Secara umum, penelitian terdiri atas 4 tahap, yaitu ekstraksi, fraksinasi, uji BSLT, dan uji Sitotoksik (Lampiran 2). Ekstraksi dengan metode Soxhletasi menggunakan pelarut n-heksana bertujuan untuk menghilangkan kandungan lemak pada biji mahoni. Lemak perlu di hilangkan lebih dahulu agar tidak mengganggu analisis senyawa metabolit sekunder target. Setelah kandungan lemak hilang, dilakukan maserasi dengan metanol untuk menarik semua senyawa aktif yang terdapat dalam sampel. Ekstrak metanol dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 40 oC. Diharapkan pada suhu tersebut senyawa metabolit sekunder tidak rusak. Tahap ekstraksi ini diperoleh ekstrak metanol pekat sebesar 20.73 g
(16.92%).
Ekstrak metanol pekat dipartisi dengan etil asetat:air (3:2) untuk memisahkan senyawa polar dan semipolar. Senyawa polar terekstrak oleh air sedangkan senyawa semipolar terekstrak oleh etil asetat. Rendemen fraksi etil asetat yang diperoleh ialah 5.89 g (4.9%).
Untuk meningkatkan kemurnian senyawa yang terekstrak oleh etil asetat maka sebanyak 2,12 g fraksi etil asetat difraksinasi pada kolom dengan fase diam silika G 60 dan fase gerak kloroform dan etil asetat secara bergradien dengan peningkatan kepolaran. Dari sini diharapkan terjadi pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan polaritasnya. Untuk mengetahui jumlah fraksi yang diperoleh, dilakukan uji kualitatif dengan KLT. Hasilnya memperlihatkan adanya 8 fraksi (Lampiran 3). Fraksi 1 bersifat cenderung nonpolar karena terbawa oleh CHCl3, sedangkan fraksi 8 bersiat semipolar karena terbawa oleh etil asetat.
Toksisitas terhadap Larva Udang
Untuk menentukan fraksi aktif yang akan digunakan pada tahap uji sitotoksik maka dilakukan uji BSLT dengan A. salina. Uji BSLT merupakan metode yang cepat dan sederhana untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa (MacLaughin 1991). Aktivitas suatu senyawa ini ditunjukkan sebagai nilai LC50. Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit (Lampiran 4). Hasil uji BSLT (Tabel 1) dari fraksi 1 sampai fraksi 8 kecuali fraksi 6 menunjukkan bahwa semua fraksi merupakan fraksi yang aktif karena memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Nilai LC50 fraksi 6 tidak ditentukan karena rendemen yang diperoleh sangat kecil sehingga tidak dapat diuji.
Tabel 1. Hasil uji BSLT fraksi-fraksi biji mahoni Fraksi Bobot (g) LC50 (ppm)* Etil asetat 1 2 3 4 5 5.8886 1.1722 0.2336 0.0253 0.1947 0.0291 56.69 227.23 74.30 42.26 71.64 90.44
5 6 7 8 0.0011 0.1394 0.0179 - 226.00 252.32 * (-): nilai LC50 tidak ditentukan.
Fraksi 3 merupakan fraksi yang paling aktif dengan nilai LC50 42.26 ppm, tetapi karena rendemen sangat kecil maka dipilih fraksi 2 yang memiliki rendemen cukup banyak dan nilai LC50 74.30 ppm untuk uji sitotoksik terhadap sel T47D.
Sitotoksisitas Fraksi Aktif Terhadap sel T47D
Sel T47D merupakan kultur sel kanker yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Sel ini dikulturkan dalam media RPMI yang mengandung 0.1% penisilin-streptomisin sebagai antibakteri gram positif dan negatif agar terhindar dari kontaminasi. Selain itu juga mengandung FBS sebagai faktor pertumbuhan sel dan NaHCO3 sebagai pengatur pH dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC (Schaferet al. 2000).
Sifat sitotoksik fraksi 2 dapat ditentukan dari kemampuannya membunuh dan menghambat pertumbuhan sel T47D. Kemampuan membunuh dan menghambat pertumbuhan ditentukan sebagai nilai persen penghambatan proliferasi (%PP). Nilai %PP ditentukan dari perbandingan persentase sel hidup terhadap kontrol negatif sel (Lampiran 5). Jumlah sel yang masih hidup dapat ditentukan dengan menggunakan reagen MTT.
Sel hidup memiliki enzim suksinat dehidrogenase yang diproduksi dalam mitokondria. Enzim ini akan mereduksi MTT yang merupakan garam tetrazolium berwarna kuning membentuk kristal formazan berwarna biru (Gambar 2). Warna biru formazan dapat diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm sehingga jumlah sel hidup dapat dihitung. Nilai absorbans formazan sebanding dengan tingkat kehidupan sel dalam media kultur.
Gambar 2. Reaksi pembentukan formazan Efek penghambatan proliferasi fraksi 2 naik sejalan dengan peningkatan konsentrasi (Gambar 3). Namun, pada konsentrasi 250 ppm sudah tidak terjadi kenaikan yang signifikan. Dari profil penghambatan proliferasi diperoleh nilai IC50 dari fraksi 2 sebesar 49.12 ppm (Lampiran 5). Fraksi 2 berpotensi sebagai antikanker karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm (Manset al. 2000).
Gambar 3. Kurva pengaruh konsentrasi fraksi 2 terhadap persen penghambatan proliferasi Dalam penelitian ini juga dilakukan pengujian kontrol positif dari obat antikanker cisplatin. Cisplatin merupakan obat kemoterapi yang banyak digunakan untuk pengobatan kanker payudara, overium, serviks, karsinoma dan sarkoma ostogenik. Ciplatin adalah senyawa turunan cis-diklorodiaminplatinum(2+) (Reedijk & Lohman 1985). Nilai %PP sel T47D oleh cisplatin cenderung berlangsung linier (Gambar 4). Cisplatin mampu menghambat pertumbuhan sel dengan nilai IC50 6,08 ppm (Lampiran 6).
6
Gambar 4. Kurva pengaruh konsentrasi cisplatin terhadap persen penghambatan proliferasi Mekanisme kerja antikanker dari cisplatin yaitu dengan membentuk tautan pada rangkaian DNA sehingga dapat mengganggu transkripsi dan translasi. Cisplatin melepaskan 2 ion Cl- membentuk ion N-Pt2+ dihidrat kemudian mengikat atom N7 dari nukleotida guanosin yang berdekatan pada rangkaian yang sama (Reedijk & Lohman 1985).
Uji Fitokimia
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat dan fraksi 2 hasil kolom (Tabel 2).
Tabel 2. Hasil uji fitokimia fraksi etil asetat dan fraksi 2
Uji fitokimia Fraksi*
etil asetat Fraksi 2* Saponin Steroid/triterpenoi d Alkaloid Tannin Flavonoid - + + - - - + + - - * (+): senyawa tersebut ada dalam fraksi
Fraksi etil asetat dan fraksi 2 menunjukkan hasil positif pada uji steroid/triterpenoid dengan terbentuknya warna hijau kebiruan (Lampiran 8). Keduanya juga menunjukkan hasil positif pada uji alkaloid, yaitu terbentuk endapan berwarna putih dengan reagen Meyers, cokelat dengan reagen Wagner, dan jingga dengan reagen Dragendorf (Lampiran 9). Sementara pada uji saponin, flavonoid, dan tanin menunjukkan hasil negatif. Hal ini menunjukkan bahwa kedua fraksi tersebut mengandung senyawa golongan alkaloid dan
steroid/triterpenoid.
Efek farmakologi dari senyawa golongan alkaloid terhadap kanker telah dilaporkan, yaitu alkaloid vinkristin dan vinblastin dari tanaman Vinca yang menghentikan pembelahan sel pada tahap metafase sehingga sel kanker dapat dihambat pertumbuhannya (Nogrady 1992). Senyawa golongan triterpenoid dalam biji mahoni merupakan senyawa limonoid (Shahidur et al. 2009). Efek farmakologi limonoid dalam buah jeruk mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara dengan cara menginduksi kematian sel secara apoptosis (kematian sel terprogram) (Harris et al. 2009). Limonoid dari Azadicarta indica juga mampu menghambat proliferasi sel koriokarsinoma manusia (BeWo) dengan cara menginduksi apoptosis (Kumaret al.2008).
SIMPULAN DAN SARAN
SimpulanBerdasarkan hasil yang telah dipaparkan dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi 2 dengan nilai LC50 74.30 ppm dan rendemen 0.2336 g, mampu menghambat pertumbuhan sel T47D dengan nilai IC50 sebesar 49.12 ppm. Fraksi 2 mengandung senyawa alkaloid dan steroid/triterpenoid.
Saran
Perlu dilakukan pemisahan lebih lanjut pada fraksi 2 untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni sehingga struktur senyawa aktifnya dapat dielusidasi. Selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme penghambatan pertumbuhan sel kanker serta pengujian sitotoksik terhadap sel normal.