Lokasi Pengambilan Sampel dan Jenis Sampel Lundi (Coleoptera: Scarabaeidae)
Pengambilan sampel lundi dilakukan pada dua lokasi perkebunan kelapa sawit, yaitu kebun pendidikan kelapa sawit IPB Cikabayan dan Jonggol (Gambar 3). Kebun pendidikan kelapa sawit IPB Cikabayan terletak di Desa Babakan, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat pada 6o33’7.5636” LS dan
106o42’56.6664” BT di ketinggian 169.878 mdpl. Kebun pendidikan kelapa sawit IPB Jonggol terletak di Desa Singasari, Kecamatan Jonggol, Kabupaten Bogor, Jawa Barat pada 6o28’27,9984” LS dan 107o1’56,8704” BT dengan ketinggian
101.971 mdpl.
Tanaman kelapa sawit yang ditanam pada kedua lokasi pengambilan sampel lundi tersebut merupakan kelapa sawit jenis tenera. Tanaman kelapa sawit di lokasi Cikabayan berumur 18 tahun sedangkan pada lokasi Jonggol berumur 4.2 tahun. Kebun di lokasi Cikabayan dilakukan pemupukan kimiawi setiap enam bulan satu kali dan dilakukan pemanenan satu kali dalam satu bulan. Sedangkan kebun di lokasi Jonggol, pemupukan kimiawi dilakukan setiap enam bulan satu kali dan pemupukan organik sebelum tanam. Pengendalian hama dan penyakit pada lokasi tersebut dilakukan hanya jika terdapat serangan OPT dengan intensitas tinggi.
Sampel lundi yang diperoleh dari kedua lokasi pengambilan sampel merupakan lundi dari ordo Coleoptera famili Scarabaeidae (Gambar 4). Lundi merupakan fase larva dari kumbang. Variasi waktu perkembangan larva dipengaruhi oleh jenis makanan dan iklim (Wibawanti 2010). Larva dari famili Scarabaidae memiliki kepala dan abdomen yang kuat dan hidup di dalam tanah. Larva makan bahan organik mati, perakaran, dan umbi-umbian (Kalshoven 1981).
Gambar 3 Lokasi pengambilan sampel: kebun Pendidikan Kelapa Sawit IPB Cikabayan (A), Kebun Pendidikan Kelapa Sawit Jonggol (B)
Gambar 4 Jenis sampel lundi: penampakan keseluruhan tubuh lundi dari famili Scarabaeidae (A), penampakan ujung abdomen lundi bagian ventral yang memiliki banyak seta
A B
9
Perilaku lundi didominasi oleh faktor cahaya. Di lingkungan alami, jika lundi ditempatkan pada permukaan medium perkembangbiakan lundi akan cepat bergerak turun menjauhi cahaya. Selain itu, lundi tersebut biasanya berkembang baik pada tumpukan bahan organik yang sedang mengalami proses pembusukan (Roma et al. 2012).
Jenis dan Jumlah Isolat Bakteri Calon Agens Hayati Hasil Isolasi dari Permukaan Tubuh Lundi
Bakteri calon agens hayati hasil isolasi dari permukaan tubuh lundi dikarakterisasi berdasarkan karakter morfologinya (Lampiran 1). Hal tersebut dilakukan dengan tujuan untuk menyeleksi bakteri calon agens hayati berdasarkan jenis bakteri yang berbeda. Koloni-koloni bakteri yang diperoleh diduga menunjukkan jenis koloni yang berbeda (Lampiran 2).
Tabel 1 Isolat bakteri calon agens hayati hasil isolasi dari permukaan tubuh lundi Lokasi asal Jumlah koloni (CFU/ekor) Jenis isolat
Jonggol 15 x 106 15
Cikabayan 1.9 x 106 11
Total 26
Jumlah dan jenis isolat bakteri calon agens hayati yang diperoleh dari sampel lundi asal Jonggol lebih banyak jika dibandingkan dengan bakteri asal Cikabayan (Tabel 1). Hal tersebut diduga karena bahan organik di lokasi Cikabayan mengalami tingkat pelapukan bahan organik yang sudah lanjut, karena umur tanaman kelapa sawit pada lokasi tersebut jauh lebih tua jika dibandingkan dengan tanaman kelapa sawit pada lokasi Jonggol. Tingkat pelapukan bahan organik yang sudah lanjut berpengaruh pada jumlah dan keragaman mikroorganisme yang ada pada lokasi tersebut. Menurut Yuniven (2014), tingkat pelapukan bahan organik pada tanah yang sudah lanjut menyebabkan ketersediaan unsur hara yang diperlukan tanaman menjadi tidak lagi tersedia dan organisme tanah tidak mendapatkan sumber makanan dan energi.
Selain itu, sejarah lahan juga dapat mempengaruhi keragaman dan jumlah mikroorganisme yang ada pada lahan tersebut. Sejarah lahan kelapa sawit Jonggol yang dijadikan lokasi pengambilan sampel lundi merupakan lahan hutan. Sejarah lahan kelapa sawit Cikabayan yang dijadikan lokasi pengambilan sampel lundi merupakan lahan perkebunan karet. Menurut Swibawa et al. (2009), keragaman vegetasi pada suatu wilayah dapat berdampak terhadap keragaman biota dalam tanah. Semakin menurunnya keragaman vegetasi tanaman maka jumlah biota tanah pun akan menurun pula. Salah satu penyebab penurunan keragaman vegetasi adalah konversi hutan menjadi lahan pertanian.
Pengujian Gram dan Reaksi Hipersensitif Calon Bakteri Agens Hayati
Isolat bakteri calon agens hayati diuji dengan pengujian Gram dan pengujian hipersensitif. Hasil pengujian Gram menunjukkan bahwa terdapat 13 isolat bakteri Gram negatif dan 13 isolat bakteri Gram positif (Tabel 2). Bakteri Gram negatif menunjukkan pembentukan lendir setelah tercampur dengan KOH 3% sedangkan isolat Gram positif tidak terdapat pembentukan lendir. Adanya lendir yang terbentuk pada bakteri Gram negatif disebabkan karena dinding sel bakteri Gram
10
negatif lebih sensitif dan tidak memiliki ketahanan terhadap penghambat basa seperti larutan KOH sehingga dinding sel akan pecah kemudian DNA keluar dan terbentuklah benang-benang lendir. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tahan terhadap larutan KOH dan melekat sehingga ada DNA yang dibebaskan (Shivas dan Beasley 2005).
Hasil pengujian reaksi hipersensitif menunjukkan bahwa secara keseluruhan semua isolat bakteri calon agen hayati tidak bersifat patogenik tanaman kecuali isolat LC06 yang bersifat patogen tanaman (tabel 2). Bakteri yang bersifat patogen tanaman tersebut ditandai dengan adanya gejala nekrosis pada jaringan daun tanaman tembakau yang diuji, sedangkan bakteri non-patogen ditandai dengan tidak adanya gejala nekrosis pada jaringan daun tembakau (Gambar 4). Tabel 2 Hasil pengujian Gram dan hipersensitif bakteri calon agens hayati
Kode isolat
Pengujian Kode Isolat
Pengujian
Gramd Hipersensitife Gram Hipersensitif
LJa01b - - LJ14 - - LJ02 - - LJ15 + - LJ03 + - LCc01 - -LJ04 + - LJC2 - - LJ05 + - LC03 + - LJ06 + - LC04 - -LJ07 + - LC05 - - LJ08 - - LC06 - + LJ09 - - LC07 - -LJ10 - - LC08 + - LJ11 + - LC09 - LJ12 + - LC10 + -LJ13 + - LC11 +
-aIsolat bakteri calon agens hayati yang diperoleh dari permukaan tubuh lundi asal Jonggol, bangka menunjukkan penomoran isolat, cIsolat bakteri calon agens hayati yang diperoleh dari permukaan tubuh lundi asal Cikabayan, dTanda + menunjukkan bakteri Gram positif, tanda – menunjukkan bakteri Gram negatif, eTanda + menujukkan adanya gejala nekrosis pada daun saat uji hipersensitif, tanda – menujukkan tidak ada gejala apapun saat uji hipersensitif
Ketahanan tanaman dalam pengujian hipersensitif akan mengenali adanya molekul khusus yang dihasilkan oleh patogen. Infeksi pada jaringan daun oleh bakteri patogen menyebabkan hancurnya semua membran seluler dari sel-sel yang berkontak dengan bakteri, kemudian diikuti dengan pengeringan dan nekrosis pada jaringan daun yang terserang bakteri tersebut. Jaringan daun yang mengalami nekrosis bertujuan mengisolasi patogen dari substansi hidup di sekitarnya sehingga menyebabkan patogen tersebut mati (Agrios 2005).
Gambar 5 Reaksi hipersensitif: gejala nekrosis (A), tanpa gejala nekrosis (B)
11 Pengujian Potensi Antagonisme Bakteri Calon Agens Hayati terhadap Patogen Penting pada Tanaman Padi
Pengujian potensi antagonisme dengan metode dual culture memperlihatkan bahwa pertumbuhan cendawan patogen dapat dihambat oleh beberapa jenis bakteri calon agens hayati dari permukaan tubuh lundi. Begitu pula dengan pengujian potensi antagonisme dengan metode cross streak terhadap bakteri patogen. Persentase penghambatan dan jumlah bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan patogen menunjukkan hasil yang bervariasi (Tabel 3).
Tabel 3 Persentase penghambatan radial dan zona bening yang dihasilkan oleh bakteri calon agens hayati dari permukaan tubuh lundi terhadap patogen penting pada tanaman padi
Kode isolat
Penghambatan pertumbuhan (%)
H. oryzae P. oryzae R. solani X. oryzae pv. oryzae LJa01b 11.5 24.1 19.4 0.0 LJ02 9.6 13.3 0.0 46.6 LJ03 0.0 23.3 0.0 0.0 LJ04 0.0 0.0 0.0 0.0 LJ05 0.0 16.6 0.0 0.0 LJ06 0.0 46.6 0.0 0.0 LJ07 3.2 0.0 0.0 0.0 LJ08 0.0 23.3 0.0 0.0 LJ09 18.5 30.3 0.0 0.0 LJ10 26.6 30.3 52.2 0.0 LJ11 0.0 15.1 0.0 0.0 LJ12 0.0 20.2 0.0 0.0 LJ13 28.5 28.5 34.5 53.3 LJ14 13.7 16.6 22.1 0.0 LJ15 10.3 29.6 21.4 0.0 LCc01 3.9 6.67 0.0 0.0 LC02 9.1 14.3 50.0 0.0 LC03 18.8 23.3 0.0 0.0 LC04 0.0 0.0 0.0 0.0 LC05 20.8 20.0 21.9 0.0 LC07 0.0 0.0 3.2 0.0 LC08 6.5 16.7 0.0 0.0 LC09 8.0 33.3 0.0 0.0 LC10 0.0 0.0 0.0 0.0 LC11 0.0 9.09 0.0 0.0
aIsolat bakteri calon agens hayati yang diperoleh dari permukaan tubuh lundi asal Jonggol, bangka menunjukkan penomoran isolat, cIsolat bakteri calon agens hayati yang diperoleh dari permukaan tubuh lundi asal Cikabayan
Pengujian antagonisme menunjukkan bahwa terdapat 14 isolat bakteri calon agens hayati mampu menghambat cendawan H. oryzae, 20 isolat mampu menghambat P. oryzae, sebanyak delapan isolat mampu menghambat R. solani, sebanyak dua isolat mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae. Persentase penghambatan tertinggi secara keseluruhan dihasilkan oleh isolat LJ10 dan LJ13. Isolat LJ10 memiliki persentase penghambatan terhadap cendawan patogen uji
12
yaitu 52.2% terhadap R. solani, 30.3% terhadap P. oryzae, dan 26.6% terhadap H. oryzae. Isolat LJ13 mampu menekan semua jenis patogen uji dengan persentase hambat yang bervariasi. Persentase penghambatan terhadap patogen uji yang dihasilkan isolat LJ13 yaitu 34.5% terhadap R. solani, 28.5% terhadap P. oryzae, dan 28.5% terhadap H. oryzae, serta 53.3% terhadap X. oryzae pv. oryzae.
Uji lebih lanjut yang dilakukan pada dua calon bakteri agens hayati potensial (LJ10 dan LJ13) menunjukkan keefektifan yang berbeda terhadap ke empat patogen uji berdasarkan hasil analisis ragam (Lampiran 3). Persentase penghambatan yang dihasilkan oleh bakteri LJ10 dan LJ13 juga menunjukkan nilai yang berbeda nyata pada H. oryzae, R. solani dan X. oryzae pv. oryzae, tetapi tidak berbeda nyata pada P. oryzae (Tabel 4).
Tabel 4 Persentase penghambatan radial yang dihasilkan oleh bakteri LJ10 dan LJ13 terhadap empat jenis patogen uji
zKode Isolat Persentase penghambatana
H. oryzae P. oryzae R. solani X. oryzae pv. oryzae LJ10 22.523b 29.220a 48.767a 00.000b LJ13 27.777a 27.437a 36.953b 53.000a
aAngka selajur yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji Tukey pada taraf 5%
Penghambatan pada cendawan patogen ditandai dengan adanya jarak antara cendawan patogen dan bakteri calon agens hayati (Gambar 6). Jarak tersebut menunjukkan pertumbuhan hifa cendawan yang abnormal jika dibandingkan dengan pertumbuhan hifa cendawan pada arah yang berlawanan. Hifa abnormal diduga karena adanya senyawa anticendawan yang dihasilkan oleh bakteri.
Pengamatan struktur sel pada hifa cendawan yang menjauhi bakteri agens hayati secara mikroskopis juga menunjukkan adanya bentuk morfologi hifa yang abnormal (Gambar 7). Pertumbuhan hifa cendawan yang tidak normal tersebut diduga karena adanya senyawa anticendawan yang dihasilkan bakteri calon agens hayati. Senyawa anticendawan tersebut kemudian menghambat pertumbuhan cendawan patogen uji. Eliza et al. (2007) menyatakan bahwa senyawa anticendawan yang dihasilkan oleh bakteri secara umum mengakibatkan terjadinya pertumbuhan yang abnormal pada hifa (malformasi), yang ditunjukkan dengan pembengkakan dan pemendekan hifa dan mengakibatkan hifa tidak dapat berkembang dengan sempurna. Di samping itu juga ditemukan hifa patogen yang lisis. Hal ini disebabkan karena bakteri menghasilkan enzim kitinase yang dapat melisis dinding sel patogen, dinding sel beberapa cendawan patogen dilaporkan disusun oleh senyawa kitin.
Gambar 6 Potensi antagonisme bakteri calon agens hayati terhadap cendawan patogen: H. oryzae (A), R. solani (B), P. oryzae (C)
13
Pertumbuhan bakteri patogen yang terhambat ditunjukkan dengan adanya zona bening (Gambar 8). Zona bening yang terlihat dapat diakibatkan karena adanya senyawa antibiotik yang dihasilkan oleh bakteri calon agens hayati. Senyawa antibiotik merupakan hasil dari metabolisme sekunder bakteri. Menurut Javandira et al. (2013), pengaruh senyawa antibiotik memiliki peran dalam proses sintesa protein sel. Sintesa protein sel dapat terhambat bila terkena senyawa antibiotik sehingga sel menjadi rusak dan tidak dapat melakukan sintesa protein. Beberapa jenis antibiotik yang biasa digunakan di antaranya adalah streptomisin, tetrasiklin, sikloheksamid, dan blastisidin (Agrios 2005).
Identifikasi Bakteri Calon Agens Hayati dengan Teknik Molekuler
Isolat bakteri calon agens hayati dari permukaan tubuh lundi yang memiliki potensi paling baik jika dibandingkan dengan isolat bakteri lainnya dalam menghambat keempat patogen uji kemudian diidentifikasi menggunakan teknik molekuler. Bakteri tersebut adalah isolat bakteri LJ10 (Gambar 9A) dan isolat bakteri LJ13 (Gambar 9B).
Hasil amplifikasi fragmen gen 16S rRNA calon bakteri agens hayati dengan kode isolat LJ10 dan LJ13 menggunakan primer universal berhasil menampilkan pita DNA dengan ukuran 1500 bp (Gambar 10). Pita DNA dari kedua isolat yang
A
Gambar 7 Miselium cendawan patogen yang terpapar oleh bakteri agens hayati dengan perbesaran 400 kali: hifa cendawan patogen R. solani normal (A), hifa mengerut dan mengecil (B), hifa keriting (C)
C B
A B
Gambar 8 Potensi antagonisme: perlakuan kontrol (A), adanya zona bening yang terlihat di antara bakteri LJ13 dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (B)
A B
Gambar 9 Karakter morfologi Isolat bakteri calon agens hayati dengan kode LJ10 (A) dan LJ13 (B)
14
telah melalui proses PCR berhasil diisolasi dengan menghasilkan pita sesuai dengan ukuran pasang basa untuk mengidentifikasi gen 16S rRNA yaitu dengan ukuran ~1500 pb. Hal ini menunjukkan bahwa primer serta kondisi PCR yang digunakan dapat mengamplifikasi amplikon dengan baik sesuai dengan target gen 16S rRNA. Urutan basa nukleotida yang diperoleh (Lampiran 4 dan 5) kemudian disejajarkan pada data Genbank.
Analisis sekuen parsial gen mengindikasikan bahwa isolat LJ10 termasuk ke dalam genus Citrobacter sedangkan isolat LJ13 termasuk ke dalam genus Bacillus (Tabel 5). Hasil analisis genotipe tersebut menyebutkan bahwa isolat LJ10 memiliki kedekatan ciri genetik terdekat dengan Citrobacter farmeri sebesar 97 hingga 98% sedangkan isolat LJ13 memiliki kedekatan ciri genetik terdekat dengan Bacillus sp. sebesar 97%.
Tabel 5 Analisis sekuen parsial gen 16s rRNA dua isolat bakteri dari permukaan tubuh lundi dengan gen 16s rRNA di pusat GenBank
Kode Isolat Spesies homolog Quent query (%) Kemiripan (%) No aksesi LJ10 Citrobacter farmeri strain W17-1 97 98 JX393004.1 C. farmeri strain 17-7 KSS 97 98 HE575920.1 C. farmeri 98 97 DQ187393.1 C. amalonaticus 98 97 DQ187379.1 Citrobacter sp. TUST-S5 98 97 KM186147.1 LJ13 Bacillus sp. WY047 99 97 KT443870.1 B. amyloliquefaciens strain zzx18 99 97 KJ009413.1 Bacillus sp. CZB30 99 97 KF482860.1 Bacillus sp. N-14 99 97 KJ719300.1 Bacillus sp. LX-110 99 97 KF928695.1
Sel bakteri Bacillus spp. berbentuk batang dan lurus, berukuran 0.5-2.5 μl x
1.2-10 μl, dan sering membentuk rantai atau berpasangan dengan ujung yang bulat
atau persegi. Bakteri tersebut termasuk dalam kelompok Gram positif. Umumnya endospora berbentuk oval, namun terkadang berbentuk bulat atau silinder dan sangat tahan pada kondisi yang buruk, aerobik atau aerobik fakultatif, dengan Gambar 10 Hasil amplifikasi DNA bakteri calon agens hayati dengan penanda
(marker) 1 kb: bakteri dengan kode isolat LJ10 (1) dan LJ13 (2)
15 keragaman yang besar dari kemampuan fisiologis yang peka terhadap panas, pH, dan salinitas. Bakteri tersebut dapat ditemukan pada habitat yang luas, beberapa spesies adalah patogen pada vertebrata dan invertebrata (Holt et al. 1994).
Bakteri Bacillus sp. tergolong memiliki mekanisme antagonis berupa antibiosis terhadap jamur (Abidin et al. 2015). Antimikroba dan antifungal yang dihasilkan oleh Bacillus sp. di antaranya adalah surfactin (fengycin, iturin, bacillomycin) dan senyawa peptid antibiotik lain (Stein 2005). Selain itu, Bacillus sp. telah diketahui mampu memacu pertumbuhan bagi tanaman karena diketahui dapat membantu menghasilkan hormon pertumbuhan seperti asam indoleasetat (IAA), asam giberelat, sitokinin, dan etilen pada tanaman (Sulistiani 2009).
Senyawa antibiotik yang dihasilkan bakteri dari genus Bacillus dapat merusak dinding sel bakteri patogen. Sehingga aktivitas metabolisme bakteri patogen menjadi terganggu dan menyebabkan sel bakteri patogen mati. Pengaruh senyawa antibiotik juga memiliki peran dalam proses sintesa protein sel. Sintesa protein sel dapat terhambat bila terkena senyawa antibiotik sehingga sel menjadi rusak dan tidak dapat melakukan sintesa protein (Javandira et al. 2013).
Bakteri Citrobacter farmeri merupakan salah satu bakteri dari genus Citrobacter (Bruckner et al. 1997). Bakteri dari genus Citrobacter pada umumnya melakukan pergerakan dengan menggunakan flagela peritrichous dan bersifat anaerobik fakultatif. Suhu optimal perkembangannya yaitu 37oC. D-glukosa dan karbohidrat lainnya dikatabolisme dengan memproduksi asam dan gas. Bakteri tersebut dapat ditemukan pada feses manusia dan hewan. Seringkali diisolasi dari spesimen klinis sebagai patogen oportunistik. Selain itu juga dapat ditemukan di tanah, air, limbah, dan makanan (Holt et al. 1994).
Citrobacter farmeri merupakan salah satu patogen manusia (Bruckner et al. 1997). Berbagai literatur menyebutkan bahwa isolat bakteri dari spesies tersebut merupakan menyebabkan penyakit pada manusia dalam beberapa kasus, di antaranya menyebabkan kematian pada penderita meningitis yang juga menderita kanker nasofaring (Tan et al. 2010) dan infeksi pada anak penderita sindrom usus pendek (short-bowel-syndrome) (Bruckner et al. 1997).
Bakteri dari genus Citrobacter sp. telah diketahui dapat menyebabkan infeksi pada manusia pada hampir semua usia termasuk usia remaja dan menengah. Infeksi yang diakibatkan bakteri tersebut juga terjadi pada pria maupun wanita dengan proporsi yang signifikan pada populasi laki-laki. Besarnya infeksi Citrobacter telah meningkat dari waktu ke waktu mengingat potensinya untuk menyebabkan infeksi nosokomial dan meningkatnya jumlah pasien dengan imunitas lemah (immunocompromised) di rumah sakit; C. koseri dan C. freundii menjadi spesies yang paling umum terisolasi (Nayar et al. 2014).
Isolat bakteri LJ10, yang diduga sama dengan spesies Citrobacter farmeri, harus diteliti lebih lanjut jika akan dikembangkan sebagai agens hayati. Menurut Supriadi (2006), dalam pengembangan agens hayati tidak hanya menitik-beratkan pada aspek keefektifannya saja, namun aspek keamanan terhadap manusia, hewan dan lingkungan juga harus diperhatikan. Hal tersebut merupakan informasi kunci apabila agens hayati akan diproduksi secara massal dan diperdagangkan secara komersial. Informasi keefektifan dan identitas agens hayati perlu dikuasai dengan baik agar pengembangannya di masa yang akan datang tidak menjadi masalah.
16