai F28 dengan pemeran utama F12, Y19 dan F28. Apabila penomoran disamakan dengan penomoran residu GLP-1 dan exenatide, maka pemeran utama interaksi ligand-reseptor adalah F6, Y13 dan F22. Residu F6 dan Y13 berada pada rantai awal protein liraglutide. Yang menarik adalah
liraglutide memiliki kemiripan 95% dengan GLP-1, namun memiliki karakteristik penambatan yang berbeda dengan GLP-1. Penggantian residu K28 dengan arginina, penambahan residu glisina pada akhir rantai serta asam lemak C-16 pada residu K16 berpengaruh besar terhadap proses penambatan dan interaksinya dengan protein GLP-1R.
Perbandingan posisi binding site pada ketiga protein tersebut menunjukkan hasil yang menarik. Binding site protein GLP-1 berada di tengah rantai, analog GLP-1 yang mendapatkan rantai tambahan yaitu exenatide memiliki binding site di ujung rantai, sedangkan analog GLP-1 yang menggandeng asam lemak C-16 yaitu liraglutide memiliki binding site di awal rantai. Temuan lain yang menarik adalah residu F22 berperan penting dalam binding site di ketiga protein tersebut. Hal ini penting karena salah satu residu yang juga berperan penting dalam binding site
GLP-1R adalah fenilalanina, selain itu triptofan dan tirosina. Gambar 4.9 berikut menunjukkan kemiripan morfologi antara ketiga residu ini. Ketiganya memiliki struktur yang memanjang sehingga memudahkan molekul protein ini terinduksi dari non-polar menjadi polar dibandingkan dengan protein yang berbentuk bola atau persegi. Sifat ini sangat diperlukan dalam membangun interaksi Van der Waals dengan molekul lain. Residu lain yang menjadi pemeran utama penambatan pada molekul exenatide, S39, bersifat polar sehingga struktur morfologi tidak berpengaruh terhadap kemampuannya berinteraksi dengan molekul lain.
a) b) c)
Gambar 4.9 Kemiripan morfologi antara residu yang berperan penting dalam proses penambatan, a) fenilalanina, b) tirosina, dan c) triptofan
24
Analisis simulasi dinamika molekul
Formasi penambatan yang telah terpilih dari masing-masing pasangan kemudian disimulasikan pada suhu tubuh yaitu 310K selama 20 ns untuk melihat kestabilan interaksi antara kedua molekul protein. Analisis simulasi dinamika molekul yang pertama dilakukan adalah melihat dinamika RMSD selama trajectory
20 ns. Apabila ditemukan perubahan RMSD lebih dari 3Å maka diasumsikan telah terjadi perubahan konformasi molekul, dalam hal ini terjadi perubahan konformasi penambatan.
Dinamika RMSD ketiga pasangan interaksi selama trajectory menunjukkan perbedaan yang cukup signifikan (Gambar 4.10). RMSD formasi penambatan molekul GLP-1 dan GLP-1R ditunjukkan oleh grafik WR1. Selama trajectory 20 ns, terjadi fluktuasi RMSD yang tidak terlalu signifikan dan tidak lebih dari 3Å, sehingga disimpulkan tidak terjadi perubahan formasi penambatan pada interaksi GLP-1 dengan GLP-1R. RMSD formasi penambatan exenatide dengan GLP-1R ditunjukkan oleh grafik ER1. Pada grafik tersebut, terlihat adanya peningkatan yang cukup signifikan pada RMSD sebesar lebih dari 10Å pada frame ke 5000 atau setelah 10 ns, kemudian turun lagi dan terjadi lagi peningkatan RMSD sehingga mencapai lebih dari 20Å setelah 11 ns. Peningkatan RMSD yang cukup siginifikan juga terlihat pada pasangan interaksi liraglutide dengan GLP-1R yang ditunjukkan oleh grafik LR1. Setelah kurang lebih 15 ns, RMSD mengalami peningkatan sehingga mencapai nilai lebih besar dari 15Å dan terus mengalami fluktuasi sampai menjelas 18 ns. Berdasarkan analisis terhadap dinamika RMSD ini dapat disimpulkan telah terjadi perubahan formasi penambatan pada pasangan exenatide
dan GLP-1R serta pasangan liraglutide dan GLP-1R.
Untuk memperkuat kesimpulan di atas, maka dilihat visualisasi masing-masing formasi penambatan dengan menggunakan VMD. Formasi penambatan WR1 antara GLP-1 dengan GLP-1R dapat dilihat pada Gambar 4.2. Dinamika
0 5 10 15 20 25 0 2000 4000 6000 8000 10000 RMSD (Å) waktu ( x 1/500 ns) WR1 ER1 LR1
Gambar 4.10 Dinamika RMSD ketiga formasi penambatan selama trajectory 20 ns
25 interaksi antara ligan dalam hal ini GLP1 dan reseptornya (GLP-1R) selama
trajectory cukup stabil (Gambar 4.11). Terlihat ikatan antara molekul protein GLP-1 dan protein GLP-GLP-1R stabil. Tidak ada pergerakan residu yang cukup signifikan dan merubah formasi penambatan. Pergerakan kecil terlihat dilakukan oleh residu Q17 dan E21, setelah 8 ns kedua residu tersebut menjauh dari pasangannya yaitu F80 dan L111. Pada 12 ns, kedua residu tersebut kembali ke posisi awal. Secara umum dapat dikatakan interaksi antara GLP-1 dan GLP-1R stabil dalam kurun waktu 20ns pada suhu 310K. Analisis terhadap radius antar residu pada masing-masing pasangan interaksi selama trajectory mendukung kesimpulan ini (Gambar 4.12). 2 ns 12 ns 4 ns 14 ns 6 ns 16 ns 8 ns 18 ns 10 ns 20 ns
Gambar 4.11 Dinamika interaksi molekul protein GLP-1 dengan GLP-1R pada suhu 310K
26 a)
b)
Gambar 4.12 Dinamika radius pasangan residu aktif antara GLP-1 dengan GLP-1R selama trajectory 20 ns
Dari grafik pada Gambar 4.12 di atas terlihat bahwa pada pasangan residu Q17-W120 terjadi fluktuasi jarak antar residu yang cukup signifikan. Fluktuasi nyata juga terlihat pada pasangan residu R30-L111, E21-L111 dan pada A18-F103. Radius pasangan R30-L111 dan E21-L111 meningkat cukup signifikan namun masih dalam jarak interaksi dan kembali ke radius semula. Cut off jarak interaksi atau contact distance antara asam amino yang memungkinkan terjadinya interaksi elektrostatik dan Van der Waals adalah 12 Å (Humphrey et al, 1996) Sedangkan radius pasangan A18-F103 mengalami peningkatan yang cukup besar di akhir
trajectory. Radius pasangan A18-F80 juga berfluktuasi namun selalu kembali ke nilai semula sehingga secara akumulatif tidak terdapat perubahan yang cukup signifikan. Untuk memudahkan analisis radius antara pasangan residu aktif pada interaksi GLP-1 dengan GLP-1R, disusun ringkasan statistik jarak antara residu dari ke-8 pasangan yang meliputi radius terpendek, terjauh dan rata-rata serta standar deviasi ( Tabel 4.4). 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2000 4000 6000 8000 10000 ja ra k (Å) waktu ( x 1/500 ns) L14-Y101 Q17-F80 Q17-W120 A18-F80 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2000 4000 6000 8000 10000 ja ra k ( Å) waktu ( x 1/500 ns) A18-F103 E21-L111 F22-F103 R30-L111
27 Tabel 4.4 Ringkasan statistik jarak antara residu aktif pada interaksi molekul
protein GLP-1 dengan molekul GLP-1R selama 20 ns Pasangan residu Radius
minimal (Å) Radius maksimal (Å) Rata-rata radius (Å) Standar Deviasi L14 - Y101 1.7767 7.8102 3.3281 0.8144 Q17 - F80 1.8005 6.1097 2.9568 0.7783 Q17 - W120 2.9886 15.3785 8.9118 2.2043 A18 - F80 1.8869 6.4201 3.4880 0.8366 A18 - F103 1.8192 9.8336 3.9014 1.3607 E21 - L111 2.4575 13.1021 7.0478 1.4484 F22 - F103 3.1285 9.4082 5.4419 0.8861 R30 - L111 1.8380 13.2126 6.9532 1.9069
Berdasarkan hasil ringkasan statistik di atas, dapat dikatakan pasangan residu L14-Y101, Q17-F80, A18-F80, dan F22-F103 relatif lebih stabil dibandingkan keempat pasangan lainnya. Nilai standar deviasi dari fluktuasi radius antar residu dari keempat pasangan ini selama trajectory kurang dari 1 Å. Standar deviasi terendah pada pasangan residu Q17-F80 menunjukkan bahwa pasangan residu ini