Transformasi genetik Kappaphycus alvarezii dengan gen Sitrat sintase
Introduksi gen PaCS ke dalam genom K.alvarezii dilakukan melalui perantara A. tumefaciens. Transformasi menggunakan A. tumefaciens memiliki beberapa kelebihan yaitu diantaranya mudah dilakukan (Hiei & Komari 2008). Kualitas eksplan yang digunakan dalam transformasi merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan transformasi. Eksplan yang digunakan pada penelitian ini adalah potongan talus yang berwarna coklat tua dan tidak ada bagian eksplan yang mengalami perubahan warna setelah ditumbuhkan di media adaptasi. Talus yang mengalami perubahan warna menjadi hijau tidak dapat digunakan dalam proses transformasi karena talus tersebut tidak mampu beradaptasi dengan baik dan rentan terhadap kematian. Menurut Hiei & Komari (2008), eksplan yang mendukung kesuksesan transformasi adalah eksplan yang segar dan sehat.
Transformasi dilakukan berdasarkan kemampuan A. tumefaciens mentransfer T-DNA ke dalam kromosom tanaman. Transformasi genetik menggunakan A. tumefaciens telah dilakukan pada marine makroalaga yaitu Porphyra yezoensis (Cheney et al. 2001). Pada penelitian ini kokultivasi dilakukan dengan perendaman talus pada suspensi A. tumefaciens yang mengandung senyawa asetosiringon 100 µM selama 10 – 15 menit yang selanjutnya dikeringkan kemudian ditanam pada media kokultivasi padat yang juga telah mengandung senyawa asetosiringon 100 µM selama 2-3 hari pada ruang gelap dengan suhu 25oC (Gambar 4). Penambahan asetosiringon pada media kokultivasi padat maupun cair berfungsi untuk menginduksi A. tumefacien agar dapat menginfeksi talus dan mentransfer T-DNA A. tumefaciens ke kromosom K. alvarezii. Senyawa ini meningkatkan ekspresi gen Vir sehingga dapat meningkatkan frekuensi transformasi (de la Riva et al 1998)
Gambar 4 Tahapan transformasi genetik rumput laut K. alvarezii. A= eksplan pada media kokultivasi padat ; B = eksplan pada media recovery; C= eksplan pada media seleksi; D= eksplan pada media aklimatisasi (PES cair).
A B
C D
B A
11
Setelah dibiakkan di media kokultivasi, bakteri yang masih menempel pada talus dibersihkan dengan perendaman di media yang mengandung cefotaxim. Cefotaxim ini berfungsi untuk membunuh A. tumefaciens tetapi tidak untuk rumput laut. Untuk melakukan regenerasi, talus dipindahkan ke media recovery (Gambar 4). Konsentrasi cefotaxim yang digunakan pada penelitian ini lebih rendah dari pada penggunaan konsentrasi cefotaxim pada penelitian tanaman tingkat tinggi. Konsentrasi cefotaxim yang efektif digunakan untuk mengurangi jumlah bakteri pada tanaman tingkat tinggi berkisar 250-1500 µg/ml (Da silva & Fukai 2001). Pada konsentrasi yang tinggi, cefotaxim dapat merusak jaringan tanaman. Hasil penelitian Okkels & Paderson (1988) menunjukkan bahwa cefotaxim dalam konsentrasi yang tinggi dapat bersifat phytotoxic pada perkembangan tanaman bit (Beta vulgaris). Pada dosis tertentu penggunaan cefotaxim pada proses transformasi tidak menghambat regenerasi tanaman (Koronfel 1998).
Talus yang mampu bertahan hidup pada media seleksi higromisin disebut talus transgenik putatif. Pada penelitian ini, dari 200 eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens terdapat 15 talus yang tahan terhadap higromisin sehingga efisiensi transformasi rumput laut berkisar 7,5% (Tabel 1). Efisiensi transformasi ini lebih rendah jika dibandingkan dengan hasil penelitian Handayani (2013) yang memperoleh persentase transformasi pada K. alvarezii sebesar 23,56%. Rendahnya persentase transformasi pada penelitian ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan strain K. alvarezii yang digunakan. Handayani (2013) menggunakan K. alvarezii hijau sedangkan pada penelitian ini K. alvarezii yang digunakan adalah yang berwarna merah. Efisiensi regenerasi talus transgenik putatif pada penelitian ini sebesar 100% dari jumlah eksplan yang resisten di media higromisin, dan efisiensi regenerasi talus non transgen ini juga sebesar 100% di media non selektif yang tidak mengandung higromisin (Tabel 1). Efisiensi regenerasi pada penelitian ini lebih besar jika dibandingkan dengan efisiensi regenerasi pada penelitian Handayani (2013) sebesar 11,32%. Hal ini kemungkinan disebabkan penggunaan konsentrasi higromisin yang berbeda pada media seleksi dimana pada penelitian ini hanya menggunakan higromisin dengan konsentrasi 10 mg/l sedangkan pada penelitian Handayani (2013) menggunakan konsentrasi higromisin 20 mg/l. Waktu yang diperlukan untuk regenerasi pada talus transgenik lebih lama dibandingkan dengan talus non transgenik. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa faktor seperti perlakuan infeksi A. tumefaciens dan pengaruh antibiotik higromisin. Dari 15 talus transgenik putatif yang telah menghasilkan tunas, 3 talus diambil secara acak untuk dianalisis lebih lanjut. Analisis integrasi gen PaCS terhadap 1 tunas yang diambil secara acak menunjukkan bahwa tunas tersebut mengandung gen PaCS (Tabel 1). Perkembangan eksplan pada media selektif dapat dilihat pada Gambar 5.
12
Gambar 5 Perkembangan eksplan nontransgenik dan putatif transgenik di media higromisin 10 mg/L (+Hyg) dan tanpa hygromisin (-Hyg)
Pertumbuhan talus rumput laut K. alvarezii pada media PES non selektif yang tidak mengandung higromisin memperlihatkan pertumbuhan kristal filamen di sekitar talus (2 minggu), sedangkan talus non transgenik yang ditanam pada media selektif menunjukkan hampir keseluruhan talus mengalami kematian. Talus hasil transformasi yang ditanam pada media selektif menunjukkan pertumbuhan dimana tunas tumbuh semakin panjang (Gambar 5). Sensitifitas sel tanaman terhadap agen seleksi bergantung pada genotipe, tipe eksplan dan kondisi kultur jaringan (Koronfel 1998).
Tabel 1. Hasil transformasi dan regenerasi Rumput Laut Kappaphycus alvarezii
a) Jumlah eksplan tahan higromisin/jumlah eksplan x 100%
b) Jumlah eksplan yang bertunas/jumlah eksplan tahan higromisin x 100%
c) Jumlah eksplan yang bertunas/jumlah eksplan awal yang ditanam pada media tanpa higromisin x 100%
*) Dengan A. tumefaciens
**) Di media yang tidak mengandung higromisin ***) Jumlah tunas dari 1 eksplan yang + PCR
Analisis Integrasi gen PaCS di dalam K. alvarezii
Dari 3 eksplan yang menghasilkan tunas transgenik putatif, secara acak 5 tunas diambil untuk diisolasi DNA nya. Hasil isolasi DNA genom dari kelima tunas K. alvarezii transgenik putatif menunjukkan bahwa DNA tersebut memiliki kualitas yang baik (Gambar 6). DNA genom dari salah satu tunas transgenik putatif selanjutnya digunakan untuk analisis integrasi gen PaCS pada K. alvarezii.
Nontransgenik Transgenik
- Hyg + Hyg 10 mg/L + Hyg 10 mg/L Minggu ke-1 Minggu ke-2 Perlakuan* Jumlah Eksplan Awal Jumlah Eksplan Tahan Higromisin Efisiensi Transformasi
Jumlah Eksplan Efisiensi Regenerasi + PCR Regenerasi
Diinokulasi 200 15 7,5 %a) 15 1/1*** 100%b)
Tidak diinokulasi 50 0 0 0 0 0
13
Gambar 6 Hasil elektroforesis DNA Genom Rumput laut K. alvarezii hasil isolasi; T0-1 – T0-5 = Tunas transgenik putatif
Analisis integrasi gen PaCS di dalam rumput laut menggunakan teknik PCR dengan primer gen F PaCS dan R PaCS menghasilkan pita berukuran 1300 pb, sedangkan pada K. alvarezii non transgenik tidak menghasilkan pita tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa primer tersebut dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan transgen PaCS di K. alvarezii transgenik (Gambar 7a). Hasil ini juga menunjukkan bahwa gen Cs rumput laut K. alvarezii mempunyai urutan nukleotida yang berbeda dengan gen PaCS dari Pseudomona aeruginosa. PCR dengan kombinasi primer 35sF dan R PaCS menghasilkan pita berukuran 1630 pb pada K. alvarezii tetapi tidak menghasilkan amplikon pada K. alvarezii non transgenik (Gambar 7b). Hasil analisis ini menunjukkan bahwa tanaman K. alvarezii transgenik tersebut mengandung gen PaCS di bawah kendali promoter 35S CaMV. Jadi, satu tunas K. alvarezii transgenik yang diambil secara acak dari 5 tunas yang telah diisolasi DNA nya adalah transgenik. Kombinasi primer ini juga digunakan untuk analisis integrasi gen PaCS pada Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas (Tistama 2012).
7a
(A) 7b
Gambar 7 Hasil analisis integrasi gen PaCS di dalam K. alvarezii dengan PCR. A= menggunakan kombinasi Primer F PaCS dan R PaCS B = menggunakan Primer F 35s dan R PaCS , Lajur M= Marker 1 kb, A = kontrol air, P= kontrol + plasmid, T0-1 = Rumput laut transgenik putatif, Nt= non transgenik
1500 bp 1000 bp 1630 pb λ T0-1 T0-2 T0-3 T0-4 T0-5 PaCSF – PaCSR 1300 pb M A Nt
P
1500 bp 2000 bp M A P T0-1 Nt14
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen PaCS telah berhasil diintroduksikan dan terintegrasi di dalam genom rumput laut K. alvarezii di bawah kendali promoter 35S CaMV.
Saran
Untuk penelitian berikutnya perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan efisiensi transformasi. Selain itu analisis ekspresi gen perlu dilakukan.
15