Hasil
Karakteristik Morfologi Aktinomiset Endofit Padi
Sebanyak tujuh isolat aktinomiset endofit padi dapat tumbuh dengan baik pada media YSA dengan morfologi koloni yang beragam (Lampiran 1). Koloni aktinomiset sebagian besar tampak keras seperti tumbuh mengakar ke dalam agar-agar, berbeda dengan koloni mikrob lainnya yang tampak lunak di atas media agar-agar. Isolat IPBCC.b.14.1531, IPBC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, IPBCC.b.14.1536, dan IPBCC.b.13.1530 mampu membentuk miselia aerial dan substrat yang beragam dari putih, krem, cokelat, hingga abu-abu, sehingga ketujuh isolat tersebut tergolong ke dalam genus Streptomyces sp. Keseluruhan isolat aktinomiset endofit di atas juga memiliki karakter percabangan miselia yang luas menyerupai cendawan serta menunjukkan penataan rantai spora yang tersusun keriting, seperti kait hingga spiral (Gambar 3).
Gambar 3 Keragaman koloni Streptomyces sp. endofit padi umur 10 hari pada media YSA (Gb. atas) dan tipe rantai spora Streptomyces sp. endofit dilihat dengan mikroskop cahaya perbesaran 400x (Gb. bawah). A= IPBCC.b.14.1531, B= IPBCC.b.14.1532, C= IPBCC.b.14.1533, D= IPBCC.b.14.1534, E= IPBCC.b.14.1535, F= IPBCC.b.14.1536, G= IPBCC.b.13.1530.
Identitas Molekuler Aktinomiset Endofit Padi
Adanya pita tunggal DNA yang tampak di atas sinar UV dengan ukuran di atas 10000 pasang basa (marker 1 Kb), menandakan bahwa isolasi DNA genom berhasil dilakukan pada ketujuh isolat aktinomiset endofit tanaman padi (Gambar 4). Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil Nanodrop pada ketujuh isolat aktinomiset endofit tersebut beragam, berkisar antara 20 hingga 98 ng/µL (Tabel 2). Kuantitas DNA tertinggi yang diperoleh ditunjukkan oleh isolat IPBCC.b.14.1531 sebesar 97.7 ng/µL, sedangkan konsentrasi DNA terendah
F F A B C D E F G S RF S RA RF RF RF
14
ditunjukkan oleh isolat IPBCC.b.14.1535 sebesar 20 ng/µL. Kemurnian DNA yang diperoleh berdasarkan rasio 260/280, dari ketujuh isolat aktinomiset endofit menunjukkan nilai kemurnian yang berkisar antara 0.82 hingga 3.23.
Gambar 4 DNA genom aktinomiset endofit padi hasil elektroforesis pada 1% gel agarosa
Tabel 2 Kuantitas DNA genom aktinomiset endofit padi
Gambar 5 Hasil amplifikasi PCR gen 16S rRNA aktinomiset endofit padi (~1480 pb) menggunakan primer 20F dan 1500R. Marker 1 Kb, sumur ke- 1-7: IPBCC.b.14.1531, IPBCC.b.14.1532,
IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, IPBCC.b.14.1536, dan IPBCC.b.13.1530.
Kode isolat OD (Optical Density) 260 nm 280 nm 260/280 Konsentrasi DNA (ng/µL)
IPBCC.b.14.1531 1.955 0.605 3.23 97.7 IPBCC.b.14.1532 1.655 1.410 1.17 82.7 IPBCC.b.14.1533 0.588 0.546 1.08 29.4 IPBCC.b.14.1534 0.806 0.797 1.01 40.3 IPBCC.b.14.1535 0.401 0.341 1.18 20.0 IPBCC.b.14.1536 1.253 1.537 0.82 62.6 IPBCC.b.13.1530 1.222 0.610 2.00 61.1
15 Tujuh isolat aktinomiset endofit padi berhasil diamplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 20F dan 1500R dengan ukuran fragmen DNA yang diharapkan ~1480 pb (Gambar 5). Hasil sekuensing tujuh isolat aktinomiset endofit padi menunjukkan hasil yang baik, dapat dilihat pada dendogram sekuen nukleotida gen 16S rRNA yang tidak saling tumpang tindih (Lampiran 2). Hasil sekuen nukleotida gen 16S rRNA yang disejajarkan menggunakan program BLAST.N sebelumnya telah dilakukan pengoreksian terhadap primer yang digunakan dan dilakukan pensejajaran antara sekuen forward dan reverse. Sekuen tujuh isolat aktinomiset endofit padi yang disejajarkan dengan strain pembanding di GenBank menunjukkan bahwa IPBCC.b.14.1531 (1320 pb) memiliki kemiripan sekuen dengan Streptomyces albolongus NBRC 13465 dan S. cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 sebesar 94%, begitu pula dengan isolat IPBCC.b.14.1532 (1424 pb), IPBCC.b.14.1533 (1398 pb), dan IPBCC.b.14.1536 (1386 pb) yang memiliki kemiripan sekuen dengan kedua spesies tersebut berturut-turut sebesar 92%, 94%, dan 95%. Isolat IPBCC.b.14.1534 (1478 pb) memiliki kemiripan sekuen dengan S. anulatus NBRC 12755 sebesar 92%, isolat IPBCC.b.14.1535 (1118 pb) memiliki kemiripan dengan S. bungoensis sebesar 92%, sedangkan isolat IPBCC.b.13.1530 (1410 pb) memiliki kemiripan dengan S. misionensis NRRL B-3230 sebesar 99% (Tabel 3). Isolat IPBCC.b.14.1531, IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, dan IPBCC.b.14.1536 memiliki nilai identitas maksimum <97% dengan E-value 0.0, sehingga keenam isolat tersebut diduga merupakan novel spesies, dengan kesamaan morfologi koloni dan mikroskopis, serta kedekatan sekuen gen 16S rRNA dengan strain pembanding.
Tabel 3 Persentase kemiripan sekuen gen 16S rRNA aktinomiset endofit padi dengan strain pembanding GenBank
*Keterangan: NRRL= National Research Center for Agricultural Utilization Research, USA. NBRC= NITE Biological Resource Center, National Institute o Technology and Evaluation, Japan IPBCC= IPB Culture Collection
Isolat Strain pembanding (GenBank)
%
Kemiripan No. akses IPBCC.b.14.1531 S.cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 94% NR. 043851.1 S. albolongus NBRC 13465 94% NR. 041144.1 IPBCC.b.14.1532 S. cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 92% NR. 043851.1 S. albolongus NBRC 13465 92% NR. 041144.1 IPBCC.b.14.1533 S. cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 94% NR. 043851.1 S. albolongus NBRC 13465 94% NR. 041144.1 IPBCC.b.14.1534 S. anulatus NBRC 12755 92% NR. 043851.1 IPBCC.b.14.1535 S. bungoensis NBRC 15711 92% NR. 041191.1 IPBCC.b.14.1536 S. cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 95% NR. 043851.1 S. albolongus NBRC 13465 95% NR. 041144.1 IPBCC.b.13.1530 S. misionensis NRRL B-3230 99% NR. 044138.1
16
Hasil analisis konstruksi pohon filogenetik juga menunjukkan konsistensi bahwa isolat IPBCC.b.14.1531, IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, dan IPBCC.b.14.1536 diduga merupakan novel spesies. Keenam isolat tersebut berada pada kluster yang sama dengan S. albolongus, S. cavourensis subsp. cavourensis, S. anulatus, dan S. bungoensis (kluster I), sedangkan isolat IPBCC.b.13.1530 berada pada kluster II yang memiliki hubungan kekerabatan dengan S. misionensis. Kluster I dan kluster II merupakan kluster genus Streptomyces. Terlihat pada pohon filogenetik bahwa kedua kluster tersebut terpisah dari kluster outgroup Micromonospora (aktinomiset non-Streptomyces) dan P. aeruginosa (bakteri Gram negatif) (Gambar 6). Berdasarkan analisis p-distance diketahui bahwa komparasi internal keenam isolat (kluster Ia) tersebut juga menunjukkan keragaman spesies, tampak jelas pada matriks jarak genetik berdasarkan perbedaan sekuen nukleotida (Tabel 4). Pohon filogenetik 16S rRNA berdasarkan matriks jarak genetik menunjukkan bahwa sekuen IPBCC.b.14.1536 memiliki kedekatan dengan IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1535 memiliki kedekatan dengan IPBCC.b.14.1532, sedangkan sekuen IPBCC.b.14.1531 dan IPBCC.b.14.1534 menunjukkan pohon filogenetik yang bersifat monofiletik, keduanya terpisah dari isolat lainnya (Gambar 7). Dengan demikian, dari keenam isolat aktinomiset endofit padi yang diduga novel spesies, dapat dikelompokkan menjadi empat spesies.
Gambar 6 Pohon filogenetik gen 16S rRNA aktinomiset endofit padi sepanjang 1532 nukleotida
Tabel 4 Matriks jarak genetik (p-distance) sekuen gen 16S rRNA enam isolat aktinomiset endofit padi
Isolat 1 2 3 4 5 6 7 S. albolongus NBRC 13465 0.000 IPBCC.b.14.1531 0.026 IPBCC.b.14.1532 0.086 0.077 IPBCC.b.14.1533 0.031 0.042 0.082 IPBCC.b.14.1534 0.054 0.040 0.068 0.057 IPBCC.b.14.1535 0.086 0.079 0.079 0.085 0.073 IPBCC.b.14.1536 0.006 0.028 0.088 0.033 0.055 0.089 Kluster I Outgroup I Outgroup II Kluster II IPBCC.b.14.1534 IPBCC.b.14.1532 IPBCC.b.14.1535 IPBCC.b.14.1531 IPBCC.b.14.1533 IPBCC.b.14.1536
Streptomyces albolongus strain NBRC 13465
Streptomyces cavourensis subsp. cavourensis strain NRRL 2740 Streptomyces anulatus strain NBRC 12755
Streptomyces bungoensis strain NBRC 15711
Streptomyces phaeoluteichromatogenes strain NRRL B-5799 IPBCC.b.13.1530
Streptomyces misionensis strain NRRL B-3230 Micromonospora sp. AMS622
Pseudomonas aeruginosa strain ME BHU4 95 100 84 95 99 68 97 92 95 63 73 93 0.02 Kluster Ia
17
Gambar 7 Pohon filogenetik berdasarkan matriks jarak genetik (p-distance) sekuen gen 16S rRNA antara enam isolat aktinomiset endofit padi
Gen nifH Aktinomiset Endofit Padi
Sebanyak tiga isolat (IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536) berhasil diamplifikasi sekuen gen nifH menggunakan primer IGK dan NDR-1 (tahap I) serta PolF dan AQER (tahap II). Amplifikasi tahap I menghasilkan ukuran fragmen DNA yang merupakan daerah nifH-nifD yaitu ~1.2 Kb dengan beberapa pita yang tampak beragam, seperti halnya tampak pada kontrol positif. Produk PCR tahap II ketiga isolat aktinomiset endofit, termasuk B. japonicum USDA 110 sebagai kontrol positif menunjukkan adanya pita tunggal gen nifH dengan ukuran fragmen DNA yang diharapkan yaitu ~320 pb, sedangkan E. coli sebagai kontrol negatif tidak menunjukkan pita tunggal DNA (Gambar 8).
Gambar 8 Hasil amplifikasi PCR gen nifH aktinomiset endofit padi (~320 pb) menggunakan primer PolF dan AQER. a) Marker 100 pb, sumur
ke-1-7: IPBCC.b.14.1531,IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535,IPBCC.b.14.1536, dan IPBCC.b.13.1530; b) Marker 1 Kb, sumur ke-1: B. japonicum
sebagai kontrol positif, sumur ke-2: E.coli sebagai kontrol negatif. Hasil sekuensing dari tiga isolat IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536 ditunjukkan dengan grafik dendogram yang menggambarkan letak nukleotida yang diamplifikasi secara hulu dan hilir (Lampiran 3). Sekuen
(a)
(b) Spesies I
Spesies IV
Spesies II (monofiletik) Spesies III (monofiletik)
18
nukleotida ketiga isolat tersebut menunjukkan hasil yang baik, ditunjukkan dengan adanya puncak yang tidak saling tumpang tindih. Berdasarkan pensejajaran dengan sekuen gen nifH di GenBank, diperoleh hasil yang menunjukkan bahwa sekuen parsial ketiga isolat tersebut memiliki kemiripan sekuen nifH dengan Herbaspirillum sp. B501 sebesar 95%-99%, Uncultured bacterium clone BN-A6 nifH sebesar 95%-98%, Uncultured bacterium clone IPA64 nifH sebesar 94%-99%, dan Uncultured bacterium clone IPA100 nifH sebesar 93%-98% (Tabel 5).
Hasil analisis pohon filogenetik gen nifH menunjukkan konsistensi bahwa ketiga isolat Streptomyces endofit (IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536) memiliki kedekatan dengan gen nifH Herbaspirillum sp. yang berada pada kluster I, dan terpisah dari kluster outgroup. Analisis keragaman jarak genetik antara tiga isolat dengan Frankia sp., Rhizobium sp., L. ferrooxidans, dan K. pneumonia menunjukkan adanya perbedaan sekuen gen nifH sebesar 18-28% dan lebih dari 59% jika dibandingkan dengan sekuen gen nifH B. japonicum (Tabel 6).
Tabel 5 Persentase kemiripan sekuen gen nifH aktinomiset endofit padi dengan strain pembanding GenBank
*Keterangan: A= IPBCC.b.13.1530, B= IPBCC.b.14.1531, C= IPBCC.b.14.1536
Tabel 6 Matriks jarak genetik (p-distance) sekuen gen nifH aktinomiset endofit padi Isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 IPBCC.b.13.1530 nifH IPBCC.b.14.1531 nifH 0.000 IPBCC.b.14.1536 nifH 0.010 0.010 Herbaspirillum sp. B501 nifH nifD 0.005 0.005 0.005 Uncultured bacterium
clone BN-A6 nifH 0.014 0.014 0.014 0.010 Frankia sp. ACN14a nifH 0.286 0.286 0.276 0.281 0.281 Rhizobium sp. Cs217 nifH 0.195 0.195 0.186 0.190 0.186 0.252 L. ferroxidans 0.210 0.210 0.210 0.205 0.205 0.305 0.181 K. pneumoniae HUB-IV-004 nifH 0.200 0.200 0.200 0.195 0.200 0.276 0.252 0.252 B. japonicum CTF132 nifH 0.590 0.590 0.595 0.595 0.590 0.576 0.581 0.586 0.629 Strain pembanding (GenBank) % Kemiripan No. akses A B C
Herbaspirillum sp. B501 nifH 95 95 99 AB196476.1 Uncultured bacterium clone BN-A6 nifH 95 95 98 HQ335398.1 Uncultured bacterium clone IPA64 nifH 94 94 99 EU048006.1 Uncultured bacterium clone IPA100 nifH 93 93 98 EU048040.1
19
Gambar 9 Pohon filogenetik gen nifH aktinomiset endofit padi sepanjang 336 nukleotida
Kemampuan Fiksasi Nitrogen oleh Aktinomiset Endofit Padi
Data uji in vitro aktivitas fiksasi N2 pada penelitian ini menunjukkan bahwa terjadi konsistensi dengan hasil analisis gen nifH, dari tujuh isolat aktinomiset endofit, tiga isolat diantaranya yaitu IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536 dinyatakan mampu memfiksasi nitrogen. Ketiga isolat tersebut mampu tumbuh dengan baik pada media bebas nitrogen (BNF) padat dengan karakteristik pertumbuhan koloni yang lebih tipis dibandingkan dengan pertumbuhan koloni pada media YSA (Gambar 10), sedangkan keempat isolat lainnya tidak tumbuh dengan baik.
Gambar 10 Pertumbuhan koloni aktinomiset endofit padi pada media BNF padat umur inkubasi 10 hari (atas) dibandingkan dengan pertumbuhan
koloni pada media YSA umur 10 hari (bawah).
A= IPBCC.b.13.1530, B= IPBCC.b.14.1531, C= IPBCC.b.14.1536. Melalui uji pengukuran produksi amonia, isolat IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536 juga mampu memproduki amonia dengan konsentrasi masing-masing berturut-turut sebesar 0.065 ppm, 0.014 ppm, dan 0.076 ppm, sedangkan keempat isolat lainnya (IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, dan IPBCC.b.14.1535) menghasilkan rata-rata produksi amonia sebesar nol ppm atau tidak memproduksi amonia (Gambar 11). Dengan demikian dapat dinyatakan bahwa keempat isolat dari tujuh isolat
Kluster I Kluster II Outgroup IPBCC.b.13.1530 nifH IPBCC.b.14.1531 nifH IPBCC.b.14.1536 nifH
Herbaspirillum sp. B501 nifH nifD genes Uncultured bacterium clone BN-A6 nifH gene Uncultured bacterium clone IPA64 nifH gene Uncultured bacterium clone IPA100 nifH gene Uncultured bacterium clone 29.82 nifH gene Uncultured bacterium clone 29.56 nifH gene
Frankia sp. ACN14a nifH gene Rhizobium sp. Cs217 nifH gene
Leptospirillum ferrooxidans culture-collection DSM:2705 nifH gene complete Klebsiella pneumoniae isolate HUB-IV-004 nifH genecomplete
Bradyrhizobium japonicum strain CTFI32 nifH gene 57 65 85 54 85 67 69 36 53 25 50 0.1
20
aktinomiset endofit tidak dapat memfiksasi N2 dari udara. Konsentrasi amonia ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva standar, dengan pengukuran bobot biomassa sel juga dilakukan dalam penelitian ini (Lampiran 4). Bobot biomassa sel aktinomiset endofit berbanding lurus dengan kemampuan produksi amonia masing-masing sel. Isolat IPBCC.b.14.1536 memiliki bobot biomassa yang paling tinggi sebesar 29.80 mg berbanding lurus dengan kemampuan produksi amonia yang juga lebih tinggi (0.076 ppm) dibandingkan dengan kedua isolat lainnya (Lampiran 4).
Gambar 11 Produksi amonia dari aktinomiset endofit padi setelah inkubasi selama 10 hari pada media BNF. B. japonicum sebagai kontrol
positif dan E. coli sebagai kontrol negatif.
Pembahasan
Karakterisasi Morfologi Koloni Aktinomiset Endofit Padi
Aktinomiset endofit berhasil diisolasi dari akar, batang, dan daun lima varietas tanaman padi yang berasal dari Jawa Barat, dan berdasarkan karakteristik morfologi sebagian besar isolat tergolong ke dalam Streptomyces spp. Penelitian di China juga melaporkan bahwa aktinomiset endofit berhasil diisolasi dari akar dan daun empat varietas tanaman padi, dan sebagian besar juga tergolong ke dalam Streptomyces spp. (Tian et al. 2004). Karakterisasi spesies Streptomyces spp. umumnya berdasarkan warna miselia substrat dan aerial, produksi pigmen terlarut, bentuk, dan penampakan spora di permukaan media padat. Menurut Ghadin et al. (2008) pertumbuhan Streptomyces sp. di atas media padat menunjukkan miselia dengan spora aerial berwarna putih, cokelat hingga abu-abu. Streptomyces sp. memiliki tipe penataan rantai spora yaitu tipe spirales (S), tipe rectiflexibiles (RF), dan tipe retinaculiaperti (RA) (Shirling dan Gottlieb 1966). Berdasarkan karakterisasi morfologi dan mikroskopis, tujuh isolat aktinomiset endofit padi pada penelitian ini menunjukkan bahwa semua isolat tergolong ke dalam Streptomyces.
21
Identitas Molekuler Gen 16S rRNA Aktinomiset Endofit Padi
Gen 16S rRNA merupakan komponen ribosom prokariot subunit 30S, yang umum digunakan untuk tujuan karakterisasi molekuler, menentukan hubungan filogenetik antar isolat prokariot dan menganalisis kekerabatannya dalam suatu ekosistem. Homologi sekuen 16S rRNA < 97.5% dapat dinyatakan sebagai spesies yang berbeda atau novel spesies (Stackebrandt dan Goebel 1994). Primer 20F didesain untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA pada sebagian besar bakteri Gram positif, termasuk Streptomyces, sedangkan primer 1500R didesain untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA pada hampir sebagian besar domain bakteri (Weisburg et al. 1991). Untuk mengamati hubungan kekerabatan antar takson, pohon filogenetik dikonstruksi dari sebagian besar daerah konservatif sekuen gen 16S rRNA, yang kemudian dikonfirmasi ciri fenotip secara klasik yaitu ciri-ciri morfologi dan karakteristik isolat termasuk warna spora dan penampakan koloni di atas media padat. Metode tersebut digunakan untuk mengklasifikasi dan mengidentifikasi genus Streptomyces hingga tingkat spesies (Labeda et al. 2011). BLAST merupakan program bioinformatika pada NCBI yang menggunakan analisis statistik untuk menghasilkan nilai skor dan E-value. Berdasarkan Claverie dan Notredame (2003), nilai skor yang ditunjukkan terdiri atas maximum score, total score, query cover, dan maximum identity, yang menunjukkan tingkat keakuratan nilai pensejajaran sekuens berupa nukleotida atau protein yang tidak diketahui dengan sekuens nukleotida atau protein yang tidak diketahui yang terdapat dalam data GenBank. Nilai skor berbanding lurus dengan tingkat homologi sekuens, semakin tinggi nilai skor maka semakin tinggi tingkat homologi antara kedua sekuens. E-value merupakan suatu nilai dugaan yang menggambarkan ukuran statistik yang signifikan terhadap kedua sekuens. Jika nilai E-value semakin tinggi, maka hal tersebut menunjukkan tingkat homologi antar sekuens rendah, sebaliknya jika semakin rendah maka menunjukkan bahwa tingkat homologi antar sekuens semakin tinggi. Nilai E-value yang bernilai nol menunjukkan bahwa kedua sekuens tersebut identik. Menurut Pertsemlidis dan Fondon III (2001) menyatakan jika kedua sekuens dinyatakan homologi, maka kedua sekuens tersebut memiliki hubungan evolusi atau hubungan kekerabatan.
Berdasarkan analisis gen 16S rRNA, pada penelitian ini dilaporkan bahwa isolat IPBCC.b.14.1531, IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, dan IPBCC.b.14.1536 memiliki indikasi novel spesies dengan persentase kemiripan sebesar < 97%, E-value 0.0, dan keenam isolat tersebut tergolong ke dalam Streptomyces spp. Untuk membuktikan bahwa keenam isolat aktinomiset endofit padi tersebut merupakan novel spesies diperlukan beberapa langkah yang perlu dilakukan selain identifikasi morfologi, fisiologi, dan molekuler identifikasi gen 16S rRNA, yaitu dengan cara pendekatan metode polifasik. Metode polifasik merupakan metode yang sangat tepat dan akurat untuk melakukan klasifikasi dan identifikasi prokariot. Prinsip metode polifasik adalah menggabungkan antara karakterisasi semua genotip, fenotip, dan informasi filogenetik. Informasi genotip diperoleh dari keberadaan DNA (mol% G+C, restriction patterns, genome size dan DNA, DNA hybridization) dan RNA di dalam sel, sedangkan informasi fenotip diperoleh dari protein dan fungsinya, perbedaan kemotaksonomi, dan ekspresi fisiologi lainnya (Vandamme et al. 1996). Selain karakterisasi genotip seperti hibridisasi DNA, menurut Otoguro et
22
al. (2009) beberapa hal yang perlu diamati pada karakter fenotip antara lain pemanfaatan sumber karbon, pertumbuhan mikrob pada suhu 37 ºC dan pertumbuhan mikrob pada kondisi 2% NaCl, sedangkan karakterisasi biokimiawi meliputi uji kandungan asam lemak, analisis isomer A2pm (diaminopimelic acid), analisis tipe fosfolipid dan menaquinon, serta kandungan G+C. Berdasarkan konstruksi pohon filogenetik, keenam isolat tersebut terletak pada satu kluster yang sama dengan S. albolongus, S. cavourensis subsp. cavourensis, S. anulatus, dan S. bungoensis. Akan tetapi keenam isolat Streptomyces spp. endofit padi tersebut berbeda sumber isolasinya dibandingkan dengan keempat strain pembanding di atas. Adanya perbedaan sumber isolasi Streptomyces spp. endofit dimungkinkan merupakan salah satu faktor yang menyebabkan adanya keragaman sekuen gen 16S rRNA pada aktinomiset endofit.
S. cavourensis subsp. cavourensis NRRL 2740 merupakan aktinomiset yang diisolasi dari kultur kapang di laut, memiliki miselia aerial berwarna kuning pudar dan tipe rantai spora RF, serta dapat memproduksi antibiotik chromomycin dan flavensomycin (Skarbek dan Brady 1978). S. albolongus NBRC 13465 diisolasi dari tanah, memiliki miselia aerial berwarna putih atau kuning pudar dengan permukaan spora yang halus di atas media padat, dan memiliki tipe rantai spora RF (Shirling dan Gottlieb 1972). Spesies tersebut diketahui memiliki kemampuan antimikrob Gram positif dan negatif (Uddin et al. 2013). S. anulatus NBRC 12755 diisolasi dari tanah, memiliki miselia aerial berwarna kuning pudar atau putih dengan miselia substrat berwarna kuning kecokelatan, memiliki tipe rantai spora RA (Shirling dan Gottlieb 1972), dan diketahui mampu memproduksi dihidroabikoviromisin (Holmalahti et al. 1998). S. bungoensis diisolasi dari tanah dengan karakteristik morfologi koloni berwarna abu-abu dan tipe rantai spora berbentuk spiral, serta diketahui dapat memproduksi antibiotik (Eguchi et al. 1993).
Analisis p-distance menunjukkan bahwa keenam isolat aktinomiset endofit (IPBCC.b.14.1531, IPBCC.b.14.1532, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.14.1534, IPBCC.b.14.1535, dan IPBCC.b.14.1536) masing-masing memiliki perbedaan sekuen nukleotida, yang artinya jarak genetik antar keenam isolat tersebut juga berbeda. Komparasi internal keenam isolat tersebut berdasarkan matriks jarak genetik mengindikasikan adanya keragaman spesies diantara masing-masing isolat. Adanya perbedaan internal keenam isolat Streptomyces spp. endofit padi tersebut diduga dipengaruhi oleh perbedaan varietas tanaman padi sebagai tanaman inangnya atau sumber isolasi awal. Isolat IPBCC.b.14.1531 dan IPBCC.b.14.1532 berasal dari sawah rawa, IPBCC.b.14.1533, IPBCC.b.1534, dan IPBCC.b.14.1536 berasal dari sawah biasa, dan IPBCC.b.1535 berasal dari sawah gogo. Di sisi lain, isolat IPBCC.b.13.1530 berkerabat dekat dengan S. misionensis NRRL B-3230 dengan persentase kemiripan sebesar 99%. Isolat IPBCC.b.13.1530 berasal dari sawah irigasi. Berdasarkan pengamatan morfologi dan mikroskopis isolat IPBCC.b.13.1530 memiliki kemiripan dengan S. misionensis yang umumnya juga memproduksi miselia aerial berwarna abu-abu dengan tipe rantai spora spiral atau RA (Kim et al. 1996). Data tersebut mengindikasikan bahwa berdasarkan pengamatan karakteristik morfologi dan analisis pohon filogenetik, tampak jelas bahwa isolat IPBCC.b.13.1530 merupakan spesies S. misionensis. S. misionensis NRRL B-3230 merupakan isolat yang diisolasi dari tanah dan diketahui mampu memproduksi antibiotik
23 misionin untuk mengatasi fungi fitopatogen (Cercos et al. 1962). Kemampuan fitopatogen yang dimiliki oleh S. misionensis tersebut juga didukung oleh data penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa isolat IPBCC.b.13.1530 yang memiliki kemiripan dengan S. misionensis dilaporkan mampu mengatasi penyakit HDB pada tanaman padi (Hastuti et al. 2012).
Identitas Molekuler Gen nifH Aktinomiset Endofit Padi
Penelitian ini merupakan studi baru yang menggunakan data molekuler untuk menunjukkan bahwa aktinomiset endofit yang diisolasi dari lima varietas tanaman padi di Indonesia, beberapa isolat diantaranya memiliki sekuen gen nifH. Selain itu, kajian mengenai sekuen gen nifH pada aktinomiset endofit masih jarang dilakukan. Perkembangan penelitian tentang aktinomiset endofit yang mampu memfiksasi nitrogen yaitu Cournoyer et al. (1993) melaporkan bahwa interaksi antara aktinomiset genus Frankia dan 25 genus tanaman dikotil dalam perkembangannya mampu memfiksasi nitrogen dengan membentuk nodul akar dan mentransfer nitrogen terfiksasi dari mikrosimbion ke tanaman. Selain itu, pada penelitian tersebut juga dilaporkan mengenai pohon filogenetik yang diperoleh dari analisis kombinasi nifH-D, nifD parsial, dan sekuen 16S rRNA yang digunakan untuk menginvestigasi hubungan evolusi dan simbiosis mikroorganisme. Penelitian selanjutnya yaitu dilaporkan bahwa Actinobacteria, khususnya genus Micromonospora dan Thermonospora yang berhasil diisolasi dari akar Casuarina equisetifolia, berhasil diamplifikasi menggunakan primer IGK dan NDR-I serta PolF dan PolR, dan keduanya memiliki sekuen gen nifH yang memiliki kemiripan dengan sekuen gen nifH Frankia sp. (Valdes et al. 2005). Studi terbaru yaitu dilaporkan bahwa Actinobacteria yang mendominasi akar dan rizosfer tanah tanaman rumput Lasiurus sindicus, berdasarkan analisis sekuen nifH menunjukkan hubungan kekerabatan dengan mikrob diazotrof seperti Azospirillum brasilense dan Rhizobium sp. (Chowdhury et al. 2009).
Berdasarkan analisis pohon filogenetik internal gen nifH dalam penelitian ini, menunjukkan bahwa sekuen parsial gen nifH (320 pb) isolat IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531, dan IPBCC.b.14.1536 memiliki kedekatan dengan gen nifH Herbaspirillum sp. B501 (kluster I). Sekuen ketiga isolat tersebut dinyatakan parsial karena berdasarkan Mevarech et al. (1980) dinyatakan bahwa ukuran sekuen lengkap gen nifH yaitu ~ 900 pb. Pada kluster tersebut, posisi IPBCC.b.13.1530 lebih berdekatan dengan IPBCC.b.14.1531, dibandingkan dengan IPBCC.b.14.1536. Kedua isolat IPBCC.b.13.1530 dan IPBCC.b.14.1531 memiliki persentase kemiripan sekuen gen nifH < 97% jika dibandingkan dengan data sekuen gen nifH dari GenBank, sedangkan isolat IPBCC.b.14.1536 memiliki persentase kemiripan > 97%. Data tersebut mengindikasikan bahwa isolat IPBCC.b.13.1530 dan IPBCC.b.14.1531 menunjukkan adanya keragaman sekuen pada gen nifH yang dimilikinya. Adanya perbedaan nukleotida sebesar 3% mengindikasikan daerah variatif yang tinggi. Menurut Stackebrandt dan Goebel (1994) posisi daerah variatif yang tinggi mengindikasikan takson spesifik dan hal tersebut diperlukan untuk menentukan organisme baru melalui analisis sekuen lengkap. Adanya keragaman sekuen gen nifH pada masing-masing strain, diduga dipengaruhi oleh faktor ekologi yaitu adanya perbedaan varietas tanaman padi yang merupakan tanaman inangnya. Hal ini didukung dengan pernyataan Gaby
24
dan Buckley (2014) yang menyatakan bahwa tingginya keragaman sekuen nukleotida pada gen nifH merepresentasikan kaitannya dengan lingkungan asalnya. Isolat IPBCC.b.13.1530 diisolasi dari akar padi Inpari 9 Elo yang berasal dari sawah irigasi, IPBCC.b.14.1531 diisolasi dari daun padi Inpara 2 yang berasal dari sawah rawa, sedangkan IPBCC.b.14.1536 diisolasi dari daun Ciherang yang berasal dari sawah biasa. Menurut Gaby dan Buckley (2014) menyatakan bahwa perbedaan genetik antara gen nifH dan 16S rRNA tidak berkorelasi dengan nilai perbedaan sekuen nukleotida yang pada umumnya digunakan untuk menentukan spesies mikrob. Spesies yang memiliki perbedaan sekuen nukleotida < 3% pada gen 16S rRNA dapat memiliki perbedaan sekuen nukleotida gen nifH hingga 23%. Hal tersebut mengindikasikan bahwa keragaman sekuen gen 16S rRNA tidak dapat dikorelasikan dengan keragaman gen nifH untuk menentukan spesies. Keragaman jarak genetik antara tiga isolat (IPBCC.b.13.1530, IPBCC.b.14.1531,