Tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) mudah ditanam di tanah yang banyak kadar air. Adapun jumlah daun yang dihasilkan dari kebon seluas 300 m2 pada saat panen sebanyak 2850 gram. Sampel daun kemudian dikeringkan dan digiling dengan derajat kehalusan 60 mesh, dihasilkan 548.07 gram simplisia. Tabel 4 menunjukkan hasil analisis karakterisasi simplisia daun torbangun.
Tabel 4. Karakteristik simplisia daun torbangun
Parameter Hasil (%)
Kadar air Kadar abu Kadar lemak Bahan Larut air Bahan Larut etanol Protein Karbohidrat 7.17 13.48 9.11 18.57 12.64 26.33 48.87
Kadar air dalam daun torbangun sebesar 7.7%, menunjukkan bahwa daun aman disimpan sebelum digunakan untuk ekstraksi. Hal ini karena kadar air di bawah 10% dapat mencegah terjadinya proses enzimatik dan kerusakan oleh mikroba seperti bakteri, kapang, dan khamir (Seham et al. 2012). Analisis kadar abu dalam daun torbangun merupakan parameter kandungan mineral (bahan anorganik), didapatkan 13.48%. Kandungan bahan anorganik yang terdapat di dalam suatu bahan diantaranya kalsium, kalium, fosfor, besi, magnesium, yang biasa digunakan sebagai bahan baku untuk obat herbal (Luckoba et al. 2011).
Uji aktivitas antioksidan dari ekstrak daun torbangun menggunakan metoda DPPH. Analisis ini dinyatakan dengan IC50 sebagai indikator kemampuan
hambatan sebesar 50% dari sampel uji dengan menggunakan vitamin C sebagai standar. Vitamin C adalah komponen yang dapat mengurangi dan menetralkan
oksigen reaktif, seperti hidrogen peroksida (Seham et al. 2011). DPPH menghasilkan radikal bebas aktif bila dilarutkan dalam alkohol. Absorbansi berkurang ketika radikal bebas DPPH dihambat oleh antioksidan melalui donor hidrogen untuk membentuk DPPH stabil. Reaksi tersebut menyebabkan terjadinya perubahan warna dari ungu menjadi kuning.
Pada analisis fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak daun torbangun dengan etanol 96% mengandung senyawa flavonoid 1.612 % yang merupakan komponen aktif dan mempunyai aktifitas menghambat radikal bebas. Demikian juga kadar antioksidan quersetin yang terdapat dalam daun torbangun sebesar 0.02 mg/g juga berperan dalam hepatoprotektor tikus diabetes (Uma et al. 2011). Aktifitas biologis antioksidan salah satunya quersetin dilaporkan dapat menjaga fungsi pembuluh darah dan telah dianalisis secara invitro dan invivo (Ajay et al. 2007). Pada penelitian ini hasil uji antioksidan terhadap daun torbangun dengan metode DPPH didapatkan IC50 247.942 ppm dibandingkan standar vitamin C 1
ppm. Ekstrak Plectranthus amboinicus Lour mempunyai kemampuan menangkal radikal bebas DPPH dengan nilai IC50 207.57 ppm dan vitamin C 31,0 ppm
(Roshan et al. 2010, Bhattacharjee et al. 2011). Tabel 5 menunjukkan hasil
analisis aktifitas antioksidan serta uji daya hambat enzim α-glukosidase dalam daun torbangun.
Tabel 5. Hasil analisis ekstrak daun torbangun Sampel Parameter Hasil
Ekstrak etanol 96% simplisia Rendemen (b/b) 5.73 % Fenol 4.05 mg GAE /100 g Flavonoid (b/b) 1.612 % Quersetin 0.02 mg/g Aktivitas antioksidan DPPH-IC50 247.942 ppm Standar vitamin C 1 ppm Hambatan enzim α-glukosidase-IC50 >100 ppm Standar Glukobay 0.264 ppm
Pada uji daya hambat enzim α-glukosidase dalam daun torbangun, diperlukan ekstrak daun torbangun>100 ppm untuk dapat menghambat penyerapan glukosa seperti aktifitas standar Glukobay 0.264 ppm. Enzim α- glukosidase berasal dari Saccharomyces cerevisiae yang berisi enzim α-1,4- glukosidase (maltase) dan oligo-1,6-glukosidase (isomaltase) yang dapat menghidrolisis karbohidrat atau glikogen.
Mekanisme inhibisi dari flavonoid terhadap enzim α-glukosidase adalah
melalui ikatan hidroksilasi dan substitusi cincin pada struktur flavonoid. Prinsip
penghambatan ini menghasilkan penundaan hidrolisis karbohidrat dan absorbsi glukosa (Thu et al. 2013).
Identifikasi daun torbangun dilakukan menggunakan kromatografi gas- spektroskopi massa (GC-MS). Metode ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa, baik satu komponen maupun campuran. Penggunaan spektrometri massa dalam menentukan fragmentasi dan molekul serta mengidentifikasi
komponen yang terdapat dalam jumlah kecil. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Pengukuran waktu retensi berdasarkan waktu ketika sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum (Roshan 2010)
Kromatogram hasil analisis komposisi kimia daun, dahan dan akar torbangun (Coleus amboinicus Lour) dengan GCMS disajikan pada Gambar 8, 9, 10, sedangkan komposisi senyawa yang diduga sebagai penyusunnya disajikan pada Tabel 6, 7 dan 8.
Gambar 8. Kromatogram senyawa kimia daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) Pada analisis daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) terdapat 40 komposisi senyawa kimia. Senyawa kimia yang dikenal berjumlah 36 Area, Konsentrasi (%), waktu retensi (RT) dan puncaknya, terdapat pada Tabel 6. Tabel 6. Identifikasi senyawa kimia daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) Puncak Waktu Retensi Area Konsentrasi % Nama
1 3.257 68128694 11.73 Carbamic acid, monoammonium salt(CAS) Ammonium carbamate 2 12.185 34368476 5.92 l-Limonene
3 13.696 4607585 0.79 Heptanoic acid (CAS) Heptoic acid 4 13.766 5497507 0.95 Phenol, 3-ethyl- (CAS) m-Ethylphenol 5 14.226 6640283 1.14 2,3-DIHYDRO-BENZOFURAN 6 14.367 6554774 1.13 Nonanoic acid (CAS) Nonoic acid 7 14.793 8563953 1.47 Indolizine (CAS) Indolizin
8 14.983 14129689 2.43 NERIC ACID 9 15.250 4714871 0.81
10 15.619 9954531 1.71 (17.alpha.)-19-Norpregh-4,7-dien-20-yne 11 15.983 4817963 0.83 2H-Inden-2-one, 1,3-dihydro-, oxime
12 16.983 4644759 0.80 1-Dodecanol, 3,7,11-trimethyl- (CAS) Hexahydrofarnesol
13 17.242 12247958 2.11 Tetradecanoic acid (CAS) Myristic acid 14 17.417 6397081 1.10
15 17.570 22259578 3.83 2-Hexadecen-1-ol,3,7,11,15-tetra-
methyl [R-[R*,R*-(E)]]-(CAS) Phytol 16 17.800 21346823 3.67 2-Hexadecen-1-ol, 3,7,11,15-tetramethyl-
[R-[R*,R*-(E)]]- (CAS) Phytol 17 17.944 778937 1.34 2-Heptadecanone (CAS)2-
HEPTADECANON 18 18.225 5625729 0.97
19 18.302 48480440 8.35 Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic acid 20 18.417 11734046 2.02 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dibutyl
ester (CAS) Butyl phthalate 21 18.514 27308013 4.70 Oxacycloheptadec-8-en-2-one
(CAS) Ambrettolide 22 18.758 10396556 1.79
23 18.850 5727538 0.99 Octadecanoic acid, 2-propenyl ester (CAS) DI-(9-OCTADECENOYL)- GLYCEROL
24 19.358 27657030 4.76 HEPTADECENE-(8)-CARBONIC ACID-(1)
25 19.456 19532436 3.36 Octadecanoic acid (CAS) Stearic acid 26 19.525 9360048 1.61 Nonacosanol (CAS)
27 19.704 27176621 4.68 13-Oxabicyclo[10.1.0]tridecane (CAS) Epoxycyclododecane
28 19.862 8781625 1.51
29 19.993 13145282 2.26 12-Nitro-15-hexadecanolide
30 20.119 5893326 1.01 Octadecanoic acid, 2-propenyl ester (CAS) ALLYLOCTADECANOATE
31 21.207 10770559 1.85 9,12,15-Octadecatrien-1-ol (CAS) OCTADECA-9,12,15-TRIEN-1-OL
32 21.672 4994454 0.86 1-Eicosene (CAS) Cetyl ethylene
33 22.516 24947273 4.29 10,11-(4',5'-DIMEYHYLBENZO [3.2]PARACYCLOPHANE
34 22.885 22801745 3.93 1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2- ethylhexyl)ester CAS) Bis(2-ethylhexyl)
35 25.033 5634384 0.97 Octadecanoic acid,3-[(1-oxohexadecyl) oxy]-2-[(1-oxotetradecyl)oxy]propyl ester 36 25.765 24395952 4.20 Octadecanoic acid, 3-[(1-oxohexadecyl)
oxy]-2-[(1-oxotetradecyl)oxy]propylester 37 26.330 4997231 0.86 1,2-Cyclohexanediol, 1-methyl-,trans-
(CAS)trans-1-Methyl-1,cyclohexanediol 38 27.087 5788485 1.00 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene,2,6,10,
15,19,23- hexamethyl- (CAS) Squalene 39 30.633 6834966
580869216
1.18 100.00
Kromatogram hasil analisis komposisi kimia dahan bagian atas tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) dengan GCMS disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9. Kromatogram senyawa kimia dahan torbangun (Coleus amboinicus Lour) Pada analisis dalam dahan bagian atas tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) terdapat 15 komposisi senyawa kimia. Adapun 13 senyawa kimia yang dikenal Area, Konsentrasi (%), waktu retensi (RT) dan puncaknya terdapat pada Tabel 7.
Tabel 7. Identifikasi senyawa kimia dahan torbangun (Coleus amboinicus Lour) Puncak Waktu Retensi Area Konsentrasi % Nama
1 3.270 58438381 22.48 Formamide (CAS) Methanamide 2 3.412 34380083 13.22 12,13-Dimethyl-2,7-dioxa-
10-Diazatricyclo [4.4.4.0(1,6)]trans- tetradecan-12
3 3.714 6480572 2.49 acetone-oxime
4 4.335 8987400 3.46 2,3-Butanedione (CAS) Diacetyl
5 4.335 26368794 10.14 2-Propanone, 1-hydroxy- (CAS) Acetol 6 14.787 11789442 4.53 BENZENEPROPANOIC ACID, .
ALPHA.-(HYDROXYIMINO)- 7 16.175 10383130 3.99
8 17.242 8879430 3.42 Tetradecanoic acid (CAS) Myristic acid 9 17.568 5068598 1.95 2-Hexadecen-1-ol, 3,7,11,15-tetra
methyl-[R-[R*,R*-(E)]]-(CAS) Phytol
10 18.298 29929154 11.51 Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic acid 11 18.844 5477021 2.11 Octadecanoicacid,2-propenylester
(CAS)ALLYL OCTADECANOATE 12 19.350 18424408 7.09 9-Octadecen--ol,(Z)-(CAS) cis-9-
Octadecen-1-ol
13 19.450 13810815 5.31 Octadecanoic acid(CAS) Stearic acid 14 19.983 7006119 2.69 6-Nitro-cylohexadecane-1,3-dione 15 22.878 14548189
259971536
5.60 100.00
1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2- ethylhexyl)ester(CAS)Bis(2thylhexyl)
Kromatogram hasil analisis komposisi kimia akar tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) dengan GCMS disajikan pada Gambar 10.
Gambar 10. Kromatogram senyawa kimia akar tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour)
Pada analisis akar tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) terdapat 40 komposisi senyawa kimia. Adapun senyawa kimia yang dikenal berjumlah 39 Area, Konsentrasi (%), waktu retensi (RT) dan puncaknya, terdapat pada Tabel 8. Tabel 8. Identifikasi senyawa kimia akar torbangun (Coleus amboinicus Lour) Puncak Waktu Retensi Area Konsentrasi % Nama
1 2.517 144075478 28.45 Methanamine, N-methyl- (CAS) Dimethylamine
2 2.958 26111990 5.16 1-Propen-2-ol, acetate (CAS) Isopropenyl acetate
3 3.125 6236912 1.23 Acetic acid, methyl ester (CAS) Methyl acetate
4 3.458 2183627 0.43 Butanoic acid (CAS) n-Butyric acid 5 3.551 3995393 0.79 2,3-Butanedione (CAS) Diacetyl 6 4.255 49535920 9.78 Acetic acid (CAS) Ethylic acid 7 4.684 32462225 6.41 2-Propanone,1-hydroxy-(CAS)Acetol 8 7.145 7697989 1.52 9 7.504 5204729 1.03 Butanedial(CAS) Succinaldehyde 10 10.600 2173767 0.43 2(5H)-FURANONE 11 10.770 10952289 2.16 1,2-CYCLOPENTANEDIONE 12 12.411 12745541 2.52 2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3- methyl- (CAS) Corylon
13 13.107 23968355 4.73 Phenol,2-methoxy-(CAS) Guaiacol 14 13.333 16311477 3.22 Cyclopropyl carbinol
16 14.172 4566116 0.90 Benzene, (2-bromoethenyl)- (CAS) beta.-Bromostyrene
17 14.316 7099156 1.40 2-Methoxy-4-methylphenol
18 14.701 4729155 0.93 1H-Imidazole, 1-(1-oxopentyl)- (CAS)1-Valerylimidazole
19 15.199 5387714 1.06 Phenol, 4-ethyl-2-methoxy- (CAS) p-Ethylguaiacol
20 15.250 2237655 0.44 3-Methoxy-pyrocatechol
21 15.442 1960875 0.39 1H-Inden-1-one, 2,3-dihydro- (CAS) 1-Indanone
22 15.586 23827684 4.71 Phenol, 4-ethenyl-2-methoxy- 23 15.927 21442883 4.23 Phenol, 2,6-dimethoxy- (CAS)
2,6-Dimethoxyphenol
24 16.766 6370482 1.26 Benzene, 1,2,3-trimethoxy-(CAS) 1,2,3-Trimethoxybenzene
(CAS) Methylayringol
25 16.825 8144557 1.61 Phenol, 2-methoxy-4-(2-propenyl)- (CAS) Eugenol
26 17.418 4799848 0.95 Ethanone, 1-(2,6-dihydroxy
-4-methoxyphenyl)- (CAS) 2,6-Dihydroxy- 4-methoxyacetophenone 27 17.475 4704546 0.93 1,6-ANHYDRO-BETA- D-GLUCOPYRANOSE (LEVOGLUCOSAN 28 17.592 2295210 0.45 2-Propanone, 1-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)- (CAS) 1-(4-HYDROXY-3-METHOXY 29 17.779 12287607 2.43 4-METHYL-2,5-DI METHOXYBENZALDEHYDE 30 18.698 1914041 0.38 tetrahydroedulan A 31 18.828 6777860 1.34 Phenol,2,6-dimethoxy-4(2-propenyl)- (CAS) 4-Allyl-2,6-dimethoxyphenol 32 19.216 2997910 0.59 N-PHENYL-N'-FURALDEHYDE HYDRAZONE
33 19.401 3118024 0.62 2,4-Hexadienedioic acid, 3,4-diethyl-, dimethyl ester, (Z,Z)-9CAS)
CIS,CIS-DIETHYLMUCONIC
34 22.060 2152593 0.43 Oxacycloheptadec-8-en-2-one (CAS) Ambrettolide
35 22.141 9472476 1.87 Oxacycloheptadec-8-en-2-one (CAS) Ambrettolide
36 23.102 3089243 0.61 9-Octadecenal, (Z)- (CAS) CIS- OCTADEC-9-ENAL
37 23.712 3458485 0.68 Ferruginol
38 24.425 5226684 1.03 Triacontane (CAS) n-Triacontane
39 26.924 7078104 1.40 Tetratetracontane(CAS) n-Tetratetracontane 40 30.622 5432185 506432432 1.07 100.00 Tetratetracontane(CAS)n-Tetratetracontane
Hasil analisis kromatogram dalam daun, dahan bagian atas dan akar tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) menunjukkan kadar senyawa kimia n.Hexadecanoic acid (C16H32O2) yang berbeda, dan mempunyai aktivitas biologis
sebagai antioksidan, hipokolesterolemia, inhibitor hemolysis (pecahnya membran eritrosit, sehingga hemoglobin bebas plasma). Senyawa kimia Octadecadienoic acid (C18H32O2, berperan dalam perlindungan sel -pankreas. Demikian juga
senyawa senyawa Tetradecanoic acid (CAS) Myristic acid (C14H28O2) mempunyai
aktiivitas biologis sebagai antioksidan, preventif pada kanker dan hipokolesterolemik (Uma et al. 2011).
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya bahwa aktivitas biologis senyawa yang terdapat dalam daun berperan sebagai antioksidan, dan daun lebih banyak tersedia, maka sampel pada penelitian ini menggunakan daun.
SIMPULAN
Kromatogram hasil analisis daun, dahan bagian atas dan akar tanaman torbangun (Coleus amboinicus Lour) mengandung senyawa kimia n.Hexadecanoic acid (C16H32O2), Octadecadienoic acid (C18H32O2), Tetradecanoic
acid (CAS) Myristic acid (C14H28O2). Pada pengujian antioksidan dalam ekstrak
etanol daun dengan menggunakan metode DPPH memiliki nilai IC50 247.942 ppm
dan mempunyai daya hambat enzim α-glukosidase pada nilai IC50 >100 ppm.
Ekstrak etanol daun torbangun memiliki kemampuan sebagai antioksidan dan
daya hambat enzim α-glukosidase sehingga berpotensi menghambat hidrolisis pada rantai 1,4 dan 1,6-oligosakarida menjadi glukosa dan dapat berperan sebagai senyawa antihiperglikemik.
5. EFEK EKSTRAK DAUN TORBANGUN (Coleus amboinicus Lour) SEBAGAI ANTIOKSIDAN PADA HATI TIKUS DIABETES
Trini Suryowati1, Rimbawan2, M Rizal M Damanik2, Maria Bintang3, Ekowati Handharyani4.
1Departemen Biokimia FK UKI Jakarta 13630, Indonesia. 2Departemen Gizi Masyarakat FEMA IPB Bogor 16680, Indonesia
3Departemen Biokimia FMIPA IPB Bogor 16680, Indonesia. 4Devisi Patologi FKH IPB Bogor 16680, Indonesia
Abstrak
Sistem antioksidan enzimatis memegang peran penting pada pertahanan sel dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas oksigen selama proses metabolisme. Enzim-enzim tersebut menjaga jaringan dari aktivitas senyawa oksigen reaktif yang dapat menyebabkan stres oksidatif pemicu komplikasi pada keadaan diabetes. Coleus amboinicus Lour dikenal dengan nama torbangun, telah dipakai untuk meningkatkan produksi ASI oleh suku Batak. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol daun Coleus amboinicus Lour pada stres oksidatif tikus diabetes. Penelitian ini menggunakan 30 ekor tikus jantan galur Spargue Dawley yang dibagi menjadi 6 kelompok yaitu satu kelompok kontrol positif, satu kelompok kontrol negatif dan empat kelompok tikus diabetes diberi perlakuan. Pemberian oral ekstrak dengan dicekok. Kelompok kontrol positif dan negatif diberi akuades, kelompok perlakuan diberi ekstrak etanol daun torbangun dosis 620 mg/kg BB dan 930 mg/kg BB; metformin hidroklorida dosis 62.5 mg/kg BB; quersetin dosis 15 mg/kg BB tikus diabetes tipe 2 induksi Streptozotocin selama 14 hari. Metode pengukuran parameter yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan prosedur dalam kit pemeriksaan glukosa darah (Accu-Chek Active) dan kit untuk SOD, katalase, GPx dan glukokinase. Evaluasi histopatologi dilakukan terhadap perubahan sel endokrin pankreas di dalam pulau Langerhans menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) dosis T1: 620 mg/kg BB dapat menurunkan kadar glukosa darah dan MDA serta kenaikan kadar antioksidan enzimatis katalase pada tikus diabetes (p<0.05). Ekstrak etanol daun torbangun dosis T1 mempunyai potensi dapat melindungi sel endokrin pankreas yang terjadi pada tikus model diabetes yang diinduksi STZ. Aktivitas antioksidan quersetin dalam daun ekatrak etanol dapat berperan sebagai antihiperglikemia pada tikus diabetes tipe 2.
PENDAHULUAN
Penelitian epidemiologi telah melaporkan bahwa tingginya konsumsi sayuran dan buah berbanding terbalik dengan resiko penyakit kronis seperti penyakit jantung, asma, diabetes, kegemukan dan kanker, karena antioksidan non enzimatis banyak ditemukan di dalamnya (Barth et al. 2005). Pembentukan radikal bebas endogen dan eksogen dapat menyebabkan kerusakan sel modifikasi molekul termasuk DNA, membran lipid, protein. Perlindungan dari antioksidan enzimatis seperti superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutathionn peroksidase sangat diharapkan agar tidak terjadi kerusakan sel yang berkelanjutan (Oszmianski et al. 2007). Salah satu antioksidan quersetin yang terdapat dalam sayuran atau buah dilaporkan berpotensi menangkal radikal bebas. Potensi tersebut ditunjukkan dengan adanya gugus hidroksil pada cincin B dan C, dan dapat menangkal radikal hidroksil, peroksil dan anion superoksida (Gerhauser 2008).
Diabetes Melitus (DM) berasal dari bahasa Latin diabetes berarti pancuran dan melitus berarti madu merupakan suatu kelainan metabolisme dalam tubuh yang ditandai dengan timbulnya hiperglikemia akibat kelainan sekresi insulin, kerja insulin atau kedua-duanya. Hiperglikemia menyebabkan autooksidasi glukosa, glikasi protein dan aktivasi jalur metabolisme poliol yang mempercepat pembentukan radikal bebas. Reaksi molekuler yang terjadi di beberapa jaringan mengakibatkan ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan peningkatan produksi radikal bebas. Radikal bebas tersebut menyebabkan stres oksidatif dan ditandai dengan peningkatan kadar malon dialdehide (MDA) sebagai indikator terjadinya penurunan kadar antioksidan enzimatis dalam tubuh (Jameson 2010).
Daun torbangun telah dipakai untuk meningkatkan air susu ibu pada suku Batak (Damanik et al. 2001, 2004, 2006; Damanik 2009, Santosa et al. 2002) dan pengobatan tradisional pada alergi kulit, diare, demam dan hepar (Luckoba et al. 2006). Ekstrak daun torbangun berperan sebagai senyawa yang dapat menurunkan kadar glukosa darah dengan memperbaiki kelainan metabolisme karbohidrat, lemak dan meningkatkan konsentrasi kalsium intraseluler pada tikus. Mekanisme melalui sekresi insulin dan enzim-enzim yang berperan dalam metabolisme glukosa (Viswanathaswamy et al. 2011). Namun masih diperlukan bukti-bukti ilmiah tentang peran dan mekanisme kerja bahan aktifnya dalam menunjang kesehatan (Santosa dan Triana 2005). Penurunan kadar glkukosa dalam darah pada tikus DM karena terdapat komponen aktif dari poliphenols sebagai antioksidan diantaranya alkaloids, terpenoids, glikosida, saponin (Subhas et al. 2009). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek ekstrak daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) sebagai antioksidan non enzimatis pada hati tikus diabetes.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan: daun torbangun didapat dari tanaman di daerah Cibeureum Bogor, dipetik yang berwarna hijau segar 4-5 helai daun bagian atas setelah umur 2 bulan. Dicuci 3 kali dengan air dan dibilas dengan aquades, dikeringkan sebelum dilakukan maserasi.
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 ekor tikus jantan dengan galur Sprague Dawley yang berumur 8 minggu dengan kisaran berat badan 200±10 g diperoleh dari BPOM Jakarta. Kondisi kadang: ventilasi dalam kandang cukup, suhu udara pada suhu kamar (26o-28oC), dan cahaya terkontrol dengan siklus 12 jam siang, 12 jam malam dan diberikan pakan standar serta minum secara ad libitum. Streptozotocin (STZ-Sigma, Jerman), metformin hidroklorida, quersetin, ketamin, xylazin, larutan buffer neutraformalin (BNF) alkohol 70, xilol, parafin, aquadest, pewarna hematoksilin-eosin (HE), pewarna imunohistokimia, phosphat buffer saline (PBS) pH 7.4, aquadest, bahan-bahan kimia analisis.
Bahan kimia yang digunakan yaitu akuades, etil alkohol 96%, 0.6 M asam sulfat 100 mL, 28 mM natrium fosfat 100 mL, 4 mM amonium molibdat 100 mL, p-nitrofenil α–D-glukopiranosida (p-NPG)
Alat-alat yang digunakan: labu ekstraksi Soxhlet (Pyrex), corong pemisah (Pyrex), kertas saring kasar, kertas saring Whatman no.1, rotary evaporator (Janke dan Kunkel RV 06 - ML), timbangan analitik (Ohaus P213), dan alat-alat gelas, spoit, kandang tikus dan peralatannya, peralatan bedah, tissue cassette, inkubator, tissue processor, mikrotom, object glass, cover glass, digital blood glucose meter dan mikroskop, timbangan, micropipet, alat-alat analisis, Spektrofotometri.
Persiapan Tikus Diabetes
Tikus model diabetes disiapkan dengan cara tikus puasa selama semalam, kemudian diinduksi dengan Streptozotocin (STZ) secara intraperitoneal dengan dosis tunggal sebesar 50 mg/kg BB yang dilarutkan dalam 1 ml aquadest dan diasamkan dengan 0.01 M buffer sitrat dingin (pH: 4.5). Keberhasilan induksi ditentukan dengan mengukur glukosa darah pada hari ke-2 setelah pemberian STZ. Pada hari pertama tikus di induksi STZ diberi glukosa 5% selama 1 hari untuk menghindari efek hipoglikemi. Pasca induksi STZ setelah 3 hari, tikus diabetes dibagi secara random, dengan pertimbangan yang mengandung glukosa dalam darah tinggi dipisahkan tersendiri untuk menjaga terjadi koma adisosis. Pemberian suspensi ekstrak daun torbangun secara oral, menggunakan sonde lambung pada tikus dengan dengan dosis 620 mg/kg BB dan 930 mg/kg BB selama 14 hari (Sachin et al. 2009).
Perlakuan pada Hewan Coba Diabetes
Sejumlah 30 ekor tikus jantan diletakkan masing-masing satu ekor dalam satu kandang dan dikelompokkan menjadi 6 kelompok perlakuan dengan masing- masing kelompok perlakuan diwakili oleh 5 ekor tikus. Pada kelompok 1 (normal) dan 2 (diabetes) masing-masing menerima aquadest steril 5 ml/kg BB. Kelompok 3 (diabetes) diberi ekstrak daun torbangun dosis 620 mg/kg BB (T1) dan
kelompok 4 (diabetes) diberi ekstrak daun torbangun dosis 930 mg/kg BB (T2). Ekstrak daun torbangun menjadi suspensi dengan cara 0.3 % berat/volume NaCMC pada kelompok 3 dan 4 selama 14 hari setiap pukul 08.00 - 09.00 WIB (Viswamathaswamy et al. 2011). Kelompok 5 (diabetes) diberi Metformin hidroklorida dengan dosis: 62.5 mg/kg BB selama 14 hari (Shareef et al. 2013). Kelompok 6 (diabetes) diberi quersetin dengan dosis 15 mg/kg BB (Atef 2011).
Pengukuran Berat Badan dan Kadar Glukosa Darah
Pengukuran kadar glukosa darah dengan menggunakan glukometer (Accu Check Active) dilakukan pada hari ke- 0, 1, 4, 7, 10, 14 pasca induksi STZ. Pengukuran dilakukan pada pagi hari sebelum pemberian pakan. Sampel darah diperoleh dari ujung ekor tikus dan pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada semua tikus dari setiap kelompok. Hasil yang didapat dirata-ratakan untuk menggambarkan nilai kadar glukosa dalam darah setiap kelompok dengan satuan mg/dL. Penimbangan berat badan tikus pada hari yang sama dengan pengukuran glukosa darah tikus (Viswanathaswamy et al. 2011).
Pengambilan Organ Hati dan Pankreas
Pada akhir penelitian (hari ke-15 pasca induksi STZ) semua tikus dianastesi general dengan campuran ketamin: 90 mg dan xylazine: 10 mg. Nekropsi dilakukan dengan menyayat kulit dan otot abdominal hingga rongga perut terbuka. Darah tikus dikeluarkan hingga detak jantung terhenti dan selanjutnya dilakukan pengambilan organ hati dan pankreas difiksasi dengan buffer neutral formalin (BNF) 10% dilanjutkan dengan pembuatan preparat histopatologi dan persiapan analisis organ hepar.
Pengamatan jaringan pankreas dilakukan dibawah mikroskop menggunakan perbesaran 40x dengan dua puluh lapang pandang. Pengamatan terhadap potongan jaringan pankreas khususnya pada sel beta yang diwarnai dengan imunohistokimia pada sel beta yang terlihat berwarna coklat.
Organ hepar dibuat homogen (5% berat/volume) dengan larutan buffer K2PO4 (50
mM, pH 7.4), menggunakan alat homogeniser. Kemudian disentrifuse pada 3000 rpm selama 10 menit, didapat supernatan. Selanjutnya supernatan akan dianalisis kadar katalase (CAT), superoksida dismutase (SOD), gluthation peroksidase (GPx), malon dialdehida (MDA) dengan analisa asam thiobarbiturat reaktive substans (TBARS) (Asok et al. 2010).
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Analisis statistik menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS versi 15. Data hasil pengukuran parameter yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan 95% untuk melihat ada tidaknya pengaruh perlakuan, apabila terdapat keragaman dilanjutkan dengan uji beda Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengukuran glukosa darah pada hari ke 2 setelah penyuntikan STZ menunjukkan peningkatan kadar glukosa darah yang berbeda antar tikus. Tikus dinyatakan hiperglikemia apabila kadar glukosa dalam darah > 126 mg/dL (Jung et al. 2011). STZ dipakai sebagai senyawa diabetogenik karena dapat merusak sel beta pankreas dan menghambat ekskresi insulin ke dalam pembuluh darah. Mekanisme yang terjadi karena alkilasi DNA pankreas maka terjadi kerusakan DNA dan terjadi penurunan ATP serta menghambat sekresi insulin (Krishnaveni dan Challa 2013). Kekurangan insulin akan mengakibatkan glukosa tidak dapat masuk kedalam sel untuk diubah menjadi ATP, sehingga terjadi peningkatan glukoneogenesis dan menyebabkan hiperglikemia (Dehghan et al. 2013). Pengukuran glukosa darah dilakukan pada hari 1, 4, 7, 10, 14 pasca diinjeksi STZ. Tabel 9, menjelaskan efek ekstrak daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) pada perubahan glukosa darah tikus normal dan diabetes galur Spargue Dawley selama 14 hari perlakuan.
Tabel 9. Perubahan kadar glukosa darah pada tikus normal dan diabetes galur Spargue Dawley.
Perlakuan Glukosa awal mg/dL Glukosa akhir mg/dL N D D-T1 D-T2 D-Mt D-Q 90.800 ± 5.718c 162.380 ± 50.381b 221.600 ± 106.971b 340.600 ± 53.017a 404.400 ± 22.345a 333.200 ± 80.819a 94.800 ± 3.421c 172.800 ± 53.336abc 112.800 ± 25.994bc 245.600 ± 115.833a 213.200 ± 116.294ab 242.600 ± 113.015a P-value <0.0001** 0.0218*
Keterangan : **) significant pada P<0.01 , *)significant pada P<0.05
N: normal, D: diabetes, T1: ekstrak torbangun dosis 620 mg/kgBB, T2: ekstrak torbangun dosis 930 mg/kgBB, Mt:metformin, Q:Quersetin
Angka yang diikuti huruf superscript yang sama dalam satu kolom menunjukkan antar perlakuan tidak beda nyata (p>0.05).
Pada penelitian ini terjadi penurunan kadar glukosa darah pada kelompok tikus yang mendapat ekstrak daun torbangun dosis: 630 mg/kgBB (T1), dosis: 930 mg/kgBB (T2), obat metformin hidroklorida dosis: 62.5 mg/kgBB dan standart antioksidan quersetin dosis:15 mg/kgBB. Penurunan ini disebabkan karena salah satu gugus aktif yaitu senyawa quersetin berperan sebagai antioksidan dan dapat menangkap radikal bebas sehingga menjadi tidak aktif. Menurunnya kadar radikal bebas menyebabkan reseptor insulin dapat bekerja dengan baik sehingga glukosa dapat masuk kedalam sel dan terjadi metabolisme glikolisis, glikogenesis serta menurunnya glukoneogenesis.
Analisis antioksidan enzimatis dilakukan pada hati tikus normal dan diabetes yaitu super oksida dismutase (SOD), catalase (CAT) dan glutathion pereduksi (GPx). Terdapat penurunan kadar antioksidan enzim tersebut pada tikus diabetes, setelah 14 hari perlakuan. Pada tikus diabetes terjadi stres oksidasi dan ditunjukkan dengan peningkatan produksi H2O2 dan perubahan kadar antioksidan
enzimatis. Pada penelitian ini tikus diabetes yang diberi ekstrak daun torbangun terjadi peningkatan kadar antioksidan enzimatis dan penurunan glukosa darah, hal ini menunjukkan mekanisme kontrol kadar glukosa darah. Enzim SOD mengkatalisis reaksi dismutasi radikal superoksida, dan catalase adalah suatu haemoprotein yang mengkatalisis reaksi reduki H2O2 menjadi H2O serta menjaga
jaringan dari radikal hidroksil. Enzim gluthation pereduksi (GPx) yang mengandung Se berperan pada reaksi oksidasi dan reduksi perubahan H2O2
menjadi H2O. Efek ekstrak daun torbangun meningkatkan aktivitas antioksidan
enzimatis dalam hati tikus normal dan diabetes terdapat pada Tabel 10.
Tabel 10. Efek ekstrak daun torbangun (Coleus amboinicus Lour) pada perubahan antioksidan enzimatis dalam hati tikus normal dan diabetes galur Sprague Dawley.
Tikus SOD Catalase GPx
N D D-T1 D-T2 D-Mt D-Q 0.184 ± 0.066a 0.357 ± 0.115a 0.253 ± 0.173a 0.229 ± 0.105a 0.233 ± 0.061a 0.207 ± 0.021a 0.058 ± 0.009c 0.073 ± 0.007ab 0.065 ± 0.010bc 0.063 ± 0.002bc 0.071 ± 0.009ab 0.079 ± 0.011a 69.14 ± 3.04a 86.64 ± 27.58a 71.90 ± 28.87a 65.74 ± 20.06a 77.64 ± 13.57a 62.33 ± 7.66a P-value 0.1665 0.0093** 0.4113
Keterangan : **) significant pada P<0.01 , *)significant pada P<0,05
N: normal, D: diabetes, T1: ekstrak torbangun dosis 620 mg/kgBB, T2: ekstrak torbangun dosis 930 mg/kgBB, Mt:metformin, Q:Quersetin
Angka yang diikuti huruf superscript yang sama dalam satu kolom menunjukkan antar perlakuan tidak beda nyata (p>0.05).
Pada tikus diabetes terjadi stres oksidatif karena tingginya radikal bebas melebihi antioksidan enzimatis, dan ditunjukkan dengan peningkatan kadar malondialdehida (MDA). Kelompok tikus diabetes memiliki kadar MDA yang tinggi dibandingkan dengan kelompok tikus normal, karena terjadi peroksida lipid dan menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Sedangkan pada tikus diabetes yang diberi ekstrak daun torbangun terjadi penurunan kadar MDA, hal ini dapat dilaporkan bahwa dalam ekstrak daun tersebut mengandung antioksidan yang salah satunya adalah quersetin dan berperan sebagai peredam radikal bebas (Atef 2011). Potensi ekstrak etanol daun torbangun dalam menurunkan kadar glukosa darah dan kadar MDA dalam hati tikus diabetes, menjelaskan bahwa terjadi penurunan kadar radikal bebas, dan peningkatan antioksidan enzimatis dalam tubuh tikus diabetes galur Sprague Dawley yang diinduksi Streptozotocin (Trini et al. 20151). Flavonoid yang terdapat dalam daun torbangun merupakan antioksidan