Amplifikasi PCR dengan menggunakan primer degenerate
Primer degenerate telah didesain untuk mengamplifikasi daerah antara motif p-loop dan GLPL dari area Nucleotide Binding Site dari kelas gen ketahanan NBS. Dari tiga pasang primer degenerate, diperoleh 11 fragmen analog gen ketahanan yang berhasil diisolasi dari DNA pisang M. acuminata var.malaccensis dan Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish dengan produk berukuran antara 300 pb sampai 1000 pb (Gambar 6). Pasangan primer F5(F)+ F6 (R) menghasilkan pita dengan ukuran 350 dan650 pb. Pasangan primer F1(F)+F2(R) menghasilkan pita dengan ukuran 500 dan1000 pb dan F9(F)+F10(R) menghasilkan pita 500 dan1000 bp.
Gambar 6Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan primer degenerate.
Dari ketiga pasang primer, lima fragmen berasal dari M. acuminata var.
malaccensis dan enam fragmen berasal dari Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish. Pada primer F1(F)+ F2(R), M. acuminata var. malaccensis hanya teramplifikasi satu fragmen sedangkan pada Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish ada dua fragmen. Semua fragmen tersebut diisolasi dari gel dan dilakukan kloning ke dalam bakteri Eschericia coli.
Primer F1(F)+F2(R) Primer F5(F)+F6(R) Primer F9(F)+F10(R)) 1000 bp 500 bp 1000 bp 500 bp 350 bp 650 bp M C M C M C
Keterangan: A: Marker 100 bp (Fermentas), M:Musa acuminata var. malaccensis, C:Musa acuminatacv. Cavendish .
11
Analisis sekuen fragmen produk PCR dari DNA genom pisang
Dari 11 fragmen produk PCR yang telah disekuensing, semua mengandung insersi fragmen berukuran antara 323-1114 pb. Berdasarkan hasil analisis nukleotida dan deduksi asam amino dengan menggunakan BLASTp pada
Genbank, ditemukan 3 sekuen yang mengandung daerah NBS yaitu P5-8, P5-10 dan P5-11 dengan ukuran berturut-turut 770, 1114 dan 791 bp. Sekuen P5-8 dan P5-10 berasal dari M. acuminata var. malaccensis. Sedangkan, Sekuen P5-11 berasal dari Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish. Sekuen P5-8 mempunyai kesamaan identitas 97% dengan disease resistance proteinRPS2 pada M. acuminatavar.malaccensis. Sedangkan sekuen P5-10 dan P5-11 mempunyai kesamaan identitas 99% dan 100% dengan disease resistance protein RPM1 pada
M. acuminata var. malaccensis (Tabel 3). Ketiga sekuen fragmen ini telah dideposit ke Genbank dengan nomor akses KP691062-KP691064.
Tabel 3 Sequence identity antara sekuen prediksi asam amino tanaman pisang
Musa acuminata var. malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish dengan protein ketahanan penyakit Musa yang telah dideposit pada GenBank.
Hasil penelitian Sun et al. (2010), dari 20 Resistance Gene Analog (RGA) yang berhasil diisolasi dari pisang Goldfinger (AAAB), prediksi asam aminonya berbagi homologi 28-54% dengan gen yang telah diketahui yaitu Fom2, I2C1,
I2C2 dan I2. Agustine dan Joseph (2014) mengisolasi fragmen 517 bp dari pisang AAB cv. Nendran menunjukkan homologi 97-99% dengan protein NBS-LRR varietas Musa. Sedangkan Sutanto et al. (2014), mendapatkan 17 fragmen yang berhasil diisolasi dan menunjukkan homologi 91,7-98,8% dengan protein ketahanan penyakit NBS-LRR pada M. acuminata var. malaccensis, grup AAA, AAB dan ABB.
Ketiga sekuen dilakukan BLAST pada Musa Genome ( http://banana-genome.cirad.fr), hasilnya menunjukkan ketiga sekuen memiliki coverage > 90% dan terdapat pada kromosom nomor 9 (Tabel 4 dan Gambar 7). Fragmen P5-8 memiliki kesamaan dengan disease resistance protein putatif RPS2, sedangkan P5-10 dan P5-11 memiliki kesamaan dengan disease resistance protein putatif
Fragmen No aksesi Aksesi Genbank Query coverage
E value
Identity Aksesi P5-8 KP691062 Disease resistant protein
RPS2 like (M. acuminata subsp.malaccensis) 66% 3e-108 97% XM009 418398 P5-10 KP691063 Predicted: disease resistance protein RPM1
like (M. acuminata subsp
malaccensis) 98% 0.0 99% XM009 419073 P5-11 KP691064 Predicted: disease resistance protein RPM1 like (M. acuminata subsp.malaccensis) 99% 0.0 100% XM009 419073
12
RPM1 dengan persentase coverage berturut-turut 92,76%, 96,68% dan 97,11%. Jarak antara lokus RPS1 dan RPM2 yaitu 0.156 Kbp
Tabel 4 BLAST di Musa genome
Fragmen %coverage Locus ID Chro mosom Jarak lokus (Kbp) Fungsi P5-8 (KP691062) 92.76 GSMUA_Ach r9P02520_001 9 2.616 Putative disease resistance protein RPS2 complete P5-10 (KP691063) 96.68 GSMUA_Ach r9P12800_001 9 2.772 Putative disease resistance protein RPM1 complete P5-11 (KP691064) 97.11 GSMUA_Ach r9P12800_001 9 2.772 Putative disease resistance protein RPM1 complete
Pada penelitian Li et al. (2012), peningkatan ekspresi gen pada Cavendish cv. Nongke no.1 terjadi pada komplek protein RPM1/RIN4. Pada Arabidopsis thaliana, RPM1 terkait dengan ketahanan terhadap Pseudomonas syringae yang mengekspresikan avrRPM1 atau avrB (Boyes et al. 1998). AvrB dan AvrRPM1
menyebabkan hiperfosforilasi RPM1 yang saling berinteraksi dengan protein4 (RIN4) (Torres et al. 2006). Penghambatan ekspresi RIN4 oleh efektor yang belum diketahui dari F. oxysporum f.sp. cubense TR4 akan mengaktifkan jalur RPS2.
Gambar 7 Kromosom pisang
RPS2 RPM1 A. Lokus RPS2 B. Lokus RPM1 A B (http://banana-genome.cirad.fr)
13
Analisis pensejajaran sekuen dan filogenetik prediksi asam amino dengan protein RGA dan gen-R tanaman lain.
Hasil analisis konsensus prediksi asam amino dari ketiga fragmen dengan protein NBS-LRRtanaman pisang serta gen-R tanaman lain yang telah dideposit di Genbank menunjukkan terdapat empat struktur konservatif NB-ARC yang merupakan ciri khas daerah NBS. Keempat struktur konservatif asam amino yaitu motif P-loop/kinase-1a (GGVGKTT), kinase-2 (LVLDDIW), RNBS-B/kinase-3a (CKVLFTTRS) dan asam amino hidrofobik (hydrophobic domain) (GLPL) (Gambar 8).
10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana --GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N---RLGLPWN 55
NBS-LRR_Musa_AAB_Group ---GLGKTTLAQQAYNHER--VKDYFQHEVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESITE-N---KCDLS--54
NBS-LRR_Musa_laterita -MGGVGKTTLAQQAYNHER--VQDYFQHEVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESITE-N---KCDLS--56
NBS-LRR_Musa_ABB_Group -MGGVGKTTLAQQAYNPER--VKDYFHHKVWVCV.SDNFNVERLSKE--IIESITE-N---KCDLS--56
NBS-LRR_Musa_textilis GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VQDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKD--IIESITE-N---KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_schizocarpa GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHXKVWVCV.SDNFNVERFTKE--IIESLTR-K---RCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._miGMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKD--IVESITE-E---KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_GroGMGGVGKTTLAQQAYNHAR--VQDCFQLKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N---TCDLN--57
NBS-LRR_Musa_banksii GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N---KCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siGMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHHKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N---KCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._erGMGGVGKTTLAQQAYNHES--VKDYFQHEVWVCV.SYNFNVERLTKE--IIESITE-N---KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_velutina GMGGVGKTTLAQQAYNNER--VKDYFYHKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IRESLTR-N---TCDLN--57
NBS-LRR_Musa_ornata GMGGVGKTTLAQFVYNDAT--VRKHFELKIWVCV.SDSFDVKRLTKE--IIESVTNEK---QSDLM--58
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.C--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVILI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N---RLGLPWN 55
NBS-LRR Klutuk_Wulung(NBS1) --GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N---RLGLPWN 55
NBS-LRR Musa_acuminata_cult Re--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N---RLGLPWN 55
P5-11 --GGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNIDDLLRK--ILRALLQ-E---RMEEAAD 57
P5-10 --GGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNVDDLLRK--ILRALLQ-E---RMEEAAD 57
P5-8 --GGVGKTTLLSRFHNEFL-ADATHLDVVIFMDACRGLGVDRIQRM---IG-D---RLGLSRK 53
RPM1_Musa_acuminata_var._malacGMGGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNIDDLLRK--ILRALLQ-E---RMEEAAD 59
RPS2_Musa_acuminata_var._malacGMGGVGKTALLSRFHNEFL-ADATHLDVVIFIDACRGLGVDRIQRM---IG-D---RLGLSRK 55
BS2_Capsicum_chacoense GMGGIGKTTLAKEVYNDES--ILCRFDVHAWATISQQHNKKEILLG--LLHSTIKMDD---RVKMIGE 61
FOM-2_Cucumis_melo GMGGLGKTTLAKLVFSHEL--VRQHFDKTVWVCV.SEPFIVNKILLD--ILQSL---KGGISNG56
I2_Solanum_lycopersicum GMGGQGKTTLAKAVYNDER--VKNHFDLKAWYCV.SEGFDALRITKE--LLQEIGKFD---SKDVHN-59
Saccharum_hybrid_N11 --GGVGKTTLTQLIYNDER--VKEHFQLRVWLCV.SENFDEMKLTKE--TIESVAS---GFSSATT56
Gpa2_Solanum_tuberosum GMGGIGKTTLAAKLYSDPY--IMSRFDIRAKATVSQEYCV.RNVLLG--LLSL---TSDEPDY55
Theobroma_cacao GRGGVGKTTLAQLVYTDSN--IRDHFDLKAWVCV.SHEFDVIKITKT--ILESVTF-L---PCDIT--57
Triticum_aestivum - -GGVGKTTLTQLVYNDTR--IKEHSQLRVWLCV.SENFDQMKLTKE--PIESVAS-EFGSTIIGVSSVTT63
RXO1_Zea_mays GMGGVGKSTLVNNVYKNE----GSNFDCRAWVSISQSYRLEDIWKK--MLTDLIGKD---KIEF--- 55
N_Nicotiana_glutinosa GMGGVGKTTIARAIFDTLLGRMDSSYQFDGACFLKDIKENKRGMHS--LQNALLS-E---LLREKA- 60
RPS4_Arabidopsis_thaliana GMPGIGKTTLLKELYKTWQGKFSRHALIDQIRVKSKHLELDRLPQM--LLGEL---S---KLNHP-- 57
RPP4_Arabidopsis_thaliana GQSGIGKSTIGRALFSQLS----SQFHHRAFITYKSTSGSDVSGMKLSWEKELLS-E---ILGQK-- 57
P2_Linum_usitatissimum GMGGVGKTTLAEACYERVT-SSNKGIKHLFVRNVNEICEKHHGVEK--IVHKLYS-K---LLDEN-- 58
RPP5_Arabidopsis_thaliana GQSGIGKSTIGRALFSQLS----SQFHHRAFLTYKSTSGSDVSGMKLSWQKELLS-E---ILGQK-- 57
80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana -ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF---QLADV--GIPTPSSD---NGCKLIVASRSN 112
NBS-LRR_Musa_AAB_Group -NLDTLQVV---LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWGRF--CAPLRYGE---PGSKILITTRSK 110
NBS-LRR_Musa_laterita -NLDTLQVV---LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 112
NBS-LRR_Musa_ABB_Group -NLDTLQVV---VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 112
NBS-LRR_Musa_textilis -NLDTLQVV---VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---QGSKILVTTRSR 113
NBS-LRR_Musa_schizocarpa -NFDTLQVE---VKEKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._micNLDTLQVV---VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDGL---KWERF--CASLRYGE---QGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_Gro-NFDTLQVV---VKEKLTSKRFLPVLDDVWSEDSL---KWERF--CAPLKHGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_banksii - FDTLQVI---VKDMLTSKRFLLVLDDVWDEDGL---KWERF--CASLRYGE---QGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siaNFDTLQVV---VKEELTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGV---PGSKILVTTRSE 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._errNLDTLQVV---LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_velutina -NFDTLQVE---VKEALTSKRFLLVLDDVWSEDSL---KWERF--CAPLKYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_ornata -NLDTLQVI---LKVKIASKRFLLVLDDVWSVDTHDMDEWQKL--CAPLRFGA---RGSMVMVTTRDL 117
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.C-ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF---QLADV--GIPTPSSD---YGCKLILASRSN 112
NBS-LRR Klutuk_Wulung(NBS1) -ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF---QLADV--GIPTPSSD---NGCKLIVASRSN 112
NBS-LRR Musa_acuminata_cult Re-ESETERER--STFLRRALKRKKFVVLLDDVWKKF---QLADV--GIPTPSSD---NGCKLILASRSN 112
P5-11 -DFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS---IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 116
P5-10 -DFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS---IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 116
P5-8 -NRGSQEEK--AATLFRVLNKMRFVLILDGVCRSL---DLRMV--GVPIPKRR---SKCKIVLATRNE 110
RPM1_Musa_acuminata_var._malaccDFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS---IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 118
RPS2_Musa_acuminata_var._malaccNRGSQEEK--AATLFRVLNKMRFVLILDGVCRSL---DLRTV--GVPIPKRR---SKCKIVLATRNE 112
BS2_Capsicum_chacoense AELADM---LQKSLKRKRYLIVLDDIWSCE---VWDGVRRCFPTE-DN---AGSRILLTTRND 114
FOM-2_Cucumis_melo GDSKEVLLR----ELQKEMLGQTYFLVLDDVWNENSF---LWGELKYCLLKITGN---SKNSIVVTTRSA 116
I2_Solanum_lycopersicum -NLNQLQVK---LKESLKGKKFLIVLDDVWNENYN---EWNDL--RNIFAQGD---IGSKIIVTTRKD 115
Saccharum_hybrid_N11 -NMNLLQED---LSKKLQGKRFLLVLDDVWNEDPE---KWDRY--RCALVSGG---KGSKIIITTRNK 112
Gpa2_Solanum_tuberosum Q-LADQ---LQKHLKGRRYLVVIDDIWTTE---AWDDI--KLCFPDCD---NGSRILLTTRNV 106
Theobroma_cacao -DLNLLQFK---LKEKLSRKKFLFVLDDVWTENYN---DWMRL--RSPFDAGI---SGSKIIITTRSS 113
Triticum_aestivum -NMNLLQED---LSKKLKDKRFLLVLDDVWNEDPE---KWGTY--RSALLTGG---KGSRIVVTTRNK 119
RXO1_Zea_mays -DLGTMDSAELREQLTKTLDKRQYLIILDDVWMAN---VFFKI--KEVLVDNG---LGSRVIITTRIE 114
N_Nicotiana_glutinosa -NYNNEEDG--KHQMASRLRSKKVLIVLDDIDNKDH----YLEYL--AGDLDWFG---NGSRIIITTRDK 118
RPS4_Arabidopsis_thaliana -HVDNLKDP---YSQLHERKVLVVLDDVSKREQI--DALREI--LDWIKEGK---EGSRVVIATSDM 113
RPP4_Arabidopsis_thaliana -DIKIDHFG----VVEQRLKHKKVLILLDDVDNLE---FLKTL--VGKAEWFG---SGSRIIVITQDK 112
P2_Linum_usitatissimum -NIDREDLN--IGYRRERLSRSRVFVVLDNVETLE---QLEQLALGYVFNLSKVFAAGSRIIITTRNK 120
RPP5_Arabidopsis_thaliana -DIKIEHFG----VVEQRLNHKKVLILLDDVDNLE---FLKTL--VGKAEWFG---SGSRIIVITQDR 112
A
14
150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana QVCV.EMGDKEPMEMPCLNENESLRLFRSNLMAEVSAAIDHDSDMRESAMDIIQSCGGLPLSP-- 174
NBS-LRR_Musa_AAB_Group MIAEMVG---NPIPLGGLDETSYWKLFKKCAF--GSEDEGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 169
NBS-LRR_Musa_laterita NVFENGW---NPIPLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPHLE--- 153
NBS-LRR_Musa_ABB_Group KIAEMVG---NPFPLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEYAGE--- 148
NBS-LRR_Musa_textilis KIADMVG---NPIPLDGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDVGEFPQLEAIAGMIVGRLKGLPLAAR- 172
NBS-LRR_Musa_schizocarpa KIAEMVG---NPIPLGGMAGASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPHLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._miKIAEMVG---KPIPLGGLDEASYWEFFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_GroKIADMFG---NPFPLDGLDDASYWEFFKQCAF--GSEYAGECPQLEAIAKKIAYRLNGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_banksii KIAEMVG---KPIPLGGLDEASYWEFFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siKIAEMVG---NRIHLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKVVGRLKAFPSLQR- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._erKIAEMVG---NPIPLGGLDEASYWKLFKECAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_velutina KIADMVG---NPFPLDGLDDASYWEFFKQCAF--GSEYAGECPQLEAIAKKIAYRLNGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_ornata RIASIVG-TMKEILLEGLEDDDYWELFKKCAF--GSLNPKEHPELEAIGRKIAGKLKAYPSLQR- 178
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.CQVCV.EMGDKEPMEMPCLGDNESLRLFRSNLMAEVSAAIDHDSDMRRSAMDIIQSCGGLPLSP-- 174
NBS-LRR Klutuk_Wulung(NBS1) QVCV.EMGDKEPMEMPCLNENESLRLFRSNLMAEVSAAIDHDSDMRESAMDIIQSCGGLPLSP-- 174
NBS-LRR Musa_acuminata_cult ReQVCV.EMGDKEPMEMPCLGDYESLRLFRSNLMAEVSAAIDHDSDLRGSAMDIIQSCGGLPLSL-- 174
P5-11 EVASVAG-GSRVMTVDPLPEEMAWSLFCKKAFPRGEGSV-CPPALEHWARRIVDKCEGLPLAIV- 178
P5-10 EVASVAG-GSRVMTVDPLPEEMAWSLFCKKAFPRGEGSV-CPPALEHWARRIVDKCEGLPLAIV- 178
P5-8 DLCDQMG-AKKKVKVEALPWDAAWKLFTETA---GEEMIDSHPGIRRQAEILVRKCGGLPLALN- 170
RPM1_Musa_acuminata_var._malacEVASVAG-GSRVMTVDPLPEEMAWSLFCKKAFPRGEGSV-CPPALEHWARRIVDKCEGLPLAIV- 180
RPS2_Musa_acuminata_var._malacDLCDQMG-AKKKIKVEALPWDAAWKLFTETA---GEEMIDSHPGIRRQAEILVRKCGGLPLVLI- 172
BS2_Capsicum_chacoense EVACYAGVENFSLRMSFMDQDESWSLFKSAAF--SSEAL--PYEFETVGKQIADECHGLPLTIV- 174
FOM-2_Cucumis_melo EVAKIMG-TCPGHLLSKLSDDHCWSLFKESANVYGLSMT---SNLGIIQKELVKKIGGVPLVAQ- 176
I2_Solanum_lycopersicum SVALMMG--NEQIRMGNLSTEASWSLFQRHAF--ENMDPMGHPELEEVGRQIAAKCKGLPLALK- 175
Saccharum_hybrid_N11 NVGILMG-GMTPYHLKQLSNNDCWLLFKKHAF--VDGDSSSHPELEMIGKDIVKKLKGLPLAAK- 173
Gpa2_Solanum_tuberosum EVAEYASSGKPPHHMRLMNFDESWNLLHKKIF--EKEGS-YSPEFENIGKQIALKCGGLPLAIT- 167
Theobroma_cacao NVSSIMR-SVADYLLQSLSEDDSLSLLSHHAL--ARGDFTGHPDLKEIGLEIVKKCGGLPLALS- 174
Triticum_aestivum NVGKLMG-GMTPYYLNQLSDDDCWSLFRSYAF--VDGNSNAHPNLEMIGMEIVKKLKGFPLAF-- 179
RXO1_Zea_mays EVASLAK-GSCKIKVEPLGVDDSWHVFCRKAFLKDENHI-CPPELRQCGINIVEKCDGLPLALV- 176
N_Nicotiana_glutinosa HLIEKND---IIYEVTALPDHESIQLFKQHAF--GKEVP--NENFEKLSLEVVNYAKGLPLALK- 175
RPS4_Arabidopsis_thaliana SLTN--GLVDDTYMVQNLNHRDSLQLFHYHAFI-DDQANPQKKDFMKLSEGFVHYARGHPLALK- 174
RPP4_Arabidopsis_thaliana QLLKAHE-IDLVYEVELPSQGLALKMISQYAF--GKDSP--PDDFKELAFEVAELVGSLPLGLS- 171
P2_Linum_usitatissimum KVLQNAM--AKIYNVECLNNKESIRLFSLHAF----KQDRPQDNWTDKSHLAISYCKGNPLALK- 178
RPP5_Arabidopsis_thaliana QLLKAHE-IDLVYEVKLPSQGLALKMISQYAF--GKDSP--PDDFKELAFEVAELVGSLPLGLSE 172
Gambar 8. Analisis pensejajaran sekuen prediksi asam amino dengan beberapa protein Musa pada daerah NBS dan protein R yang terdeposit pada gen bank NCBI.
Panjang asam amino yang mencakup daerah p-loop sampai GLPL yaitu 200 asam amino. Semua RGA pisang dan protein R tanaman lain memiliki keempat daerah konservatif tersebut. Hasil ini menunjukkan konservasi evolusi gen ketahanan penyakit.
Berdasarkan penelitian Sutanto et al. (2014), perbedaan sekuen asam amino dengan fragmen P5-8, P5-10 dan P5-11 dijumpai pada daerah kinase-2 (B) terutama pada asam amino Lysine (K), Leucine (L) dan Isoleucine (I). Pada daerah Kinase 3a (C), terdapat perbedaan motif asam amino yaitu Cystein- Lysine- Leucine- Isoleucine- Leucine- Alanine- Serine- Arginine- Serine- Asparagine (CKLILASRSN) dan Serine-arginine-Valine- Valine- Threonine- Threonine- Arginine- Methionine- Gluthamine (SRVVTTRMQ). Sedangkan, pada daerah hidrofobik (D) perbedaan terletak pada asama amino Serine (S) dan Alanine (A) (Gambar 8). Perbedaan sekuen asam amino pada daerah konservatif ini memungkinkan terjadinya perbedaan respon ketahanan terhadap penyakit yang berbeda.
Fungsi dari p-loop/kinase-1a dan kinase-2 adalah untuk mengikat fosfat pada ATP, sedangkan kinase 3 berinteraksi dengan purin (Traut, 1994). Motif GLPL terlibat dalam pengikatan ADP. Motif p-loop juga diperlukan pada pengikatan nukleotida dan mutasi pada motif ini akan menyebabkan hilangnya fungsi pada beberapa protein NBS-LRR. Pada motif kinase-2, dua asam aspartat Keterangan: daerah domain terkonservasi ditandai dengan garis tebal diatas sekuen (A= P-loop atau kinase-1a, B=kinase-2, C=kinase-3a dan D= hidrophobic domain atau GLPL). Garis putus-putus menunjukkan kesamaan asam amino fragmen dengan protein RPM1 dan RPS2 serta hasil penelitian Sutanto et al (2014).
15 terakhir berinteraksi dengan fosfat ketiga dari ATP, dan berperan dalam koordinasi ion logam divalen yang diperlukan dalam reaksi transfer fosfat, contoh Mg2+ dari MgATP (McHale et al. 2006).
Hasil analisis filogenetik sekuen prediksi asam amino menunjukkan bahwa protein R dan protein NBS-LRR pisang terbagi kedalam dua kelompok yaitu TIR-NBS dan non-TIR-TIR-NBS. Diantara protein tersebut, protein RPP4, RPP5, RPS4, N
dan P2 termasuk kedalam kelompok TIR-NBS sedangkan yang lainnya masuk ke dalam kelompok non-TIR-NBS. Fragmen P5-8 tergabung satu kelompok dengan protein RPS2 dari M. acuminata var. malaccensis dan protein NBS-LRR dari M. balbisiana. Fragmen P5-10 dan P5-11 tergabung satu kelompok dengan protein
RPM1 dari M. acuminata var. malaccensis dan protein RX01 dari jagung. Fragmen yang diperoleh dari penelitian ini bersama protein pada pisang lain dan tanaman Monokotil seperti tebu, gandum dan jagung termasuk ke dalam kelas TIR-NBS, sedangkan tanaman Dikotil ada yang termasuk kedalam kelas non-TIR-NBS maupun kelas non-TIR-NBS (Gambar 9).
Gambar 9Pohon filogenetik sekuen prediksi asam amino dari RGA pisang dan beberapa protein Musa dan protein tanaman lain berdasarkan analisis pensejajaran menggunakan MUSCLE dan dibuat berdasarkan metode NJ.
Non-TIR-NBS
TIR-NBS
Keterangan:Angka pada sumbu percabangan adalah nilai bootstrap (1000 ulangan). Skala yang ada di bawah pohon mewakili panjang cabang yang setara dengan rataan substitusi asam amino persitus.
16 Tidak adanya daerah TIR pada protein R dapat diprediksi dengan adanya motif RNBS-A dekat dengan p-loop dan juga adanya residu tryptophan (W) di akhir motif kinase-2 (Meyers et al. 1999). Pada analisis filogenetik, secara evolusi hipotesis hilangnya daerah TIR dari NBS-LRR Monokotil kemungkinan terjadi selama penyebaran Monokotil dan Dikotil (Pan et al. 2000). Dari fungsi yang telah diketahui, pengelompokan non-TIR-NBS pada pisang kemungkinan mengkode produk gen ketahanan dengan spesifitas yang belum diketahui (Peraza-Echeverria et al. 2008). Meskipun protein pisang yang lain tidak berkorelasi dengan ketahanan penyakit pisang pada umumnya, peran potensialnya pada ketahanan penyakit dapat diuji dengan menggunakan teknologi era post-genomic
seperti RNA interference (RNAi). Teknologi ini dapat digunakan untuk men-silencing target terkait ketahanan terhadap penyakit (Waterhouse & Helliwell 2003).
Uji tantang terhadap Fusarium oxysporum f.sp. cubense TR4 pada M. acuminatavar.malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish.
Pada M. acuminata var. malaccensis, respon gejala penyakit berupa klorosis atau penguningan pada daun terjadi pada minggu ke-2 setelah inokulasi pada konsentrasi Foc TR4 106 konidia/ml. Daun yang paling tua mulai menguning dan beberapa hari kemudian seluruh daun merata mengalami klorosis. Sedangkan pada Musa, AAA, sub-kelompok Cavendishrespon gejala penyakit dimulai pada minggu pertama setelah inokulasi. Perbandingan hasil antara kontrol dan perlakuan inokulasi 106 konidia/ml pada M. acuminata var. malaccensis dan
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish setelah 4 minggu disajikan pada Gambar 10.
Pengamatan terhadap daun dan bonggol pisang tersebut menggunakan skoring berdasarkan Mak et al. (2004). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pisang M. acuminata var. malaccensis berada pada status toleran, sedangkan
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish berada pada status sangat rentan (Tabel 5). Hal ini menunjukkan bahwa M. acuminata var. malaccensis lebih tahan daripada
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish. Adapun kontrol M. acuminata var.
malaccensis yang menunjukkan status toleran dikarenakan adaptasi fisiologis dan adanya hama serangga pengebor bonggol, namun pengamatan pada daun menunjukkan status sangat tahan.
Berkaitan dengan identifikasi kandidat gen Nucleotide Binding site (NBS), uji tantang ini menunjukkan bahwa ada gen yang berperan dalam mengendalikan ketahananan terhadap penyakit layu fusarium. Tiga fragmen yang telah diidentifikasi mempunyai kesamaan dengan gen RPS2 dan RPM1, dimana M. acuminata var. malaccensis mempunyai kedua gen RPS2 dan RPM1 sedangkan
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish hanya mempunyai gen RPM1 saja. Sehingga dapat dikatakan bahwa gen RPS2 mempunyai peranan dalam ketahananan terhadap F. oxysporum f.sp. cubense TR4.
17
Gambar 10 Hasil uji tantang ketahanan terhadap F. oxysporumf.sp.cubenseTR4 pada Musa acuminata var. malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish setelah 4 minggu pengamatan.
Tanaman mempunyai sistem yang efisien untuk menahan penyebaran serangan patogen. Respon hipersensitif merupakan bentuk kematian sel yang berkaitan dengan ketahanan tanaman terhadap infeksi patogen dan terjadi pada saat interaksi dengan patogen kompatibel maupun inkompatibel. Ciri khas dari respon hipersensitif yaitu adanya kematian jaringan yang cepat dan terlokalisasi pada titik infeksi untuk membatasi penyebaran patogen.
Selama respon hipersensitif terjadi, oksigen bereaksi sangat cepat untuk memicu reaksi oksidatif dan menambah pergerakan ion K+ dan H+ melalui membran sel. Hal ini menyebabkan kerusakan membran dan hilangnya sekat selular. Tanaman memperkuat dinding selnya dengan menghasilkan senyawa fenolik, senyawa kinase, asam salisilat, sintesis senyawa toksik yang disebut fitoaleksin dan mengakumulasi protein yang mengandung senyawa antimikrobia seperti chitinase. Secara genetik, respon hipersensitif terjadi jika tanaman mengenali patogen spesifik. Reaksi ini melibatkan gen ketahanan pada tanaman (Agrios 2005; Iakimova et al. 2005).
M. acuminate var.
malaccensis
kontrol daun
Musa, AAA, sub-kelompokCavendish kontrolbonggol perlakuan 106konidia/ml perlakuan 106konidia/ml
18 Tabel 5. Status ketahanan/kerentanan Musa acuminata var. malaccensis dan
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish 4 minggu setelah inokulasi konsentrasi 106 konidia/ml.
Ulangan
M.acuminata var. malaccensis Musa, AAA, sub-kelompok
Cavendish
Kontrol Perlakuan Foc 106 Kontrol Perlakuan Foc 106
LSI RSI LSI RSI LSI RSI LSI RSI
1 1 1 1 2 1 1 3 3 2 1 1 3 3 1 1 3 3 3 1 2 2 2 2 1 4 7 4 1 4 2 2 2 1 5 8 5 1 4 1 1 4 1 5 8 DSI 1 2.4 1.8 2 2 1 4 5.8
Status Toleran Toleran Sangat Tahan Sangat
Rentan
Pada pisang yang terinfeksi F. oxysporum f.sp. cubense TR4, terjadi kenaikan kadar O2 dan H2O2 pada ujung akar, aktivasi Superokside Dismutase
(SOD) dan katalase (CAT), akumulasi Malonedialdehida (MDA) yang rendah dapat dikenali pada pisang yang tahan terhadap F. oxysporum f.sp. cubense TR4. Indikator ini dapat digunakan untuk seleksi plasma nutfah baru yang tahan