-Kontrol
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin
Sebanyak 22 isolat Bacillus sp. diperoleh dari sampel sedimen lumpur dan air tambak udang Pangandaran, Jawa Barat. Dari 22 isolat yang didapat dilakukan seleksi penghambatan terhadap bakteri Vibrio harveyi dan diperoleh 12 isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob (Lampiran 2). Hasil seleksi dari 12 isolat tersebut dipilih lima isolat terbaik, yaitu: LTP 1, LTP 4, LTP 6, LTP 14, dan ATP 2, yang memiliki indeks penghambatan terbesar untuk diamati karakteristik morfologi isolat dan diuji lanjut aktivitas antimikrob bakteriosin (Tabel 3).
Tabel 3 Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat Bacillus sp. terpilih
No Morfologi Isolat Bacillus sp. Terpilih
LTP 1 LTP 4 LTP 6 LTP 14 ATP 2
Koloni
1 Tepi Utuh Berombak Berombak Berombak Utuh
2 Elevasi Timbul Rata Melengkung Melengkung Timbul
3 Warna Putih
susu
Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu l Sel
4 Bentuk Batang Batang Batang Batang Batang
5 Gram Positif Positif Positif Positif Positif
6 Endospora Ada Ada Ada Ada Ada
Aktivitas Penghambatan Bacillus sp.
Hasil uji aktivitas penghambatan kelima isolat Bacillus sp. terhadap V.
harveyi (sel 106 cfu/ml) menunjukkan bahwa indeks penghambatan yang didapat
berkisar antara 1,07-1,77 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1. Aktivitas penghambatan supernatan bebas sel untuk kelima isolat berkisar antara 1,53 –
1,93 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1. Aktivitas unit yang didapat dari kelima isolat Bacillus sp. berkisar antara 1063-1492 mm2/ml, dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1. Berdasarkan pengujian kepekaan bakteriosin terhadap enzim proteolitik (proteinase K) menunjukkan bahwa supernatan bebas sel ternyata sensitif terhadap enzim proteinase K, dengan tidak adanya zona
penghambatan terhadap V. harveyi jika dibandingkan dengan tanpa penambahan enzim proteinase K (Tabel 4).
Tabel 4 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih terhadap V. harveyi
No Asal
Isolat Isolat
Indeks Penghambatan Aktivitas hambat mm2/ml Protein mg/ml Kepekaan enzim proteolitik Sel Supernata n 1 Sedimen LTP 1 1,77±0,93 1,93±0,12 1492 0,0834 + 2 Sedimen LTP 4 1,26±0,16 1,67±0,31 1199 0,0697 + 3 Sedimen LTP 6 1,22±0,38 1,53±0,31 1063 0,0661 + 4 Sedimen LTP 14 1,07±0,81 1,8±0,20 1342 0,0796 + 5 Air ATP 2 1,53±0,35 1,73±0,31 1270 0,0763 +
Kurva Tumbuh dan Sintesis Bakteriosin
Isolat LTP 1 yang merupakan isolat dengan kemampuan penghambatan terbaik dipilih untuk dilakukan pengamatan terhadap laju fase pertumbuhan, waktu sintesis bakteriosin, dan pengukuran kadar proteinnya. Sintesis bakteriosin sudah mulai terjadi pada fase logaritmik, aktivitas penghambatan supernatan (bakteriosin) mulai terjadi pada waktu pengamatan jam ke-9 dengan zona hambat yang terjadi 8 mm sedangkan penghambatan sel bakteri Bacillus sp. terjadi pada jam ke-3 dengan zona hambat 7,3 dan nilai kadar protein selama fase pertumbuhan berkisar antara 16,7 x 10-2 mg/ml sampai 69,4 x 10-2 mg/ml (Gambar 2).
Gambar 2 Kurva pertumbuhan isolat LTP 1 pada media pertumbuhan SWC cair selama 24 jam pada suhu ± 280 C. a) aktivitas penghambatan ( logsel, zona hambat sel, zona hambat supernatan/crude bakteriosin); b) kadar protein ( kadar protein supernatan, logsel)
15
Pengendapan Amonium Sulfat dan Perhitungan Bobot Molekul Bakteriosin Pengendapan dengan menggunakan amonium sulfat dilakukan secara bertingkat dengan penambahan amonium sulfat 10% mulai pengendapan 30%-80%. Hasil pengendapan 60-70% dan 70-80% menunjukkan aktivitas penghambatan tertinggi dengan nilai penghambatan sebesar 18,5 mm dan 16,5 mm (Gambar 3). Peningkatan zona hambat sebesar 142% terjadi pada pengendapan 60-70% dengan nilai aktivitas hambat sebesar 2490 mm2/ml dan peningkatan zona hambat sebesar 126 % untuk pengendapan 70-80% dengan nilai aktivitas hambat 1941 mm2/ml jika dibandingkan dengan ekstrak kasar supernatan sebelum pengendapan (Tabel 3).
s
Gambar 3 Hasil pengendapan amonium sulfat ( supernatan, hasil pengendapan bakteriosin). a) nilai kadar protein hasil pengendapan dan; b) penghambatan terhadap Vibrio harveyi
Tabel 5 Perbandingan aktivitas penghambatan sebelum dan sesudah pengendapan
No Perbandingan Zona hambat (mm) Indeks Pengham -batan Aktivitas hambat (mm2/ml) Kadar protein (mg/ml) Peningkatan zona hambat 1 Supernatan 13 1,6 1130 0,0811 2 60-70 % 18,5 2,7 2490 0,1225 142% 3 70-80 % 16,5 2,3 1941 0,0986 126%
Hasil perhitungan bobot molekul protein hasil pengendapan bakteriosin dengan SDS PAGE menunjukkan bahwa bobot molekul dari bakteriosin ekstrak kasar dan bakteriosin hasil pengendapan bervariasi antara 10,03 kDa hingga sekitar 22,46 kDa (Gambar 4).
a b
a b
Gambar 4 Penentuan bobot molekul bakteriosin isolat LTP 1 dengan SDS PAGE. Keterangan: 1) ekstrak kasar; 2) pengendapan 70% bakteriosin; 3) pengendapan 80% bakteriosin
Identifikasi Molekuler
Daerah gen 16S rRNA merupakan daerah yang konservatif pada makhluk hidup dan menunjukkan ciri spesifik pada setiap spesies. Hasil visualisasi amplifikasi gen 16S rRNA pada gel agarosa 1 % dihasilkan produk pita DNA dengan ukuran ± 1300 pasang basa (Gambar 5a). Analisis sekuen gen 16S rRNA dengan data pada Genbank pada program BLAST-N menunjukkan bahwa isolat
Bacillus LTP1 termasuk dalam Bacillus subtilis dengan nilai kesamaan 96%.
Sedangkan berdasarkan kontruksi pohon filogenetik untuk mengetahui kekerabatan isolat LTP 1 dengan data pada GenBank menujukan isolat LTP 1 berada dalam satu klad atau group dengan Bacillus subtilus galur DSM 10 (Gambar 5b).
Gambar 5 Identifikasi molekuler gen 16S rRNA a) hasil amplifkasi gen 16S rRNA dan; b) kontruksi filogenetik isolat LTP 1
0.02 96 85 78 10 kDa 1 2 3 15 kDa 20 kDa 25 kDa 200 kDa 10,03 kDa 15,12 kDa 18,75 kDa 22,46 kDa
17
Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap Vibrio harveyi secara in vitro
Hasil uji kompetisi penghambatan bakteriosin dan Bacillus LTP 1 terhadap
V. harveyi pada kultur cair selama 24 jam inkubasi menunjukkan adanya
kemampuan penghambatan terhadap pertumbuhan V. harveyi. Persentase penghambatan bakteriosin tertinggi terjadi pada bakteriosin hasil pengendapan 70 % dengan perbandingan 2:1 yaitu sebesar 59,36 % sedangkan penghambatan untuk isolat Bacillus LTP 1 terhadap pertumbuhan V. harveyi terbesar terjadi pada perlakuan konsentrasi 2:1 dengan penghambatan 43,07 % (Gambar 6).
Pengamatan optical density (OD) pada pertumbuhan Vibrio harveyi selama 12 jam pengamatan didapatkan hasil bahwa penambahan bakteriosin hasil pengendapan amonium sulfat dapat menekan pertumbuhan Vibrio harveyi dibandingkan dengan kontrol tanpa adanya penambahan bakteriosin hasil pengendapan amonium sulfat (Gambar 7).
Gambar 6. Uji kompetisi penghambatan Vibiro harveyi pada media SWC cair oleh: a) isolat Bacillus sp. LTP I dan; b) bakteriosin hasil pengendapan ( perbandingan 1:1, perbandingan 2:1)
Gambar 7 Turbiditas pertumbuhan Vibrio harveyi pada perlakuan penambahan bakteriosin hasil pengendapan amonium sulfat selama 12 jam inkubasi
b a
PEMBAHASAN
Penapisan Bacillus sp. dari sedimen lumpur dan air tambak udang Pangandaran di Jawa Barat dilakukan dengan cara memanaskan sampel dalam larutan garam fisiologis pada suhu 800 C selama 15 menit. Metode ini sudah menjadi cara yang umum dilakukan untuk menyeleksi Bacillus dari sampel alam, karena bakteri ini merupakan bakteri penghasil endospora. Endospora akan tahan terhadap suhu pemanasan dan bakteri yang tertapis ialah kelompok Bacillus. Bakteri ini memiliki ciri-ciri koloni yang spesifik seperti permukaan yang berpati, umumnya berwarna krem keputihan atau kekuningan jika ditumbuhkan pada media padat. Bacillus sp. dari tambak udang diperkirakan termasuk kepada kelompok bakteri mesofilik. Suhu perairan tambak udang berkisar antara 26-320 C (Jamilah et al. 2011). Pada penelitian ini, sedimen lumpur merupakan sumber
Bacillus yang paling dominan dibandingkan dengan sampel air. Hal ini diduga
karena banyaknya nutrisi dari sisa pakan yang ikut terakumulasi pada sedimen sebagai sumber nutrisi bagi kelangsungan hidup Bacillus.
Lima isolat terpilih merupakan isolat yang memiliki aktivitas penghambatan terbesar yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni pada media SWC padat yang mengandung bakteri uji Vibrio harveyi. Zona bening mengindikasikan isolat memiliki kemampuan menghasilkan senyawa antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi (Lampiran 3). Faktor yang dapat mempengaruhi besar kecilnya aktivitas penghambatan zat antimikrob antara lain:1) jenis, umur dari bakteri penghasil bakteriosin dan bakteri uji; 2) konsentrasi zat antimikrob bakteriosin dan jumlah inokulum atau kepadatan bakteri uji; 3) resistensi dari bakteri terhadap substansi zat antimikrob terkait dengan perbedaan dinding sel dari bakteri uji; 4) kadar substansi aktif atau gugus fungsi dari substansi senyawa antimikrob (Frazier dan Westhoff 1981; Usmiati et al. 2009; Noaman et al. 2014).
Bakteriosin merupakan senyawa aktif antimikrob yang bersifat ekstraseluler yang disintesis keluar sel. Senyawa antimikrob selain terdapat di dalam sel, juga merupakan komponen permukaan sel yang dihasilkan pada kondisi tertentu dan dilepas dari sel ke dalam lingkungan sekitarnya. Oleh karena itu sel bakteri yang telah ditumbuhkan di dalam media cair akan melepaskan zat antimikrobnya ke dalam media. Fase cair yang diperoleh setelah dipisahkan dari sel merupakan antimikrob ekstraseluler sehingga pengujian supernatan bebas sel yang mengandung senyawa antimikrob bakteriosin dilakukan terhadap bakteri uji
Vibrio harveyi. Kemampuan bakteriosin untuk menghambat bakteri Vibrio
harveyi menunjukkan bahwa bakteriosin yang dihasilkan memiliki sifat spektrum penghambatan yang luas, karena Bacillus sp. dari isolat terpilih dapat menghambat bakteri patogen Vibrio harveyi yang merupakan bakteri Gram negatif. Menurut Nguyen et al. (2014) dan Sahoo et al. (2014) bakteriosin dan BLIS (Bakteriocin Like Inhibitory Subtance) yang dihasilkan dari perairan umumnya memiliki sifat penghambatan spektrum sempit yang artinya kemampuan penghambatan hanya terjadi pada tingkat kekerabatan yang dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin sendiri dan beberapa bakteriosin dari golongan Gram positif perairan (Bacillus sp.) memiliki aktivitas penghambatan spektrum luas dan dapat digunakan untuk mengatasi patogen pada budiaya perikanan.
19
Pengujian sensitivitas terhadap supernatan bebas sel yang mengandung bakteriosin dari kelima isolat dengan menggunakan enzim proteinase K menunjukkan tidak adanya aktivitas penghambatan terhadap bakteri uji Vibrio
harveyi ketika diuji pada media SWC padat (Tabel 4 dan Lampiran 4). Tidak
adanya aktivitas penghambatan supernatan bebas sel yang terjadi akibat perlakuan enzim proteinase K menunjukkan komponen utama senyawa antimikrob merupakan protein alami atau polipeptida, sehingga enzim proteinase K mampu mendegradasi senyawa protein polipeptida (He et al. 2006). Senyawa bakteriosin merupakan antimikrob polipeptida yang tersusun dari 20 sampai 60 asam amino (Nes dan Holo 2000).
Isolat LTP 1 merupakan isolat dengan kemampuan penghambatan tertinggi yang memiliki nilai indeks penghambatan sel dan supernatan bebas sel sebesar 1,77 ± 0,93 dan 1,93 ± 0,12 dan dipilih untuk pengujian lanjut. Hasil identifikasi molekuler dengan menggunakan analisis molekuler 16S rRNA menunjukkan isolat LTP 1 memiliki kesamaan 96% dengan galur Bacillus
subtilis. Galur Bacillus subtilis merupakan bakteri yang diketahui dapat
menghasilkan bakteriosin jenis subtilosin Aericin, sublacin 168, dan menghasilkan BLIS jenis betacin (Abriouel et al. 2011; Sharma et al. 2011).
Pengamatan kurva tumbuh isolat terpilih Bacillus LTP1 (Gambar 2a) menunjukkan fase logaritmik terjadi pada pengamatan jam ke-3 dan fase stasioner terjadi pada jam ke-15. Sedangkan uji penghambatan Vibrio harveyi oleh sel
Bacillus sp. mulai terjadi pada jam ke-3 dan penghambatan supernatan bebas sel
(bakteriosin) terhadap Vibrio harveyi mulai terjadi pada waktu pengamatan jam ke- 9. Hal ini menunjukkan bakteriosin sudah mulai disintesis oleh Bacillus LTP 1 pada jam ke-3 dan mulai disekresikan keluar sel Bacillus sp. pada jam ke-9. Hal ini dapat dilihat dengan adanya aktivitas penghambatan pada Vibrio harveyi pada supernatan bebas sel pada jam ke-9. Pada kurva sintensis bakteriosin isolat
Bacillus LTP1 mulai terjadi pada fase logaritmik dan aktivitas penghambatannya
terus meningkat hingga memasuki fase stasioner hingga jam ke-24 pengamatan. Pada penelitian yang dilakukan oleh Khochamit et al. (2014) sintesis bakteriosin Bacillus subtilis KKU213 selama pengamatan 48 jam, diketahui bahwa aktivitas penghambatan bakteriosin mulai terjadi pada pengamatan jam ke-6 dan terus meningkat hingga pengamatan jam ke-24, sehingga bakteriosin dari Bacillus subtilis mempunyai kecenderungan untuk diproduksi maksimal pada fase stasioner (memasuki pengamatan jam ke-24).
Pola sintesis bakteriosin ini mirip dengan pola pertumbuhan bakteri dan pola sintesis protein, seperti beberapa hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Alam et al. (2011) dan Xie et al. (2009) bahwa produksi bakteriosin Bacillus subtilis terjadi pada fase eksponensial pertumbuhan bakteri. Bakteriosin disintesis di ribosom dengan menghasilkan senyawa metabolit berupa protein atau polipeptida yang umumnya disintesis selama fase pertumbuhan. Bakteriosin mulai disintesis pada pertengahan fase ekponensial, hingga puncak maksimum terjadi pada awal fase stasioner dan menurun pada akhir stasioner, penurunan terjadi karena adanya enzim proteolitik yang dilepas keluar sel oleh bakteri (Ray dan Daeschel 1992; Drider et al. 2006).
Ekstrak kasar bakteriosin dalam larutan yang bebas dari sel, kemudian dilakukan pengendapan. Tujuan dari pengendapan amonium sulfat ialah untuk meningkatkan konsentrasi protein sehingga mendapatkan konsentrasi senyawa
antimikrob bakteriosin yang lebih tinggi. Bakteriosin hasil pengendapan amonium sulfat 30% hingga 80% menunjukkan adanya peningkatan aktivitas penghambatan terhadap Vibrio harveyi, dengan nilai aktivitas penghambatan tertinggi pada pengendapan amonium sulfat 70% dan 80%. Pengendapan amonium sulfat 70% dapat meningkatkan zona hambat hingga 1,42 kali dan pengendapan amonium sulfat 80% dapat meningkatkan zona hambat sebesar 1,26 kali, jika dibandingkan dengan ektrak kasar bakteriosin sebelum dilakukan pengendapan (Tabel 3). Penelitan yang dilakukan oleh Alam et al. (2011) menunjukkan bahwa pengendapan amonium sulfat dari BLIS dari Bacillus subtilus BS15 telah berhasil meningkatkan total protein dan aktivitas penghambatan bakteriosin setelah dilakukan pengendapan dengan menggunakan amonium sulfat 80%. Pengendapan bakteriosin dengan menggunakan amonium sulfat hingga 80% telah banyak dilakukan dan berhasil untuk meningkatkan perolehan protein, dan aktivitas penghambatan bakteriosin dari B. thuringensis, B. cereus dan B. subtilis (Risoen et al. 2004; Cherif et al. 2008; Xie et al. 2009; Sharma et al. 2012).
Hasil perhitungan bobot molekul bakteriosin hasil pengendapan dengan menggunakan SDS PAGE, didapatkan bobot molekul protein bervariasi antara 10,03 kDa hingga sekitar 22,46 kDa (Gambar 4). Bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis umumnya subtilin yang memiliki bobot molekul rendah berkisar 3-14 kDa seperti subtilosin A, subtilin, dan Ericin (Sharma et al. 2011) dan yang berjenis molekul besar seperti BILS dari Bacillus subtilis 14B yang berat molekulnya hingga 21 kDa (Hammami et al. 2009).
Dari uji penghambatan bakteriosin dan kompetisi Bacillus LTP 1 terhadap Vibrio harveyi pada media SWC cair, persentase penghambatan dengan perbandingan rasio bakteriosin (1:1) dan rasio inokulum Bacillus LTP 1 (1:1) sudah cukup untuk menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi. Sedangkan dengan perbandingan rasio 2:1 bakteriosin pengendapan 70% memiliki aktivitas penghambatan terhadap Vibrio harveyi tebesar dengan persen penghambatan 59,36 % sedangkan penghambatan oleh isolat Bacillus LTP1 sebesar 43,07 %. Mekanisme utama penghambatan oleh bakteriosin bervariasi, yaitu pembentukan pori dalam membran sitoplasma atau penghambatan biosintesis dinding sel dan aktivitas enzim (RNase atau DNAse) dalam sel target. Umumnya, target dari aksi antimikrob bakteriosin ialah membran sel (Faheem et al. 2007; Chotiah 2013). Contoh subtilosin A yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis mampu berinteraksi dengan membran sel bakteri target.Tiga mekanisme antimikroba yang mungkin terjadi antara lain: 1) interaksi antara subtilosin A dengan membran yang berfungsi sebagai reseptor sehingga menyebabkan kematian sel; 2) ikatan dengan membran luar sel target sehingga meningkatkan permeabilitas membran sel target; 3) ion yang memediasi translokasi subtilosin A masuk ke dalam membran sel target kemungkinan dapat mengganggu proses kehidupan sel (Shelburne et al. 2007).
Bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis LTP1 dapat diaplikasikan untuk menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi yang merupakan bakteri patogen yang menyerang udang selama proses budidaya. Bakteriosin dengan aktivitas penghambatan yang luas pada banyak kasus dapat digunakan untuk mengganti penggunaan antibiotik pada bidang akuakultur, sehingga dapat menurunkan adanya mekanisme resistensi bakteri terhadap antibiotik dan menurunkan akumulasi residu bahan-bahan antibiotik yang ada di lingkungan yang dapat
21
berpengaruh negatif jangka panjang terhadap manusia dan kesehatan hewan akuatik. Selain itu galur Bacillus sp. penghasil bakteriosin mempunyai potensi sebagai probiotik karena kemampuan untuk memberikan keuntungan kesehatan bagi organisme sekitarnya (Gillor et al. 2008; Nguyen et al. 2014).
Penggunaan bakteriosin untuk mengatasi bakteri patogen dalam budidaya udang dapat dilakukan dengan pemberian isolat Bacillus LTP 1 sebagai bakteri probiotik yang langsung diaplikasikan pada perairan tempat hidup udang atau dengan mencampurkan bakteriosin pada pakan udang, sehingga pakan yang dihasilkan memiliki kemampuan antimikrob untuk mengatasi serangan bakteri patogen Vibrio harveyi. Tantangan pengaplikasian bakteriosin jika diaplikasikan pada pakan ialah kebutuhan akan bakteriosin yang besar dan kemampuan bakteriosin untuk tahan panas selama ditambahkan pada proses pembuatan (pelleting) pakan.
Pendekatan secara bioteknologi dapat dilakukan guna meningkatkan produksi bakteriosin dan memodifikasi bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis LTP1 sehingga lebih tahan terhadap panas. Pendekatan secara bioteknologi di antaranya dengan bioproses melalui rekayasa lingkungan dan sumber nutrisi bagi pertumbuhan Bacillus subtilis LTP1 dan juga melalui rekayasa genetik diantaranya rekayasa jalur metabolisme produksi bakteriosin, atau dengan mengintroduksikan gen penyandi bakteriosin ke dalam inang E.coli untuk diproduksi. Menurut Pag dan Sahl (2002) saat ini pengembangan pengetahuan mengenai organisasi penyusun genetik dan jalur biosintesis bakteri telah banyak membantu untuk memfasilitasi dan menganalisis di dalam peningkatan produksi bakteriosin serta memodifikasi bakteriosin sehingga dapat meningkatkan potensi bakteriosin sebagai antimikrob.
Kesuksesan produksi bakteriosin melalui proses rekayasa tergantung pada banyak faktor, antara lain: pertumbuhan sel, tingkatan ekspresi, lokasi akhir dari produk rekombinan, modifikasi pasca traslasi, dan regulasi. Selain itu bakteriosin harus memenuhi persyaratan khusus sebagai antimikrob yang efektif dan aman serta harus aktif terhadap target patogen yang dituju dan stabil dalam lingkungan saat penggunaan. Pemilihan sel inang dan unsur-unsur genetik (host-encoded) menjadi titik krusial terpenting di dalam kesuksesan ekspresi dari gen yang diinginkan karena sistem ekspresi adalah kombinasi dari kedua komponen tersebut (Makrides et al. 1996; Rodriguez et al. 2003; Gillor et al. 2005).
Bakteriosin dari Bacillus subtilis LTP1 berpotensi untuk mengatasi serangan vibrosis pada budidaya udang, dan diharapkan dapat ditingkatkan kemampuan antimikrobnya melalui pendekatan bioteknologi baik secara bioproses maupun secara rekayasa molekuler sehingga aplikasinya sebagai antimikrob yang ramah lingkungan dapat diterapkan dalam budidaya udang.