Isolasi Fungi Endofit
Media dan substrat yang digunakan mempengaruhi pertumbuhan fungi selain pengaruh dari kelembaban dan suhu lingkungan di sekitarnya. Bilgrami dan Verma (1981) menyatakan ada beberapa media yang dikelompokkan berdasarkan kegunaannya, salah satunya adalah media penyubur. Media ini dipersiapkan untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari beberapa bagian terpilih dari suatu mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Oleh karena itu, pemilihan media sangat diperlukan untuk mendukung pertumbuhan fungi endofit ini. Dalam Purwanto (2011) juga dijelaskan bahwa fungi ini hidup di atas tanah, seperti daun, batang, tangkai daun, dan alat reproduksi. Karena endofit berasosiasi secara mutualisme dengan tumbuhan inangnya. Zabalgogeazcoa (2008) menjelaskan bahwa infeksi dari endofit dapat mempengaruhi mekanisme pertahanan tumbuhan yang menetralkan serangan patogen dengan cara mengubah biokimia tanaman. Selain itu juga menghasilkan antibiotik yang menghalangi pertumbuhan patogen.
A B
c
a b
Gambar 1. Koloni Aspergillus sp5. setelah berumur 3 hari pada media PDA (A) dan bentuk mikroskopik (B), konidia (a), konidiofor (b), spora (c)
Koloni Aspergillus sp5. ini berwarna putih pada media PDA dan berubah menjadi hitam ketika konidia terbentuk. Pada Gambar 1 (A) terlihat bahwa warna koloni sudah mulai menghitam, hal tersebut disebabkan karena konidia sudah terbentuk dengan perincian kepala konidia berbentuk bulat dan berwarna hitam seperti yang terlihat pada Gambar 1 (B). Jenis Aspergillus ini dalam proses pertumbuhannya membutuhkan oksigen yang cukup atau dalam kondisi yang aerobik, hal ini yang menyebabkan Aspergillus dapat tumbuh dengan cepat. Menurut Ilyas (2006) Aspergillus yang diisolasi, secara visual koloninya tampak memiliki lapisan dasar berwarna putih dengan lapisan konidiofor yang lebat berwarna hitam. Aspergillus ini secara mikroskopis juga mudah dikenali karena memiliki konidiofor yang tegak, tidak bersepta, tidak bercabang dan ujung konidiofor membengkak membentuk vesikel.
A B
b
a
c
Gambar 2. Koloni Aspergillus sp2. setelah berumur 5 hari pada media PDA (A) dan bentuk mikroskopik (B), konidia (a), konidiofor (b), spora (c)
Bila dilihat secara makroskopis, koloni dari Aspergillus sp2. ini memiliki koloni berwarna hijau kebiruan karena lebatnya konidiofor yang panjang-panjang. Pada Gambar 2 (B) terlihat bahwa spesies ini memiliki konidofor yang tegak dan bercabang, spora yang dihasilkan berbentuk bulat. Spesies ini pertumbuhannya
agak sedikit lambat dari spesies Aspergillus yang lainnya seperti spesies Aspergillus sp5.
A B
a
b
Gambar 3. Koloni Cladosporium sp2. setelah berumur 5 hari pada media PDA (A) dan bentuk mikroskopik (B), spora (a), konidiofor (b)
Koloni Cladosporium sp2. seperti yang terlihat pada Gambar 3 (A) ini berwarna hijau tua redup yang memiliki penampakan seperti beludru dan seperti tepung karena banyaknya konidia yang terbentuk. Spora yang dihasilkan seperti yang terlihat pada Gambar 3 (B) berbentuk bulat dan membentuk rantai panjang yang bergerombol. Spesies ini umumnya ditemukan pada tanaman baik yang masih hidup ataupun pada tanaman yang sudah mati. Beberapa spesies ada yang bersifat patogen, beberapa bersifat parasit pada tanaman dan beberapa merupakan kelompok fungi.
A B
a
b
Karakteristik dari Fusarium sp. berupa struktur tubuhnya yang memiliki miselium yang bercabang dan bersepta. Makrokonidia di bentuk dari fialin, memiliki struktur tubuh halus serta berbentuk silindris dan terdiri dari 2 atau lebih sel yang memiliki dinding sel tabal. Mikrokonidia umumnya terdiri 1-3 sel, berbentuk bulat atau silinder, tersusun menjadi rantai atau gumpalan. Koloninya berwarna putih seperti yang terlihat pada Gambar 4 (A), dan memiliki konidiofor yang semula tidak bercabang tetapi kemudian bercabang seperti pada Gambar 4 (B).
A B
a b
Gambar 5. Koloni Acremonium sp. setelah berumur 7 hari pada media PDA dan bentuk mikroskopik (B), konidiofor (a), spora (b)
Pada Gambar 5 (A) terlihat bahwa Acremonium sp. ini memiliki warna koloni putih sampai kekuningan, miselium seperti kapas dan tebal di tengah koloni. Konidiofornya seringkali bercabang seperti yang terlihat pada Gambar 5 (B), pertumbuhan koloninya juga lambat. Genus ini dapat diisolasi dari jaringan tanaman dan juga dari tanah, Acremonium sp. juga berperan dalam pembentukan gubal gaharu seperti halnya Fusarium sp. Menurut Rahayu et al (2009) Acremonium sp. dan Fusarium sp. adalah fungi yang berperan dalam induksi pembentukan gubal gaharu, biasanya diisolasi dari salah satu gejala gubal. Jonhston et al (2006) dalam penelitiannya menyatakan bahwa beberapa fungi
sehingga tidak semua jaringan tanaman yang ditanam secara acak terjadi pertumbuhan fungi endofit.
Identifikasi Fungi Endofit
Fungi endofit merupakan sekelompok fungi yang dapat hidup di dalam jaringan tanaman dengan bersimbiosis mutualisme dengan tanaman inangnya. Seperti yang dikatakan oleh Tan dan Zou (2001) bahwa setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba salah satunya adalah fungi endofit yang mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Penelitian ini menggunakan beberapa jaringan muda dari tanaman A. malaccensis Lamk., seperti daun, ranting muda, dan akar. Dari penggunaan beberapa sampel tanaman A. malaccensis Lamk. dihasilkan lebih dari satu jenis isolat yang berbeda-beda dan bervariasi. Noverita et al (2009) mengatakan bahwa yang menyebabkan jenis isolat yang berbeda tersebut adalah karena adanya mekanisme adaptasi dari endofit terhadap mikroekologi dan kondisi fisiologis spesifik dari tumbuhan inang.
Hasil isolasi fungi endofit dari beberapa sampel (daun, ranting dan akar) diperoleh sebanyak 11 isolat disajikan pada Tabel. 1. Dari 11 isolat diperoleh sebanyak empat genus fungi, yaitu dengan perincian genus Aspergillus, Fusarium, Acremonium, dan Cladosporium. Pada jaringan ranting muda hanya terdapat satu isolat, setelah diidentifikasi didapatkan genus Cladosporium. Untuk jaringan pada daun didapatkan sebanyak empat isolat fungi, setelah diidentifikasi didapatkan ada empat macam genus yaitu Fusarium, Acremonium, Cladosporium, dan Aspergillus. Sedangkan pada jaringan akar terdapat enam isolat fungi, setelah
diidentifikasi didapatkan dua jenis genus yaitu Cladosporium dan Aspergillus. Cladosporium juga terdapat pada jaringan ranting muda dan pada daun.
Tabel.1. Hasil identifikasi makroskopis dan mikroskopis isolat fungi endofit dari jaringan daun, ranting muda dan akar dari tanaman A. Malaccensis Lamk.
Identifikasi
No. Sampel Makroskopis Mikroskopis Hasil Identifikasi
Warna koloni Kecepatan pertumbuhan Bentuk konidifor Spora yang dihasilkan 1. DT 2 Koloni berwarna putih, miselium seperti kapas serta menyebar merata dan tebal di tepi
Fungi mulai muncul pada hari ketiga setelah sampel ditanam Bercabang dan bersepta Spora berbentuk silindris Fusarium sp. 2. A2 Koloni berwarna hijau Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang-cabang Berbentuk bulat dan seperti rantai Cladosporium sp1. 3. DM1 Koloni berwarna putih sampai kekuningan, miselium seperti kapas dan tebal di tengah koloni
Fungi mulai muncul pada hari ketiga setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang Berbentuk bulat Acremonium sp.
4. A1a Koloni berwarna coklat muda
Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Konidiofor brercabang Spora berbentuk bulat dan berwarna hitam Aspergillus sp1. 5. B3 Koloni berwarna hijau Fungi mulai muncul pada hari ketiga setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang Berbentuk bulat dan bergerombol Cladosporium sp2.
6. A1b Koloni berwarna hijau kekuningan
Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Bercabang, panjang dan sangat tipis Bulat dan bergerombol seperti rantai Cladosporium sp3.
7. DT1a Koloni berwarna putih keabu-abuan
Fungi mulai muncul pada hari ketiga setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang Berbentuk bulat dan bergerombol seperti rantai Cladosporium sp4. 8. A2 Koloni berwarna hijau Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang Spora bulat Aspergillus sp2.
9. A1a Koloni berwarna abu-abu kecoklatan
Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Konidiofor bercabang Spora berbentuk bulat Aspergillus sp3.
10. A1b Koloni berwarna coklat
Fungi mulai muncul pada hari kedua setelah sampel ditanam Konidiofor panjang dan bercabang Spora berbentuk bulat Aspergillus sp4. 11. DM2 Koloni berwarna hitam dan menyebar rata Fungi mulai muncul pada hari ketiga setelah sampel ditanam Konidiofor tegak dan lurus Spora berbentuk bulat dan berwarna hitam Aspergillus sp5.
Genus Aspergillus lebih sering ditemukan pada sampel jaringan akar yaitu dengan ditemukannya empat (4) jenis spesies yang berbeda. Hal tersebut disebabkan karena umumnya Aspergillus lebih sering di daerah rhizosfir (daerah sekitar perakaran tanaman) dan memiliki persebaran yang lebih luas. Seperti yang dikemukakan Ilyas (2006) bahwa Aspergillus biasanya ditemukan di tanah dan juga dapat diisolasi dari daerah rhizosfir.
Tabel. 2. Kecepatan pertumbuhan dari isolasi fungi endofit pada jaringan daun, ranting muda, dan akar.
No. Sampel Muncul Hari Ke-
11 B1 3 12 B2 3 13 B3 3 14 B4 3 15 B5 3 16 A1 2 17 A2 2 18 A3 2 19 A4 2 20 A5 2
Keterangan: DT=daun tua, DM=daun muda, B=ranting muda, A=akar
Bila dilihat dari kecepatan tumbuhnya dapat disimpulkan bahwa fungi ini tumbuh dengan sangat cepat pada media PDA, dengan rata-rata kecepatan tumbuhnya adalah 3 hari. Pada Tabel. 2. dapat dilihat bahwa sampel pada jaringan akar yang ditanam pada media PDA lebih cepat tumbuh daripada sampel pada jaringan daun dan ranting muda. Walaupun semua sampel ditanam pada hari dan tanggal yang sama, namun menunjukkan kecepatan pertumbuhan yang berbeda. Sampel pada jaringan akar pertumbuhan koloninya lebih cepat yang dapat dilihat pada hari pertama munculnya fungi.
Hal tersebut disebabkan karena umumnya mikrorganisme termasuk fungi dapat tumbuh dengan subur pada media PDA karena PDA mengandung ekstrak kentang yang merupakan salah satu sumber karbohidrat. Seperti yang dikatakan
No. Sampel Muncul Hari Ke-
1 DT1 3 2 DT2 3 3 DT3 3 4 DT4 3 5 DT5 3 6 DM1 3 7 DM2 3 8 DM3 3 9 DM4 3 10 DM5 3
oleh Gandjar (2006), nutrisi pada media tumbuh dapat dimanfaatkan apabila fungi sudah mengekskresi enzim yang dapat mengurai senyawa-senyawa kompleks dari substrat menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Bila fungi tidak dapat menghasilkan enzim yang sesuai dengan komposisi substratnya maka dengan sendirinya fungi tersebut tidak dapat memanfaatkan nutrisi yang terdapat dalam substrat tersebut.
Perbandingan Fungi Endofit dan Interaksinya dengan Tanaman
Cladosporium merupakan genus yang ditemukan pada setiap jaringan tanaman A. malaccensis Lamk. yang diisolasi, hal tersebut disebabkan karena umumnya endofit ditemukan pada jaringan tanaman seperti daun, batang, dan akar. Dalam penelitiannya Faeth dan Fagan (2010) menjelaskan bahwa keberadaan fungi endofit pada jaringan tanaman berhubungan dengan banyaknya paparan sinar matahari yang diterima oleh bagian tanaman tersebut. Cladosporium yang diisolasi dari daun dan ranting muda mulai menunjukkan pertumbuhan pada hari ke-3, sedangkan pada akar hari ke-2 setelah penanaman mulai menunjukkan pertumbuhannya. Untuk pengamatan secara mikroskopis, Cladosporium yang berhasil diidentifikasi konidianya berbentuk bulat dan membentuk seperti rantai.
Dari 11 isolat yang didapatkan, empat genus diantaranya ditemukan pada sampel dari jaringan daun seperti yang terlihat pada Tabel 1. Hasil tersebut menunjukkan bahwa genus Aspergillus memiliki penyebaran yang merata, tidak hanya di daerah sekitar perakaran tanaman saja namun pada daun juga bisa ditemukannya genus ini. Nimnoi et al (2010) dalam penelitiannya menjelaskan bahwa fungi endofit ini dapat tumbuh dengan baik di daerah sekitar perakaran tanaman. Seperti yang dijelaskan dalam Purwanto (2011) bahwa fungi endofit
hanya terdapat pada daun, batang, kulit batang, tangkai daun dan alat reproduktif. Hubungan antara fungi endofit ini dengan inangnya bersifat simbiosis mutualisme, dimana endofit memperoleh nutrisi untuk melengkapi kebutuhan hidupnya dan tumbuhan inangnya mendapatkan perlindungan dari serangan patogen dengan senyawa yang dihasilkan oleh fungi endofit tersebut.
Dalam penelitiannya Tan dan Zou (2001) menjelaskan bahwa endofit dan tumbuhan inangnya memiliki hubungan yang terjadi melalui infeksi yang tidak menimbulkan gejala penyakit sampai pada hubungan simbiosis mutualisme. Bentuk simbiosis mutualisme tersebut dapat dilihat dari pertumbuhan tanaman yang terinfeksi umumnya lebih cepat dari tanaman yang tidak terinfeksi. Efek tersebut terjadi karena endofit memproduksi fitohormon dan senyawa pertumbuhan lain sehingga memacu pertumbuhannya. Selain itu, emdofit juga membantu inangnya dalam mengambil nutrisi yang diperlukannya. Sedangkan endofit dalam jaringan tanaman memperoleh nutrisi dan perlindungan dari inangnya dengan cara memproduksi metabolit yang dibutuhkan inang tersebut. Oleh karena itu, maka terbentuklah gaharu pada tanaman A. malaccensis Lamk. Seperti yang diungkapkan Rahayu et al (2009) bahwa pembentukan gaharu merupakan respon terhadap infeksi patogen yang mengakibatkan keluarnya resin yang tersimpan dalam jaringan kayu sehingga jaringan tersebut mengalami perubahan tekstur dari putih dan halus menjadi gelap dan keras.
Selain itu, endofit juga dapat meningkatkan kemampuan adaptasi tanaman yang diinfeksinya terhadap serangan patogen dan ketahanan terhadap stres lingkungan. Seperti yang diungkapkan Faeth and Fagan (2002), bahwa endofit mampu meningkatkan kemampuan adaptasi tanaman inang terhadap stres
lingkungan dan ketahanan terhadap fitopatogen, herbivora, cacing, serangga pemakan, serta bakteri dan fungi patogen.
Fungi endofit dan tanaman inangnya memiliki hubungan yang saling menguntungkan. Salah satu keuntungan yang didapat adalah bahwa endofit ini mampu memproduksi senyawa metabolit sekunder yang dibutuhkan tanaman inangnya dalam mekanismenya melawan serangan patogen, hama penyakit dan stres lingkungan. Dalam penelitiannya, Hidayahti (2010) menyatakan bahwa fungi endofit bersifat simbiosis mutualisme dengan tanaman inangnya. Beberapa manfaat yang diperoleh adalah meningkatkan laju pertumbuhan tanaman inang, memiliki ketahanan terhadap serangan hama dan penyakit, serta ketahanan terhadap kekeringan.
