Karakteristik semen segar anjing Retriever
Karakteristik semen berbeda bergantung pada breed, individu, menejemen, teknik koleksi dan frekuensi dari koleksi semen. Pada penelitian ini, semen segar anjing Retriever mempunyai karakteristik yang bagus dan memenuhi syarat pembekuan semen anjing, seperti ditunjukkan pada Tabel 3.
Table 3 Karakteristik semen segar anjing Retriever Karakteristik semen Rataan Makroskopis
Volume (ml) fraksi ke dua Warna Konsistensi pH Mikroskopis Motilitas spermatozoa (%) Spermatozoa hidup (%) Normalitas spermatozoa (%) Konsentrasi spermatozoa (106 ml-1) 2.60 ± 0.55 Putih susu Encer 6.40 ± 0.07 76.11 ± 4.59 82.42 ± 5.35 93.02 ± 2.14 446.11 ± 77.91
Volume ejakulat fraksi ke dua yang diperoleh sebesar 2.60 ± 0.55 ml. Volume ejakulat fraksi ke dua pada anjing berkisar antara 1.0 sampai 4.0 ml (Junaidi 2006). Volume semen dipengaruhi oleh individu, bangsa dan frekuensi pengenceran (Laing 1979) namun Junaidi (2006) menyatakan bahwa volume tidak menunjukkan kualitas semen karena bergantung dari jumlah cairan prostata yang diperoleh.
Gambar 8 Tiga fraksi semen anjing Retriever
Keterangan : 1. fraksi pra-spermatozoa 2. fraksi kaya spermatozoa 3. fraksi pasca spermatozoa
ditampung, pra-spermatozoa encer (watery), kaya spermatozoa seperti susu tidak kental (milky, non viscous), dan pasca-spermatozoa sangat kental (highly viscous). Konsistensi dan warna semen berkolerasi dengan jumlah sel spermatozoa yang terdapat dalam semen tersebut. Warna fraksi kedua semen anjing yang diperoleh putih keruh seperti susu dengan konsistensi encer (Gambar 8).
Derajat keasaman (pH) memegang peranan sangat penting karena dapat mempengaruhi persentase spermatozoa hidup, apabila pH tinggi/rendah akan menyebabkan spermatozoa mati. Variasi pH semen kemungkinan dipengaruhi oleh konsentrasi asam laktat yang dihasilkan dalam proses akhir metabolisme (Toelihere 1985). Kisaran pH semen anjing 6.3 sampai 6.7 (Johnston 1991), rataan derajat keasaman semen anjing dalam penelitian 6.40 ± 0.07 relatif normal.
Rataan spermatozoa motil yang diperoleh adalah 76.11 ± 4.59 %. Hasil ini dalam kisaran spermatozoa motil progresif yang normal menurut Junaidi (2006). Sedangkan spermatozoa hidup yang diperoleh adalah 82.42 ± 5.35 %, hasil ini tidak berbeda dengan Bartlett (1962) dalam Junaidi (2006) yang menyebutkan bahwa persentase dari spermatozoa mati dengan pewarnaan eosin per ejakulat pada suhu kamar bervariasi dari 15% sampai 20%. Persentase morfologi spermatozoa normal sebesar 93.02 ± 2.14 %. Dengan demikian hasil ini berada pada kisaran normal morfologi spermatozoa anjing menurut Johnston (1991) yang seharusnya lebih besar atau sama dengan 80%. Rataan konsentrasi spermatozoa 446.11 ± 77.91 juta per ml. Menurut Junaidi (2006) konsentrasi bukanlah indikator kualitas semen pada anjing, kecuali pada kasus tersebut tidak ada spermatozoa dalam ejakulat. Konsentrasi bergantung pada jumlah cairan prostat yang dikoleksi, dan dapat berkisar dari 4 sampai 400 juta per ml. Konsentrasi harus ditentukan untuk menghitung jumlah total spermatozoa dalam ejakulat. Berdasarkan penilaian karakteristik semen segar di atas, dapat disimpulkan karakteristik semen hasil koleksi ketiga anjing Retriever memiliki kualitas yang baik dan memenuhi syarat untuk pembekuan.
Kualitas semen beku anjing Retriever
Kualitas semen beku antara lain ditentukan oleh bahan pengencer yang digunakan serta teknik pembekuan yang dilakukan. Pengencer semen merupakan medium spermatozoa selama proses kriopreservasi. Kandungan bahan pengencer semen akan secara langsung mempengaruhi kualitas spermatozoa yang terdapat di dalamnya.
Parameter kualitas semen beku yang diamati dalam penelitian ini adalah persentase spermatozoa motil dan persentase spermatozoa hidup yang dinilai sesaat setelah koleksi, setelah ekuilibrasi dan setelah semen di-thawing. Kualitas semen beku anjing Retriever dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Kualitas semen beku anjing Retriever dalam pengencer Tris Kuning Telur (TKT) dengan konsentrasi gliserol 3% dan 6% dengan maupun tanpa penambahan 70 mM xilosa
Pengenceran Hasil pemeriksaan G3Xo* G3X70 G6Xo G6X70 Rataan 76.11 ± 4.59 76.11 ± 4.59 76.11 ± 4.59 76.11 ± 4.59 76.11 ± 4.59 Semen % SM Segar % SH 82.42 ± 5.35 82.42 ± 5.35 82.42 ± 5.35 82.42 ± 5.35 82.42 ± 5.35 69.44 ± 5.48a 72.22 ± 4.97a 71.11 ± 5.06a 72.22 ± 4.73a 71.25 ± 5.06 Post % SM equilibrasi % SH 76.25 ± 2.57a 84.78 ± 4.57c 73.70 ± 4.95b 80.75 ± 5.00bc 78.87 ± 4.27 19.07 ± 5.90a 27.59 ± 7.00b 25.00 ± 5.86ab 35.56 ± 7.06c 26.81 ± 6.46 Post % SM thawing % SH 33.08 ± 8.37b 41.60 ± 5.68c 33.79 ± 6.37a 43.44 ± 6.77c 37.98 ± 6.79 Penurunan Spermatozoa Motil (%) 57.04 ± 1.55c 48.52 ± 1.57b 51.11 ± 1.10b 40.56 ± 2.65a 49.31 ± 1.72 Penurunan Spermatozoa hidup (%) 49.34 ± 5.71b 40.81 ± 4.61a 48.63 ± 4.65b 38.98 ± 6.24a 44.44 ± 5.31 Recovery Rate (RR) (%) 25.07 ± 1.00 a 36.20 ± 1.25b 32.97 ± 0.94b 46.71 ± 1.35c 35.24 ± 1.14 1. Huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (nilai P<0.05)
2. *Jenis pengencer semen beku yang digunakan; G3Xo: TKT dengan gliserol 3% dan xilosa 0 mM, G3X70:
TKT dengan gliserol 3% dan xilosa 70 mM, G6Xo: TKT dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM, G6X70:
TKT dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM
Persentase spermatozoa motil merupakan persentase dari spermatozoa yang bergerak ke depan (progresif). Dinilai secara kualitatif dengan membandingkan spermatozoa hidup yang progresif dan tidak progresif. Persentase spermatozoa hidup adalah persentase spermatozoa yang hidup, ditandai dengan kepala tidak menyerap warna/transparan. Spermatozoa yang telah mati
semen segar maupun semen beku (Rota 1998). Shahiduzzaman (2006) menyatakan bahwa motilitas merupakan kriteria penting dalam penilaian potensi fertilitas dari semen dan dapat menyediakan informasi yang bermanfaat mengenai reaksi spermatozoa dalam lingkungan yang tidak menguntungkan.
Berdasarkan hasil pengamatan persentase spermatozoa motil dari ketiga anjing Retriever sampai tahap post-equilibrasi, belum terdapat pengaruh perbedaan keempat pengencer semen beku sehingga memberikan hasil yang tidak berbeda nyata (nilai P>0.05), dengan masing-masing nilai pengencer Tris Kuning Telur (TKT) dengan gliserol 3% dan xilosa 0 mM sebesar 69.44%, pengencer tris kuning telur dengan gliserol 3% dan xilosa 70 mMsebesar 72.22%, pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM sebesar 71.11% dan terakhir pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 70 mM sebesar 72.22%. Sedangkan pada persentase spermatozoa hidup post-equilibrasi, terbesar adalah pada pengencer tris kuning telur dengan gliserol 3% dan dengan penambahan xilosa 70 mM(84.78%) lalu berturut-turut diikuti oleh pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 70 mM (80.75%), pengencer tris kuning telur dengan gliserol 3% dan xilosa 0 mM (76.25%) dan yang terakhir dan terkecil oleh pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM (73.70%).
Menurut Junaidi (2006) motilitas progresif adalah parameter yang paling sering dinilai untuk evaluasi kualitas spermatozoa anjing yang di-thawing setelah pembekuan. Persentase spermatozoa motil yang progresif menurun setelah di-
thawing, dengan nilai yang dilaporkan adalah kurang lebih 50-60%, dengan persentase yang dianjurkan untuk kepentingan inseminasi buatan sebesar 35-50% (Pesch & Hoffmann 2007). Dalam penelitian, berdasarkan hasil pengamatan post- thawing, persentase spermatozoa motil dan spermatozoa hidup paling tinggi ditunjukkan oleh pengencer tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 6% dan dengan penambahan xilosa 70 mM (G6X70) yaitu masing-masing sebesar 35.56% dan 43.44%. Lalu pada persentase spermatozoa motil post-thawing berturut-turut diikuti oleh pengencer tris kuning telur dengan gliserol 3% dan xilosa 70 mM (G3X70) sebesar 27.59% yang tidak berbeda nyata dengan pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM (G6Xo) sebesar 25.00% dan motilitas
xilosa 0 mM (G3Xo) yaitu hanya sebesar 19.07%. Gambar 9 menunjukkan kualitas semen beku anjing Retriever berdasarkan persentase spermatozoa motil dan spermatozoa hidup post-thawing.
0 10 20 30 40 50 G3X0 G3X70 G6X0 G6X70 Pengencer P er sen ta se ( % ) % SM % SH
Gambar 9 Grafik kualitas semen beku post-thawing anjing Retriever dalam pengencer Tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 3% dan 6% dengan maupun tanpa penambahan 70 mM xilosa.
Gliserol mempunyai sifat larut dalam lemak sehingga dapat menembus membran plasma masuk ke dalam sel, selama proses pembekuan gliserol akan berdifusi memasuki spermatozoa dan digunakan untuk aktivitas metabolisme oksidatif, menggantikan sebagian air bebas dan mendesak keluar elektrolit- elektrolit, menurunkan konsentrasi elektrolit intrasel serta mengurangi daya rusaknya terhadap spermatozoa dengan jalan memodifikasi kristal-kristal es yang terbentuk (Toelihere 1985). Gliserol dengan konsentrasi yang lebih tinggi memiliki daya protektif yang lebih tinggi selama proses pembekuan, namun berdasarkan hasil penelitian penambahan xilosa ke dalam pengencer Tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 3% mampu meningkatkan persentase motilitas
post thawing melebihi persentase dari pengencer Tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 6%.
Monosakarida, terutama xilosa dan fruktosa mampu meningkatkan persentase spermatozoa motil dan spermatozoa hidup post-thawing (Yildiz et al.
Selain meningkatkan persentase spermatozoa motil post thawing, xilosa juga mampu meningkatkan persentase spermatozoa hidup post thawing, terlihat pada hasil pengamatan persentase spermatozoa hidup pengencer tris kuning telur dengan penambahan xilosa 70 mM (G6X70 dan G3X70) menunjukkan persentase spermatozoa hidup masing-masing 43.44% dan 41.60% lebih tinggi dibandingkan dengan pengencer tris kuning telur dengan xilosa 0 mM (G6Xo dan G3Xo) hasilnya masing-masing hanya sebesar 33.79% dan 33.08%.
Selain persentase spermatozoa motil dan hidup, kualitas semen beku juga dapat dinilai berdasarkan jumlah spermatozoa yang kembali pulih setelah proses pembekuan. Recovery Rate (RR) merupakan nilai kemampuan spermatozoa yang berhasil pulih kembali setelah pembekuan. Hasil penelitian menunjukkan nilai RR tertinggi terdapat pada pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan dengan penambahan xilosa 70 mM (G6X70) sebesar 46.71%, hasil ini berbeda nyata (nilai P<0.05) dengan ketiga pengencer lainnya. Pengencer tris kuning telur dengan gliserol 3% dan dengan penambahan xilosa 70 mM memiliki nilai RR terbesar kedua setelah pengencer Tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 6% dan dengan penambahan xilosa 70 mM, yaitu sebesar 36.2%, kemudian diikuti pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% dan xilosa 0 mM dengan RR 32.85%. Nilai RR terkecil pada pengencer tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 3% dan xilosa 0 mM yaitu hanya 25.07%.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pemakaian tris kuning kuning telur dengan konsentrasi gliserol 6% dan dengan penambahan xilosa 70 mM sebagai pengencer dalam pembekuan semen anjing Retriever dapat mempertahankan persentase spermatozoa motil dan spermatozoa hidup, serta memiliki nilai recovery rate terbaik dibandingkan ketiga pengencer lainnya. Serta penambahan xilosa 70 mM ke dalam pengencer Tris dengan konsentrasi gliserol yang rendah dapat bekerja sinergis serta mampu meningkatkan kemampuan protektifnya melebihi pengencer Tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol yang lebih tinggi apabila digunakan sebagai agen krioprotektan tunggal dalam proses pembekuan semen anjing.
Pengencer terbaik dalam penelitian mengandung gliserol sebagai agen krioprotektan intraseluler dan ekstraseluler dengan konsentrasi sebesar 6% yang
ditambahkan xilosa dengan konsentrasi sebesar 70 mM sebagai agen krioprotektan ekstraseluler. Komponen ini akan melindungi spermatozoa selama proses pembekuan dengan meminimalisasi pembentukan kristal es baik intra maupun ekstra seluler (Arifiantini 2004). Berdasarkan hasil penelitian, penggunaannya gliserol dengan konsentrasi 6% lebih baik dari konsentrasi 3% dalam mencegah penurunan motilitas post thawing. Hasil ini mendukung pernyataan Rota et al (1998) yang menyatakan bahwa dalam pembekuan spermatozoa anjing, penggunaan gliserol dengan konsentrasi sebesar 5% lebih baik daripada gliserol dengan konsentrasi 3%. Gliserol merupakan krioprotektan yang paling umum digunakan pada pembekuan semen mamalia. Selain Rota (1998), penelitian mengenai berbagai konsentrasi gliserol pada pembekuan semen anjing telah banyak dilaporkan, diantaranya oleh Prinosilova et al.(2005) menggunakan gliserol dengan konsentrasi 4, 6 dan 8%, Holst et al. (2000) menggunakan 7%, Silva et al (2005) dan Kim et al. (2007) menggunakan gliserol 6%. Peneliti lain melaporkan konsentrasi gliserol 8% lebih baik daripada 2, 4 dan 6% (Bateman 2001). Yildiz et al. (2000) menggunakan gliserol 8% untuk pembekuan semen anjing pada pengencer Tris. Hasil pengujian perbedaan konsentrasi gliserol oleh Rota et al. (1998) untuk pembekuan semen anjing, memberikan hasil terbaik pada kisaran 2% sampai dengan 8%. Pada konsentrasi kurang dari 2%, gliserol tidak memberikan efek protektif terhadap spermatozoa anjing selama proses pembekuan dan sebaliknya pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 8% gliserol akan bersifat toksik terhadap spermatozoa.
Salisbury dan Vandemark (1984); Fahy (1986); dan Hafez (1993) menyatakan bahwa gliserol akan bersifat toksik pada konsentrasi yang tinggi, sebaliknya jika konsentrasi yang digunakan terlalu rendah maka daya protektifnya akan berkurang. Efek yang merugikan dari gliserol pada motilitas spermatozoa juga dapat terjadi pada spermatozoa anjing (England 1992, diacu dalam Rota 1998). Berdasarkan hasil penelitian konsentrasi gliserol terbaik untuk pembekuan semen anjing Retriever adalah sebesar 6% dengan penambahan 70 mM xilosa. Namun dengan penambahan xilosa 70 mM, pengencer dengan konsentrasi gliserol 3% memiliki persentase spermatozoa motil dan hidup yang
Efek gliserol adalah mencegah pengumpulan molekul H2O dan mencegah kristalisasi es pada pada daerah titik beku larutan (Mazur 1980 diacu dalam Tambing 1999). Pencegahan kristalisasi es dilakukan dengan jalan mengubah bentuk dan ukuran es sehingga mengurangi tekanan mekanik dan menurunkan titik beku medium. Selain itu gliserol akan menurunkan konsentrasi natrium di dalam medium di luar sel sehingga kematian spermatozoa akibat solution effect
dapat dihindarkan. Solution effect ini akan timbul bila terjadi perubahan yang drastis dari larutan dalam sel yang dibekukan sebagai akibat terbentuknya kristal- kristal es di luar dan di dalam spermatozoa. Akibat pembekuan akan menyebabkan penurunan volume air dalam sel, perubahan air menjadi es dan adanya peningkatan konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel spermatozoa. Penambahan gliserol ke dalam pengencer diharapkan dapat menghindarkan peningkatan konsentrasi elektrolit di atas level yang merugikan.
Penambahan xilosa ke dalam pengencer tris kuning telur yang mengandung gliserol 3% menghasilkan persentase spermatozoa motil dan hidup yang lebih tinggi daripada pengencer tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 6% tanpa penambahan xilosa. Penambahan xilosa ke dalam pengencer tris kuning telur dengan konsentrasi 3% dapat meningkatkan daya protektif gliserol 3% menjadi lebih besar dari daya protektif pengencer tris kuning telur dengan gliserol 6% tanpa penambahan xilosa selama proses pembekuan.
Penggunaan karbohidrat sebagai agen utama krioprotektan belum banyak digunakan maupun diteliti. Dalam penelitian ini dilakukan penambahan xilosa yang merupakan monosakarida pentosa sebagai sumber karbohidrat yang berbeda bagi pembekuan semen anjing dan terbukti mampu bekerja sinergis bersama-sama dengan gliserol dalam meminimalisasi efek negatif proses pembekuan semen. Selain harganya yang terjangkau, pemilihan xilosa sebagai agen krioprotektan dalam pembekuan semen anjing telah terbukti mampu meningkatkan motilitas spermatozoa post-thawing, hasil ini tidak berbeda nyata (Nilai P<0.05) dengan penggunaan fruktosa dan trehalosa pada penelitian yang sama (Yildiz et al. 2000). Kemampuan gula dalam melindungi sel spermatozoa tergantung dari suhu penyimpanan, bobot molekul gula dan tipe buffer yang digunakan. Molinia et al.
disakarida dalam mempertahankan motilitas spermatozoa domba yang dibekukan dengan menggunakan pengencer Tris asam sitrat. Garcia dan Graham (1989) dalam penelitiannya menemukan bahwa penggunaan trisakarida tidak seefektif mono- dan disakarida dalam mempertahankan motilitas post-thawing spermatozoa sapi. Tiga faktor utama penyebab kerusakan selama proses kriopreservasi antara lain adanya kerusakan mekanik akibat pembentukan kristal es, adanya dehidrasi dari suspensi baik intra maupun ekstraseluler dan adanya perubahan fisik kimiawi (Supriatna & Pasaribu 1992). Pada umumnya kerusakan membran plasma terjadi selama proses penanganan semen, baik selama pendinginan semen (20oC – 5oC) maupun selama proses penyimpanan (Paulenz et al. 2002).
Mekanisme bagaimana gula bekerja, dalam hal ini xilosa, dalam melindungi sel selama proses dehidrasi atau pembekuan, berkaitan dengan pengaruh gula dalam proses pembekuan yang mampu menstabilkan membran plasma maupun protein seluler (Eiman et al. 2003). Hasil pengamatan terhadap perlindungan gula bagi spermatozoa oleh Eiman et al. (2003) mengindikasikan bahwa kehadiran gula dapat mengubah membran yang mudah terkena dampak dari perubahan fisik dan morfologi yang terjadi cepat, yang terjadi selama proses pengeluaran air secara cepat dari dalam sel selama pembekuan. Eiman juga menambahkan gula dapat meningkatkan motilitas spermatozoa post-thawing, nilai recovery rate, ketahanan terhadap perubahan suhu dan integritas akrosom. Woelder et al. (1997) menyatakan bahwa gula memiliki efek protektif terhadap kerusakan spermatozoa yang terjadi selama proses pendinginan yang berlangsung cepat. Berdasarkan hasil penelitian terbukti bahwa xilosa bekerja secara sinergis dengan krioprotektan lain dalam melindungi spermatozoa selama proses pembekuan, terlihat dari persentase spermatozoa motil dan hidup serta nilai RR yang lebih tinggi pada pengencer Tris kuning telur dengan gliserol 3% dengan penambahan xilosa 70 mM dibandingkan dengan pengencer Tris kuning telur dengan gliserol 6% tanpa penambahan xilosa 70 mM.
Pada penelitian ini, pengencer terbaik yang mampu melindungi spermatozoa anjing Retriever selama proses pembekuan atau kriopreservasi adalah pengencer tris kuning telur yang mengandung gliserol 6% serta
Diikuti oleh pengencer tris kuning telur dengan konsentrasi gliserol 3% dan penambahan xilosa 70 mM, yang lebih baik dari pengencer tris kuning telur dengan agen krioprotektan tunggal gliserol sebesar 6% dan 3%.
