Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari 2014 – Januari 2015. Pembuatan ekstraksi dan analisis di Lab. Departemen Gizi Masyarakat FEMA IPB, Lab. Biokimia Fakultas Kedokteran UI, Lab. Terpadu Pusat Studi Satwa Primata IPB, Lab. Biofarmaka, Lab. Pengujian Hasil Hutan Pusat Litbang Hasil Hutan Bogor, Lab. Patologi FKH IPB dan Rumah Sakit Hewan IPB.
Bahan dan Alat
Daun torbangun yang digunakan dalam penelitian ini berumur dua bulan dan diperoleh dari tanaman di daerah Cibeureum Bogor (Sajimin et al. 2011). Hewan coba dalam penelitian ini adalah 30 ekor tikus putih jantan galur Sprague-Dawley berumur 8 minggu dengan kisaran berat badan 180-200 g yang diperoleh dari BPOM Jakarta (Jung et al. 2011). Tikus ditempatkan dalam kandang dengan kondisi sebagai berikut: ventilasi dalam kandang cukup, suhu udara pada suhu kamar (26o-28oC), dan cahaya terkontrol dengan siklus 12 jam siang, 12 jam malam dan diberikan pakan standar serta minum secara ad libitum. Streptozotocin (STZ-Sigma, Jerman): merupakan senyawa hasil sintesis dari Streptomycetes achromogenes yang berfungsi sebagai antibakteri spektrum luas, antitumor, bahan karsinogenik dan secara selektif menghancurkan sel- pada pulau Langerhans. Metformin: obat antihiperglikemik pada diabetes tipe 2 (Juei- Tang et al. 2006). Quersetin: antioksidan standar yang dapat meredam radikal bebas (Raghuramulu et al. 2003)
Anestesi memakai ketamin dan xylazin.
Bahan laboratorium lain: alkohol 96%, magnesium chloride, 4-chlorophenol, lipase, glycerol-kinase, glycerol-3-phosphate-oxidase, peroxidase, 4-amino- antipyrine.
Adapun alat-alat yang digunakan meliputi: spuit, kandang tikus, tempat pakan dan botol minum tikus, penjepit (block holder), sonde lambung, timbangan, gelas ukur, gelas kimia, alat titrasi, gunting, pinset, sarung tangan, kertas saring dan peralatannya, peralatan bedah, Accu Check, timbangan, micropipet, Elisa (Sigma-Aldrich), GCMS, Spektrofotometer.
Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini terdiri atas tiga tahap yaitu: (1) uji komponen kimia dan zat gizi dalam daun torbangun; (2) uji daya hambat enzim α-glukosidase dan aktivitas antioksidan dalam daun torbangun; (3) uji aktivitas ekstrak daun torbangun pada stres oksidatif tikus diabetes yang meliputi: (3.1) uji pengaruh konsumsi ekstrak daun torbangun pada kadar glukosa darah tikus diabetes; (3.2) uji pengaruh konsumsi ekstrak daun torbangun pada antioksidan enzimatis, profil lipid dan enzim glukokinase tikus diabetes; (3.3.) uji pengaruh konsumsi ekstrak daun
torbangun pada sel -pankreas tikus diabetes. Bagan alir tahap penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Bagan alir tahap penelitian
Penelitian tahap 1: Karakteristik komponen daun torbangun
Tujuan penelitian tahap 1 untuk mengetahui karakteristik simplisia, komponen kimia dan analisis proksimat daun torbangun.
Preparasi Bahan
Daun torbangun dicuci, dikeringkan dengan freeze dryer dan dihaluskan dengan grinder kemudian diayak dengan ukuran 60 mesh. Daun torbangun yang telah halus dilakukan maserasi. Bubuk daun torbangun sebanyak 70 gram dilarutkan dalam 600 ml etil alkohol 96%/3 jam (2 kali). Pelarut diuapkan dengan rotary evaporator dan dipekatkan dengan pemanas air suhu 60oC (Viswanathaswamy et al. 2011). Hasil yang didapat adalah ekstrak kental dan disimpan dalam suhu 4o- 8oC (Uma et al. 2011).
Analisis karakterisasi simplisia
Analisis dengan metode SNI 01-2891-1992 untuk analisis zat gizi yang terkandung dalam daun torbangun: kadar air, abu, larut air, larut etanol, protein, karbohidrat, lemak
Analisis
berat badan dan kadar glukosa- darah Analisis sel hati: MDA, SOD, GPx, Cat. Analisis serum darah: kolesterol, HDL, TG, glukokinase Analisis sel pankreas Aktivitas α glukosidase Penelitian tahap 1
Karakteristik komponen daun torbangun Analisis proksimat
kadar : air, abu, lemak, protein, karbohidrat, serat
Analisis GCMS
Penelitian tahap 2
Ekstraksi daun torbangun
Aktivitas antioksidan
Penelitian tahap 3
Aktivitas ekstrak daun torbangun pada stres oksidatif tikus diabetes
Analisis GCMS
Daun, batang bagian atas dan akar tanaman torbangun dianalisis dengan kromatografi gas-spektrometri masa/GC-MS (GCMS-QP2010 Shimadzu), dengan kolom RTX-MS (5% difenil-95% dimetil polisiloksan), panjang 30 meter, diameter dalam 0,25 mm, dengan kondisi operasional: suhu kolom awal 60 °C, suhu akhir 280 °C dengan kenaikan 10 °C/menit, suhu injektor 280 °C, suhu detektor 270 °C, gas pembawa Helium, jenis pengion EI (Electron Impact), volume sampel yang diinjeksikan 0,1 µL.
Penelitian tahap 2: Ekstraksi daun torbangun
Penelitian tahap 2 bertujuan untuk mengkaji daya hambat aktivitas enzim
α-glukosidase dan aktivitas antioksidan dalam ekstrak daun torbangun. Aktivitas Enzim α-glukosidase
Pada analisis uji daya hambat aktivitas enzim α-glukosidase memakai substrat p-nitrofenil α–D-glukopiranosida (p-NPG) dan enzim α-glukosidase. Nilai absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400
nm, dan memakai tablet glukobay sebagai kontrol positif. Aktivitas enzim α
glukosidase dinyatakan IC50 (Sancheti et al. 2009). Aktifitas antioksidan.
Pada penetapan aktifitas antioksidan, ekstrak daun torbangun sebanyak 300 mg dilarutkan dalam 3 ml larutan campuran (0.6 M asam sulfat 100 mL, 28 mM natrium fosfat 100 mL dan 4 mM amonium molibdat 100 mL). Standar yang dipergunakan adalah vitamin C. Nilai absorbansi sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 695 nm, dan aktivitas antioksidan dinyatakan IC50 (Praveena and Pradeep 2012).
Penelitian tahap 3: Aktivitas ekstrak daun torbangun pada stres oksidatif tikus diabetes
Persiapan tikus diabetes
Tikus model diabetes disiapkan dengan cara tikus dipuasakan selama semalam, kemudian diinduki dengan Streptozotocin (STZ) secara intraperitoneal dengan dosis tunggal sebesar 50 mg/kg BB yang dilarutkan dalam 1 ml aquades dan diasamkan dengan 0,01 M buffer sitrat dingin (pH : 4.5). Keberhasilan induksi ditentukan dengan mengukur kadar glukosa darah pada hari ke-2 setelah pemberian STZ. Apabila kadar glukosa darah tikus > 126 mg/dL termasuk dalam tikus percobaan. Pada hari pertama tikus di induksi STZ diberi glukosa 5% selama 1 hari untuk menghindari efek hipoglikemi. Setelah 3 hari pasca induksi STZ, tikus diabetes dibagi secara acak, dengan pertimbangan yang glukosa darahnya tinggi dipisahkan tersendiri untuk menjaga terjadi koma asidosis (Jung et al. 2011).
Perlakuan pada hewan coba diabetes
Tikus dikelompokkan menjadi 6 kelompok perlakuan dengan masing- masing kelompok perlakuan diwakili oleh 5 ekor tikus. Pada kelompok 1 (normal) dan 2 (diabetes) masing-masing menerima aquades steril 5 ml/kg BB. Kelompok 3 (diabetes) diberi ekstrak daun torbangun dosis T1 : 620 mg/kg BB dan kelompok 4 (diabetes) diberi ekstrak daun torbangun dosis T2 : 930 mg/kg BB. Ekstrak daun torbangun menjadi suspensi dengan 0.3 % berat/volume NaCMC (Viswamathaswamy et al. 2011). Kelompok 5 (diabetes) diberi Metformin hidroklorida yang dilarutkan dalam aquades dengan dosis : 62.5 mg/kg BB selama 14 hari (Shareef et al. 2013). Kelompok 6 (diabetes) diberi antioksidan quersetin yang dilarutkan dalam aquades dosis 15 mg/kg BB. Gambar 7 menunjukkan alir pelaksanaan pada hewan coba (Atef 2011).
Kel. 1 (kontrol normal), tikus tidak DM, diberi aquades steril selama 14 hari Kel. 2 (kontrol diabetes) tikus DM, diberi aquades steril selama 14 hari Kel 3. Tikus DM, diberi ekstrak 620 mg/kg BB selama 14 hati Kel 4. Tikus DM diberi ekstrak 930 mg/kg BB selama 14 hari Kel 5. Tikus DM diberi Metformin hidroklorida 62.5 mg/kg BB selama 14 hari Kel 6. Tikus DM diberi Quersetin 15 mg/kg BB selama 14 hari
Gambar 7. Pelaksanaan penelitian pada hewan coba Tikus galur Sprague Dawley, 30 ekor
Adaptasi 7 hari Persiapan tikus diabetes
Pengelompokan
Pengukuran berat badan dan kadar gula darah tikus pada hari ke 0, 1, 4, 7, 10, 14.
Pada hari ke 15 : nekropsi, analisa hati : SOD,Catalase, GPx, MDA;
Pengukuran berat badan dan kadar glukosa darah tikus
Pengukuran berat badan dengan menggunakan timbangan elektrik dan kadar glukosa darah pada pagi hari sebelum pemberian pakan dengan menggunakan glukometer (Accu check) dilakukan pada hari ke- 0, 1, 4, 7, 10, 14 pascainduksi STZ. Sampel darah didapat dari ujung ekor tikus dan hasil yang didapat dirata-ratakan untuk menggambarkan nilai kadar glukosa darah kelompok dengan satuan mg/dL (Viswanathaswamy et al. 2011).
Pengambilan organ hati dan pankreas
Pada akhir penelitian (hari ke-15 pasca induksi STZ) semua tikus dianastesi general memakai campuran Ketamin: 90 mg dan Xylazine: 10 mg. Analisis hati tikus dilakukan untuk mengetahui kadar MDA dan antioksidan enzimatis katalase, SOD, GPx. Analisa jaringan pankreas untuk mengetahui sel - pankreas (Asok et al. 2010).
Analisa enzim Super Oksida Dismustase (SOD)
Pengukuran kadar SOD dilakukan dengan cara: 0.06 ml serum direaksikan dengan campuran yang terdiri atas 2.70 ml bufer Natriumkarbonat yang mengandung 0.1 mM EDTA (pH 10), 0.06 ml xantin 10 mM, 0.03 ml bovine serum albumin (BSA) 0.5%, 0.03 ml NBT 2.5 mM. Kemudian ditambahkan xantin oksidase (0.04 unit). Absorbansi yang dihasilkan setelah 30 menit diukur pada panjang gelombang 560 nm. Kadar SOD (%) dihitung dengan menggunakan persamaan: (B-A/B) x 100%; A adalah absorbansi larutan sampel dan B adalah absorbansi larutan kontrol (Kotan et al. 2011).
Analisis enzim GPx
Pengukuran kadar enzim GPx dilakukan dengan caraμ β00 l serum
ditambahkan β00 l buffer phosphat 0,1 M pH 7.0 yang mengandung 0,1 mM EDTA, β00 l glutation tereduksi (GSH) 10 mM dan β00 l enzim glutation
reduktase. Kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC, ditambahkan
β00 l NADPH 1,5 mM dan diinkubasi lagi selama tiga menit pada suhu yang
sama, ditambahkan β00 l HβOβ 1.5 mM. Sampel diukur absorbansinya diantara waktu satu sampai dua menit dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm (Kotan et al. 2011)
Analisis enzim Catalase
Analisa catalase (CAT) dengan cara: 0.1 ml jaringan homogenate dicampur dengan 2.6 ml dari 25 mM K2PO4 pada pH 7.0 selama 15 menit,
ditambah 0.1 ml 10 mM H2O2. Penurunan penyerapan dari 0.45 ke 0.4
menunjukkan jumlah aktivitas enzim. Perubahan dalam µmol H2O2/mg protein
pada pH 7.0 dan suhu 25oC. Enzim catalase mengkalisis hidrolisis H2O2 menjadi
H20 dan dibaca pada = β54 nm (Asok et al. 2010). Analisis kadar MDA
Sampel 1,8 gram dipotong kecil-kecil lalu digerus dalam mortar dingin yang diletakkan di atas blok es. Ditambahkan 1 mL NaCl 0.9%. Pindahkan ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit,
L TCA. Pada setiap penambahan reagen, larutan dihomogenkan dengan vortex,
lalu disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Larutan diinkubasi pada air dengan suhu 100oC selama 30 menit dan dibiarkan pada suhu ruangan. Sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 535 nm (Asok et al. 2010).
Analisis Serum Darah Tikus
Parameter biokimia yang dianalisis dalam serum darah tikus adalah kolesterol, HDL, TG dan glukokinase menggunakan standart kit diagnostik komersial (Torrico et al. 2006; Daisy dan Rajathi 2009).
Analisis sel β-pankreas
Parameter pengamatan hasil pewarnaan Imunohistokimia pada potongan jaringan pankreas tikus semua kelompok diamati jaringan pankreas termasuk kerusakan sel. Pengamatan terhadap potongan jaringan pankreas khususnya pada sel beta yang diwarnai dengan diamino benzidin dilakukan dengan melihat gambaran distribusi sel endokrin pankreas pulau Langerhans pada tikus diabetes induksi streptozotocin (Pessin and Saltiel. 2010).
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Data dianalisis dengan : Sidik Ragam ANOVA pada selang kepercayaan 95% untuk melihat ada tidaknya pengaruh perlakuan, apabila terdapat keragaman dilanjutkan dengan uji beda Duncan.
Ethical Clearance
Persetujuan ethical clearance diperoleh dari Komosi Etik Rumah Sakit Hewan Institut Pertanian Bogor nomor : 04-2014 RSH-IPB, yang merupakan ijin penggunaan hewan coba sebagai model penelitian. Hewan coba yang digunakan dalam penelitian laboratorium diharapkan diperhatikan kenyamanan fisiknya, diperlakukan dengan baik, pemberian makanan dan minuman memadai. Pembiusan untuk menghilangkan rasa sakit memakai campuran Ketamin: 90 mg dan Xylazine: 10 mg dengan cara diinjeksi intra peritoneal.
4. IDENTIFIKASI KOMPONEN KIMIA DAN AKTIVITAS