Hasil
Reidentifikasi dan Patogenisitas Proteus mirabilis
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa P. mirabilis adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang. Koloni P. mirabilis berwarna hitam saat ditumbuhkan pada media SSA dengan warna hitam pada bagian tengah koloni dan tampak bening pada tepi koloni. Hasil uji patogenisitas P. mirabilis yang dilakukan pada media agar darah menunjukkan bahwa P. mirabilis mampu melisiskan sel darah dan menghasilkan alfa hemolisin (Lampiran 5).
Berdasarkan hasil identifikasi dengan KIT API 20E menunjukkan bahwa isolat A31 adalah Proteus mirabilis (99.9%). Bakteri P. mirabilis tampak tidak memfermentasikan manosa, sorbitol, glukosa, arabinosa, rhamnosa. Uji ornithin dekarboksilase, produksi H2S, urease dan gelatin menunjukkan hasil yang positif, sedangkan uji indol dan lisin dekarboksilase menunjukkan hasil yang negatif (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil identifikasi KIT API 20E bakteri P. mirabilis
+ : reaksi positif; - : reaksi negatif
Resistensi Proteus mirabilis terhadap Antibiotik
Hasil uji resistensi antibiotik menunjukkan bahwa P. mirabilis telah resisten terhadap antibiotik ampicillin, amoxicillin dan trimethoprim-sulfametahoxazole (Tabel 2). Hal ini terlihat dari tidak adanya zona penghambatan yang terbentuk saat P. mirabilis diujikan dengan ketiga antibiotik
Uji Fsiologis Reaksi Uji Fisiologis Reaksi
ONPG (Ortho Nitrofenil-β
-Galaktopiranosidase) -
Sitrat
+ ODC (Ornitin
dekarboksilase) + Glukosa -
LDC (Lisin dekarboksilase) - Manosa -
ADH (Arginin Dihidrolase) - Inositol -
TDA (Triptopan
Deaminase) + Melibiose -
H2S + Sorbitol -
Urease + Rhamnosa -
Indol - Sukrosa -
VP (Voges Proskauer) - Arabinosa -
12
tersebut, sedangkan terhadap antibiotik ciprofloxacin masih dalam kriteria sensitif. Zona penghambatan yang dihasilkan ciprofloxacin cukup besar, yaitu mencapai 26 mm.
Tabel 2 Resistensi P. mirabilis terhadap beberapa antibiotik
S: sensitif, I: intermediet, R: resisten
Isolasi Fag
Fag berhasil diisolasi dari limbah peternakan ayam dan air sungai di Desa Situ Letik Kecamatan Darmaga, Bogor (Tabel 3). Fag yang didapatkan berjumlah 3 isolat, yaitu 1 isolat dari limbah peternakan ayam dan 2 isolat dari air sungai Desa Situ Letik. Hal ini mengindikasikan adanya bakteri P. mirabilis yang terdapat di limbah peternakan ayam dan air sungai di Desa Situ Letik.
Tabel 3 Hasil isolasi fag dari berbagai sumber fag
Hasil pencawanan fag menunjukkan bahwa masing-masing isolat fag menghasilkan morfologi plak yang berbeda, namun memiliki ukuran yang sama (Lampiran 6). Plak yang dibentuk oleh 3 isolat fag berdiameter 2 mm. Isolat fag 2 yang berhasil diisolasi berjumlah lebih banyak daripada isolat fag 1 dan 3, yakni sebanyak 1.3 x 108 PFU/mL(Tabel 4).
Jenis Antibiotik Konsentrasi antibiotik (µg/mL) Pengelompokan ukuran
zona hambat menurut CLSI (mm) Ukuran zona hambat (mm) Keterangan S I R Ampicillin 10 ≥17 14-16 ≤13 0 Resisten Amoxicillin 10 ≥18 14-17 ≤13 0 Resisten Trimethoprim-sulfomethaxazole 5 ≥16 11-15 ≤10 0 Resisten Ciprofloxacin 5 ≥21 16-20 ≤15 26 Sensitif
Sumber fag Jumlah
sampel Jumlah ulangan Jumlah sampel yang mengandung fag Jumlah isolat fag Keterangan
Limbah cair rumah tangga 2 4 - - -
Feses ayam 2 3 - - -
Feses kambing 2 3 - - -
Limbah peternakan ayam 2 4 1 1 Fag 1
Air sungai Ciparigi 2 2 - - -
Air sungai Situ Letik 2 4 1 2 Fag 2, Fag 3
13
Tabel 4 Karakteristik isolat-isolat fag litik P. mirabilis
*Isolat fag tidak dapat ditumbuhkan kembali
Hasil purifikasi dan produksi terhadap ketiga isolat fag menunjukkan bahwa isolat fag yang dapat dimurnikan dan ditumbuhkan kembali adalah isolat fag 2. Isolat fag 1 dan 3 tidak dapat diproduksi karena kedua isolat tersebut tidak dapat ditumbuhkan kembali saat proses pencawanan fag. Oleh karena itu, isolat fag 2 dipilih sebagai isolat fag P. mirabilis yang dapat dikarakterisasi morfologi dan proteinnya. Hasil produksi isolat fag 2 sebagai fag P. mirabilis yang berhasil diproduksi kembali adalah sebesar 1.61 x 109 PFU/mL.
Kisaran Inang Fag
Hasi uji kisaran inang menunjukkan bahwa fag P. mirabilis bersifat spesifik. Fag P. mirabilis hanya dapat menginfeksi P. mirabilis dan tidak dapat menginfeksi bakteri lain seperti B. pumilus, P. damselae, Salmonellla sp. dan EPEC K.1.1 (Tabel 5).
Tabel 5 Kisaran inang fag P. mirabilis
Morfologi Fag
Berdasarkan hasil pengamatan dengan Transmission electron microscope, diketahui bahwa fag P. mirabilis memiliki kepala berbentuk heksagonal ikosahedral dan ekor yang panjang berbentuk tabung heliks (Gambar 2). Diameter Isolat fag Jumlah plak (PFU/mL) Morfologi plak
Fag 1 1 x 104* Plak bulat, bening, diameter 2 mm, memiliki cincin di sekitar plak
Fag 2 1.3 x 108 Plak bulat, samar, diameter 2 mm, tidak ada cincin di sekitar plak
Fag 3 2 x 107* Plak bulat, bening, diameter 2 mm, tidak ada cincin di sekitar plak
Bakteri inang Keterangan
Proteus mirabilis Terbentuk plak Salmonella sp Tidak terbentuk plak
EPEC K.1.1 Tidak terbentuk plak
Bacillus pumilus Tidak terbentuk plak Photobacterium damselae Tidak terbentuk plak
14
kepala fag P. mirabilis adalah 68.185.nm, panjang ekor mencapai 109.091 nm dan ekor berdiameter 18.182 nm.
Gambar 2 Morfologi fag P. mirabilis menggunakan TEM model JEOL JEM-1010 dengan pewarnaan 2% uranil asetat, perbesaran 60.000x, Bar 100 nm. Ket: a. Kepala fag dan b. ekor fag,
Karakteristik Protein Fag Proteus mirabilis
Berdasarkan hasil analisis menggunakan SDS-PAGE diketahui terdapat pita-pita protein yang diantaranya berukuran 90.50, 82.03, 74.35, 43.31, 37.37, 30.70, 27.83 dan 20.72 kDa (Gambar 3). Hasil perhitungan terhadap konsentrasi protein fag P. mirabilis menunjukkan bahwa konsentrasi proteinnya sebesar 316.198 µg/mL.
Gambar 3 Kisaran berat molekul protein fag P. mirabilis pada SDS-PAGE. 1) Marker, 2), 3), 4) Protein fag P. mirabilis
a
e
b
15
Pembahasan
Hasil analisis terhadap patogenitas P. mirabilis menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki toksin berupa alfa hemolisin sebagai salah satu faktor virulensinya. Alfa hemolisin adalah prototipe dari racun RTX (repeat toxin), yaitu sebuah kelompok protein yang memiliki banyak struktur genetik dan struktural. Sanchez et al. (2011) mengatakan alfa hemolisin merupakan faktor virulensi penting pada bakteri patogen yang dapat mengakibatkan berbagai kasus infeksi. Alfa hemolisin sebagai salah satu faktor virulen bakteri patogen mampu membentuk pori sehingga memicu respon seluler dan efek jangka panjang bagi organisme inang seperti mamalia. Konsentrasi tinggi alfa toksin dapat menyebabkan lisis beberapa sel-sel seperti eritrosit, granulosit dan monosit.
Tahapan isolasi fag yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan metode enrichment. Prinsip metode ini adalah memperkaya nutrisi media pertumbuhan bakteri agar pertumbuhan bakteri meningkat sehingga replikasi fag juga semakin banyak. Fag yang bersifat parasit intraseluler obligat akan bereplikasi dengan baik, cepat dan dalam jumlah yang banyak apabila kondisi pertumbuhan bakteri inangnya berada pada kondisi optimum. Bakteri P. mirabilis yang digunakan sebagai bakteri inang untuk mengisolasi fag ditumbuhkan di dalam media cair NB dengan suhu optimum 37 oC pada fase logaritma yakni saat kultur bakteri P. mirabilis pada OD600nm=1 dengan jumlah bakteri mencapai 108 CFU/mL.
Verifikasi keberhasilan isolasi fag dilakukan dengan melakukan pencawanan fag bersama dengan bakteri inang P. mirabilis. Proses pencawanan ini menggunakan teknik media double layer. Bagian atas media double layer terdiri atas media agar dengan konsentrasi 0.8 %. Pada konsentrasi ini, fag dapat bergerak lebih cepat mencari dan menemukan bakteri inang disekitarnya. Bagian bawah media double layer adalah media nutrient agar yang menyediakan nutrisi untuk pertumbuhan bakteri inang, sehingga bakteri inang dapat membelah lebih banyak dan lebih cepat karena nutrisi yang banyak akibatnya fag juga semakin banyak menginfeksi dan melisiskan bakteri inang.
Hasil pencawanan fag menunjukkan bahwa terdapat zona kerusakan sel berupa zona berwarna bening. Fag yang melisiskan sel bakteri inang akan membentuk zona bening pada media yang disebut plak. Plak merupakan suatu indikator bahwa fag yang diisolasi bersifat litik dan mampu melisiskan bakteri inangnya. Plak atau zona bening yang terbentuk merupakan parameter adanya kerusakan sel bakteri akibat infeksi fag. Plak yang diperoleh dari ketiga isolat fag pada penelitian ini memiliki morfologi yang berbeda, yaitu plak bening atau samar, berbentuk bulat dengan atau tanpa cincin disekitar plak dan berukuran 2 mm. Menurut Abedon et al. (2000), ukuran plak berbanding lurus dengan tingkat efisiensi adsorpsi fag, panjang periode laten, yakni waktu yang dibutuhkan fag untuk melisiskan bakteri inangnya dan ukuran ledakan progeni yakni banyaknya progeni yang dilepaskan saat sel inang lisis, sedangkan morfologi plak tergantung dari beberapa faktor diantaranya sifat fag, bakteri yang menjadi inangnya dan kondisi pertumbuhan bakteri. Hasil produksi fag terhadap isolat fag 1 dan 3
16
menunjukkan bahwa kedua isolat fag tersebut tidak dapat diproduksi untuk dilakukan perbanyakan karena tidak dapat ditumbuhkan kembali saat proses pencawanan fag. Hal ini diduga disebabkan oleh perbedaan tingkat stabilitas pada masing-masing isolat fag. Faktor stabilitas pada fag sangat erat kaitannya dengan protein-protein penyusun fag (Evilevitch et al. 2010).
Berdasarkan hasil penelitian, diketahui pembentukan plak pada isolat fag 2 sebagai fag P. mirabilis yang berhasil dipurifikasi dan diproduksi terjadi antara 30-35 menit waktu inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa fag P. mirabilis sangat efektif dan bersifat infektif kuat terhadap Proteus mirabilis yang telah resisten terhadap antibiotik ampicillin, amoxicillin, dan trimetoprin-sulfomethoxazole, sehingga penelitian ini menjadi bukti nyata kemampuan fag yang bersifat ramah lingkungan dan aman dalam mengontrol serta mengendalikan bakteri P. mirabilis yang dapat menyebabkan diare dan sering mengkontaminasi air dan makanan. Hasil penelitian Shao dan Wang (2008) menunjukkan bahwa waktu lisis optimal fag berkisar diantara 29,3-68 menit. Waktu lisis ini dipengaruhi oleh laju adsorpsi fag pada bakteri inangnya. Fag yang memiliki laju adsorpsi tinggi akan menghasilkan waktu lisis yang relatif lebih cepat. Oleh karena itu, fag P. mirabilis dapat disimpulkan memiliki laju adsorpsi yang tinggi dengan waktu lisis yang pendek. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap ukuran plak diketahui bahwa ukuran plak yang dihasilkan oleh fag P. mirabilis akan semakin membesar seiring dengan bertambahnya waktu inkubasi hingga 24 jam. Jika kepadatan bakteri meningkat, maka jumlah plak yang terbentuk semakin banyak dan jarak setiap plak semakin rapat. Toro et al. (2005) menyatakan bahwa setelah menginfeksi bakteri inangnya, fag dengan siklus litik akan bereplikasi di dalam sel inang untuk membentuk fag-fag baru lalu keluar sel dengan melisiskan sel inang hingga pada akhirnya masing-masing fag baru akan mencari dan menginfeksi bakteri inang lain disekitarnya. Proses lisis ini menggunakan enzim lisozim yang disandikan oleh gen pada fag namun disintesis di dalam sel bakteri inang (Tortora et al. 2006). Madigan et al. (2011) menyatakan lisozim dapat memutuskan ikatan β -1,4-glikosida antara N-asetil glukosamin dan N-asetil muramat, akibatnya bakteri menjadi lisis karena adanya kerusakan pada struktur peptidoglikan.
Saat dilakukan pencawanan fag, maka fag yang tumbuh memiliki siklus hidup yang terdiri dari fase ekstraseluler yakni ketika proses adsorpsi fag atau difusi virion dan fase intraseluler yakni saat proses produksi progeni yang baru. Tingkat adsorpsi fag yang tinggi terhadap bakteri inang akan memungkinkan virion untuk menyebar lebih jauh mencari dan menemukan bakteri inang baru lainnya di dalam cawan, sedangkan jika fase intraseluler yang tinggi akan menghasilkan lebih banyak progeni yang dapat dikeluarkan (Gallet et al. 2011).
Tahapan pemurnian fag yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan membran filter milipore 0.22 µm. Hal ini akan mengakibatkan P. mirabilis sebagai bakteri inang yang berukuran 1.5 x 2.0 µm tidak bisa melewati pori membran sedangkan fag yang berukuran lebih kecil dapat melewati pori membran sehingga filtrat yang diperoleh dapat disimpan sebagai stok fag yang murni. Stok fag yang telah diperoleh pada penelitian ini disimpan pada suhu ruang di dalam bufer Saline Magnesium (SM). Menurut Rode et al. (2011), penyimpanan fag lebih stabil pada suhu ruang karena penyimpanan pada suhu yang rendah di dalam kulkas dapat menyebabkan penggumpalan partikel fag. Hal ini dapat mengakibatkan ketidakstabilan partikel fag. Jika fag disimpan pada suhu tinggi,
17
maka dapat mengakibatkan terjadinya kerusakan partikel fag karena sebagian besar protein yang menyusun partikel fag rusak akibat denaturasi protein. Bufer yang digunakan untuk penyimpanan fag P. mirabilis adalah bufer SM. Hasil penelitian Astriningsih (2012) menunjukkan adanya tingkat stabilitas yang sama antara fag Salmonella FR 19, 38 dan 84 yang disimpan dalam bufer SM pada suhu ruang dan suhu rendah. SM bufer terdiri atas gelatin, NaCl, Tris-Cl, dan MgSO4.7H2O. MgSO4 merupakan sumber multivalent ion yang berfungsi mengurangi tekanan hidrasi pada DNA fag. Tekanan hidrasi yang berlebih dapat menyebabkan perubahan struktur kapsid fag (Evilevitch et al. 2010). Gelatin yang terdapat di dalam SM buffer berfungsi melindungi fag dari kondisi yang kurang menguntungkan (Robenson et al. 2008). Abedon (2008) menyatakan bahwa kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan akan mengganggu kemampuan replikasi dan infektifitas fag, sehingga berpengaruh pada pembentukan plak.
Stok fag murni dapat dititrasi dengan menghitung jumlah plak yang terbentuk pada cawan. Tortora et al. 2006 menyatakan bahwa satu plak berasal dari replikasi satu fag sehingga jumlah fag dapat ditentukan dengan menghitung jumlah plak yang terbentuk (Plaque Forming Unit (PFU)). Kuantifikasi fag dilakukan menggunakan perbandingan yang sama yaitu 100 µl kultur bakteri
(OD600nm=1) dan 100 µl stok fag, sehingga setiap plak yang terbentuk berasal dari
satu fag. Barrow et al. (1998) menyatakan bahwa perbandingan yang sama antara konsentrasi fag dan konsentrasi bakteri inang juga dapat meningkatkan laju lisis sel bakteri oleh fag.
Uji kisaran inang dilakukan terhadap 4 bakteri uji yaitu Salmonella sp., EPEC K.1.1, Bacillus pumilus dan Photobacterium damselae. Uji ini dilakukan untuk mengetahui spesifitas fag dan besarnya spektrum infeksi fag. Hasil uji kisaran inang menunjukkan bahwa plak hanya terbentuk ketika fag diinfeksikan dengan bakteri inang P. mirabilis. Fag yang diinfeksikan dengan bakteri uji lain seperti Salmonella sp., EPEC K.1.1, Bacillus pumilus, dan Photobacterium damselae tidak menunjukkan adanya pembentukan plak. Hasil ini mengindikasikan bahwa spektrum infeksi fag P. mirabilis adalah sempit dan spesifik khusus bagi P. mirabilis. Sifat spesifik inang yang dimiliki fag merupakan suatu keunggulan fag yang tidak dimiliki antibiotik. Fag lebih bersifat aman karena hanya menginfeksi dan mereduksi bakteri inang spesifik tanpa mengganggu mikroflora normal usus.
Spesifitas fag P. mirabilis terbentuk karena adanya molekul reseptor spesifik pada P. mirabilis yang dapat dikenali oleh fagnya. Fag P. mirabilis tidak dapat mengenali molekul-molekul reseptor yang terdapat pada bakteri lain seperti Bacillus pumilus, Photobacterium damselae, Salmonella dan EPEC K.1.1. Molekul-molekul reseptor tersebut dapat berupa flagella, polisakarida, lipopolisakarida, kapsul, protein pada dinding sel, pili, fimbria, asam teikoat (Gurnev et al. (2006). Perbedaan molekul reseptor pada spesies-spesies bakteri yang berbeda sangat berpengaruh terhadap sifat spesifitas fag (Prescott et al. 2002). Bakteri yang berbeda memiliki kepekaan yang berbeda terhadap fag nya masing-masing karena adanya perbedaan pada molekul-molekul reseptor yang dikenali oleh fag (Flynn et al. 2004). Tortora et al. (2006) menyatakan spesifitas fag diduga menentukan tahap adsorpsi atau pelekatan fag. Proses pelekatan ini
18
bersifat sangat spesifik antara reseptor yang dikenali fag dan fag tertentu sebagai pasangannya. Jika reseptor tidak dikenali oleh fag maka tidak terjadi tahap adsorpsi atau pelekatan fag, akibatnya proses infeksi tidak terjadi. Kudva et al. (1999) menyatakan variasi molekul reseptor dapat menjadi penghalang adsorpsi yang mempengaruhi spesifitas fag terhadap bakteri inangnya masing-masing. Saat tahapan adsorpsi, fag akan menempel pada reseptor spesifik di dinding sel bakteri. Proteus mirabilis sebagai salah satu bakteri Gram negatif diduga memiliki reseptor spesifik berupa protein dan lipopolisakarida yang berada pada lapisan luar dinding sel yang dapat dikenali oleh fag tertentu.
Berdasarkan analisis dengan SDS-PAGE, diketahui bahwa berat protein yang dimiliki berkisar antara 20-91 kDa. Ukuran berat molekul 8 pita masing-masing sebesar 90.50, 82.03, 74.35, 43.31, 37.37, 30.70, 27.83 dan 20.72 kDa (Gambar 3). Perkiraan ukuran berat molekul protein tersebut berada dalam kisaran berat molekul fag spesifik Shigella boydii, fag SboM-AG3 dengan berat molekul sebesar 12.7-126.3 kDa. Molekul protein dengan berat tertentu menunjukkan penyusun komponen fag seperti kepala, ekor dan serabut ekor (Anany 2011). Protein berukuran 30.70 kDa diduga adalah protein struktural penyusun kapsid, sedangkan protein berukuran 27.83 kDa diduga adalah protein penyusun ekor. Hal Berat molekul protein-protein tersebut memiliki kemiripan dengan ukuran protein struktural penyusun ekor pada fag JL-1 dan protein penyusun kapsid pada fag spesifik pseudomonas fluorescens (Lu et al. 2005; Sillankorva et al. 2008). Konsentrasi protein yang dimiliki fag P. mirabilis relatif besar. Fag P. mirabilis mengandung protein sebesar 316.198 µg/mL. Hasil pengamatan morfologi fag menggunakan Transmission electron microscope diketahui bahwa fag memiliki ekor yang panjang dengan kepala fag yang berukuran relatif besar berbentuk heksagonal ikosahedral. Fag dengan bentuk kepala heksagonal ikosahedral memiliki kapsid dengan 20 bidang permukaan berbentuk segitiga. Menurut International Committee on Taxonomy of Viruses, ciri-ciri yang dimiliki oleh fag P. mirabilis tersebut termaksuk ke dalam ordo Caudovirales famili Myoviridae. Virus yang termaksuk ordo Caudovirales dan famili Myoviridae memiliki DNA double-strand dan ekor yang kontraktil. Virus dari famili Myoviridae memiliki kepala berbentuk heksagonal dan ekor fag diselubungi oleh selubung kontraktil yang terhubung dengan base-plate (Prozesky et al. 1995).
19