Kadar Air dan Kadar Abu
Penentuan kadar air dari rimpang bangle hantu (Zingiber ottensii Va) dilakukan untuk mengetahui kandungan air pada bangle hantu sebagai persen bahan keringnya dan berfungsi untuk mengetahui ketahanan sampel dalam hal penyimpanan. Kadar air < 10% memiliki waktu simpan sampel yang relatif lebih lama dan terhindar dari pencemaran yang disebabkan mikroba (Winarno 1995). Kadar air yang diperoleh pada penelitian ini adalah 9.68%, 9.16%, dan 9.39% atau rata-rata 9.41%. Kadar air ini menunjukkan bahwa rimpang bangle hantu (Z. Ottensii Va) kering dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama.
Penentuan kadar abu juga dilakukan pada rimpang kering bangle hantu untuk mengidentifikasi kandungan mineral-mineral logam dalam rimpang tersebut. Menurut Dalimarta (2005), batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang dapat digunakan sebagai tanaman obat adalah 5%. Kadar abu yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 1.15%, 1.24%, dan 1.19% atau rata-rata 1.19% berdasarkan bobot basah. Berdasarkan kadar abu yang diperoleh pada penelitian ini, maka rimpang bangle hantu segar berpotensi untuk dijadikan obat karena kadar abu ini kurang dari batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang digunakan sebagai obat.
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi untuk menarik senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Kelebihan metode maserasi adalah peralatan sederhana, mudah dilakukan, dan tidak menggunakan pemanasan sehingga senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap panas dapat terekstrak. Kekurangan metode maserasi adalah waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi cukup lama. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini tiga macam, yaitu etanol, etil asetat, dan n-heksana yang mempunyai kepolaran berbeda dan dilakukan beberapa pengulangan secara berurutan. Pertama, ekstraksi menggunakan heksana untuk
menghilangkan komponen lemak yang mungkin akan mengganggu proses penanganan ekstrak selanjutnya, ekstrak n-heksana yang diperoleh disebut ekstrak nonpolar. Residu hasil dari ekstraksi n-heksana direndam dalam pelarut etil asetat untuk mengekstraksi senyawa yang lebih polar dari ekstrak n-heksana, dan didapatkan ekstrak etil asetat. Selanjutnya maserasi residu hasil dari ekstraksi etil asetat menggunakan pelarut etanol untuk mengekstraksi senyawa polar dan didapatkan ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan untuk menghilangkan pelarutnya dan mengetahui persen rendemen dengan rotary evaporator pada suhu 40 ˚C. Rendemen yang diperoleh adalah 1.32% untuk ekstrak n-heksana, 1.01% ekstrak etil asetat, dan 3.22% ekstrak etanol. Ekstrak kental yang dihasilkan dari masing-masing pelarut kemudian di uji fitokimia dan uji inhibisi enzim dengan menggunakan enzim lipase pankreas manusia.
Isolasi Minyak Atsiri Bangle Hantu
Isolasi minyak atsiri dari rimpang bangle hantu segar dilakukan dengan metode destilasi air menggunakan akuades sebagai pelarut. Proses destilasi dilakukan pada suhu 100-105 ˚C karena pada kisaran suhu tersebut air sebagai pelarut rimpang bangle hantu yang didestilasi mendidih, selanjutnya air menguap membawa minyak atsiri yang bersifat volatil. Setelah melewati kondensor, uap minyak atsiri akan mengalami kondensasi kembali menjadi cairan dan ditampung di alat penampung dan dipisahkan dari air.
Gambar 5 Destilat kasar minyak atsiri dan kristal minyak atsiri rimpang segar bangle hantu (Zingiber ottensii Va).
Bobot minyak atsiri bangle hantu adalah 0.897 g/mL sedangkan bobot air adalah 1 g/mL, dengan demikian minyak atsiri bangle hantu terdapat pada lapisan atas sedangkan air sebagai pelarutnya ada dilapisan bawah. Destilat kasar minyak atsiri bangle hantu yang dihasilkan tidak berwarna dan kristal yang diperoleh berwarna putih ditunjukkan pada Gambar 5. Rendemen destilat kasar minyak atsiri rimpang bangle hantu segar adalah 0.36% berdasarkan bobot basah, sedangkan rendemen kristal adalah 0.002%.
Uji Fitokimia
Ekstrak yang diperoleh selanjutnya diuji fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak. Hasil uji fitokimia ditunjukkan pada Tabel 1. Golongan senyawa dalam ekstrak kasar dapat ditentukan dengan melihat perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat lebih banyak mengandung senyawa metabolit sekunder daripada ekstrak n-heksan dan etanol, ini disebabkan etil asetat yang bersifat semi polar sehingga dapat mengekstrak senyawa nonpolar dan senyawa polar yang kepolarannya rendah.
Tabel 1 Hasil uji fitokimia bangle hantu kering, minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu (Zingiber ottensii Va)
Golongan senyawa Ekstrak Bangle hantu Kering Minyak Atsiri n-heksana etil asetat etanol
Saponin - + ++ + - Flavonoid - +++ ++ ++ - Alkaloid - - - - - Tanin - +++ ++ + - Kuinon - + ++ + - Steroid - ++ - - - Terpenoid +++ - - + +++
Keterangan: (+) hasil uji positif, sedikit. (++) hasil uji positif, sedang. (+++) hasil uji positif, banyak. (-) hasil uji negatif.
Senyawa terpenoid terdeteksi hanya pada ekstrak n-heksana dan minyak atsiri, karena terpenoid merupakan senyawa yang bersifat nonpolar dan volatil sehingga tidak terekstrak dalam etil asetat dan etanol. Senyawa alkaloid menunjukkan hasil yang negatif pada semua ekstrak, hal ini berbeda dengan hasil Pradono (2005) pada ekstrak segar bangle (Zingiber cassumunar). Hasil yang berbeda ini disebabkan perbedaan sumber sampel yang digunakan, dalam penelitian ini sampel yang digunakan adalah bangle hantu (Zingiber ottensii Va). Ekstrak etanol mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan kuinon, sedangkan pada ekstrak etil asetat mengandung flavonoid, saponin, tanin, kuinon, dan steroid. Pendugaan sementara golongan senyawa yang berperan dalam menghambat aktivitas lipase pankreas dapat dilihat berdasarkan hasil uji fitokimia.
Uji In Vitro Ekstrak Sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas
Berdasarkan hasil dari daya inhibisi ekstrak kasar bangle hantu, minyak atsiri bangle hantu, dan kristal minyak atsiri diketahui memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas. Tiap ekstrak memiliki IC50 berbeda dan ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Daya inhibisi ekstrak kasar dan minyak atsiri bangle hantu terhadap aktivitas lipase pankreas
Sampel IC50 (µg/mL)
Ekstrak etanol >1000
Ekstrak etil asetat 72.35
Ekstrak n-heksana 27.49
Destilat kasar minyak atsiri 0.67
Kristal minyak atsiri 10.76
Xenical (Orlistat) 746.68
Destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu ditentukan daya inhibisinya dengan cara melarutkan destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu dalam buffer fosfat
dengan tujuan untuk mempertahankan pH lipase pankreas supaya tetap ber-pH 8 sehingga hidrolisis tetap dalam keadaan optimum. Enzim lipase bekerja dengan cara mempercepat hidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Reaksi hidrolisis lipase pankreas dihentikan dengan penambahan kloroform. Penambahan kloroform-heptana (1:1) berfungsi untuk mengekstraksi asam oleat yang terbentuk sebagai hasil hidrolisis minyak wijen, sedangkan yang berfungsi mengikat asam oleat bebas adalah pereaksi tembaga yang selanjutnya akan dikompleks dengan penambahan natrium dietilditiokarbamat membentuk warna kuning dengan lapisan kloroform-heptana yang mengandung asam oleat. Daya inhibisi enzim lipase pakreas terhadap destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri dan ekstrak kasar bangle hantu ditunjukkan pada Lampiran 9.
Kontrol positif yang digunakan adalah Xenical® yang merupakan produk pelangsing komersial yang banyak digunakan masyarakat. Xenical mengandung bahan aktif orlistat yang digunakan untuk mengobati orang yang mengalami obesitas. Obat ini bekerja dengan mengabsorbsi lemak makanan dalam tubuh dan menekan nafsu makan (Genentech 2010). Larutan blangko (tanpa penambahan ekstrak) digunakan sebagai kontrol negatif. Uji inhibisi enzim ini menggunakan lima ragam konsentrasi untuk semua ekstrak yaitu: 62.5 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, dan 1000 µg/mL. Ragam konsentrasi ini dimaksudkan untuk melihat hubungan penambahan konsentrasi ekstrak terhadap daya inhibisi enzim lipase pankreas manusia.
Xenical yang mengandung orlistat sebagai kontrol positif memiliki IC50 746.68 µg/mL, hasil tersebut tidak berbeda jauh dengan yang dihasilkan oleh Shin et al. (2003) yaitu 800 µg/mL. Xenical memiliki daya hambat yang lebih kecil dari ekstrak etil asetat, ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri karena Xenical merupakan obat antiobesitas yang mengandung orlistat tidak murni sehingga memiliki daya hambat lebih kecil. Ekstrak etanol memiliki IC50>1000 µg/mL dimana lebih tinggi dari kontrol positif, ini diakibatkan oleh senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol berdasarkan uji fitokimia tidak mengandung steroid dan terpenoid. Berdasarkan penelitian sebelumnya, steroid dan terpenoid merupakan inhibitor lipase yang baik. Ekstrak etil asetat, n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri
memiliki IC50 lebih rendah dari Xenical, diduga senyawa aktif pada Xenical memiliki daya hambat yang lebih rendah dari senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak etil asetat, ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri. Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa daya hambat enzim lipase semakin tinggi pada senyawa yang bersifat nonpolar, diduga senyawa aktif sebagai penghambat enzim lipase adalah senyawa yang bersifat nonpolar.
Senyawa-senyawa yang diperkirakan dapat menghambat aktivitas lipase pankreas adalah flavonoid, saponin, steroid, tanin, dan triterpenoid. Ekstrak saponin kasar ginseng merah Korea dapat mengurangi bobot badan tikus pada konsentrasi 200 µg/mL (Kim & Kang 2009). Fraksi saponin dari ekstrak air daun Oolong tea menginhibisi lipase pancreas pada konsentrasi 500-2000 µg/mL (Han et al. 1999). Chikusetsusaponin juga dapat menghambat aktivitas lipase pada konsentrasi 125-500 µg/mL baik secara in vitro maupun in vivo pada rimpang Panax japonicas (Han et al. 2005). Xu et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa triterpenoidal saponin pada Platycodi radix diketahui dapat menghambat aktivitas lipase pankreas. Gordon et al. (2009) menyatakan senyawa aktif tanin pada buah jenis berry juga berpotensi sebagai antiobesitas dengan menghambat aktivitas lipase. Selain itu, senyawa tanin pada ekstrak tanin rimpang bangle (Z. cassumunar) juga memiliki potensi dalam menghambat aktivitas lipase (Iswantini et al. 2003). Senyawa 3-metiletergalangin yang diisolasi dari fraksi etil asetat Alpinia officinarum secara in vitro dapat menghambat aktivitas lipase pankreas dan in vivo mampu menurunkan kadar kolesterol tikus jantan (Shin et al. 2003).
Penentuan Eluen Terbaik dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Eluen terbaik adalah eluen yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan terpisah. Menurut Shin et al. (2003), fraksi etil asetat Alpinia officinarum memperlihatkan daya hambat (IC50 3000 µg/mL) lebih tinggi dibandingkan ekstrak air (IC50 9600 µg/mL), fraksi eter (IC50 9200 µg/mL), dan fraksi butanol (IC50>10000 µg/mL) menggunakan substrat triolein. Ekstrak etil asetat dianalisis dengan KLT G60F254 dari Merck dengan menggunakan pelarut kloroform:metanol (10:1-2:1) dan diperoleh 5 spot (Shin et al. 2003). Oleh karena itu, sampel yang digunakan untuk fraksinasi kromatografi kolom dalam penelitian ini digunakan
ekstrak etil asetat, selain memiliki IC50 72.36 µg/mL yang lebih rendah dari ekstrak etanol yaitu IC50>1000 µg/mL, ekstrak etil asetat mengandung senyawa saponin dan steroid yang diduga berpotensi sebagai inhibitor lipase yang baik pada konsentrasi tinggi maupun rendah (Iswantini 2003).
Berdasarkan hasil KLT menggunakan pelarut kloroform-metanol (K:M) (10:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, dan 4:6,) serta eluen tunggal kloroform (K) dan metanol (M) diperoleh jumlah spot terbanyak dan terpisah yakni 5 spot pada perbandingan pelarut kloroform-metanol (10:1), kromatogram KLT disajikan pada Gambar 6. Dengan demikian, kloroform-metanol (10:1) dipilih sebagai eluen terbaik dan dijadikan dasar untuk analisis penentuan fraksi hasil pemisahan ekstrak etil asetat bangle hantu menggunakan kromatografi kolom.
(K:M) 10:1 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 (M) (K)
Gambar 6 Kromatogram KLT ekstrak etil asetat bengle hantu dengan perbandingan eluen kloroform-metanol (10:1-4:6) serta eluen tunggal metanol (M) dan kloroform (K) menggunakan fase diam Silika Gel G60 F254.
Fraksinasi Ekstrak Etil asetat Bangle hantu
Fraksinasi ekstrak etil asetat bangle hantu dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom silika Gel G-60 dengan eluen n-heksana, kloroform, dan metanol secara gradien. Silika gel merupakan fase diam yang bersifat menahan sampel (adsorben), sehingga sampel yang memiliki kepolaran yang mirip dengan eluen akan keluar terlebih dahulu sedangkan yang sifatnya berbeda akan tertahan pada kolom. Eluen n-heksana, kloroform, dan metanol dengan berbagai komposisi pada penelitian ini berhasil membawa pita-pita senyawa yang terkandung dalam ekstrak etil asetat bangle hantu keluar dari kolom. Hasil dari pemisahan dengan kromatografi kolom silika gel diperoleh 175 tabung reaksi dengan volume 5 mL tiap tabung reaksi dan di KLT tiap kelipatan 5 tabung (Lampiran 10). Dari 175 tabung reaksi diperoleh 5 fraksi, tiap fraksi dipisahkan dan dievaporasi untuk menghilangkan pelarut yang terdapat pada fraksi tersebut. Selanjutnya fraksi-fraksi di KLT kembali dan kromatogram KLT dari hasil fraksi-fraksi kromatografi kolom ditunjukkan pada Gambar 7. Kelima fraksi tersebut memiliki spot dan Rf yang berbeda ditunjukkan pada Tabel 3.
F1 F2 F3 F4 F5
Gambar 7 Kromatogram KLT hasil fraksi kolom dengan fase diam silika gel G60F254 dan fase gerak n-heksana, kloroform, dan metanol secara gradien.
Tabel 3 Rendemen dan Rf fraksi hasil kromatografi kolom Fraksi Rendemen (%) Rf A 19.32 0.96 B 23.76 0.86 C 27.88 0.68 D 19.55 0.40 E 18.13 0.18
Hasil fraksi dari pemisahan kromatografi kolom selanjutnya diuji inhibisi enzim lipase pankreas manusia. Berdasarkan hasil dari daya inhibisi fraksi kolom kromatografi diketahui bahwa setiap fraksi memiliki daya inhibisi berbeda diakibatkan senyawa yang terkandung dalam tiap fraksi berbeda, diduga bahwa senyawa yang dapat menghambat lipase pankreas manusia terdapat pada fraksi E karena fraksi E memiliki IC50 lebih rendah yaitu 18,74 µg/mL sedangkan fraksi A, B, C, dan D memiliki IC50 >1000 µg/mL (Lampiran 12).
Identifikasi Senyawa Aktif pada Bangle Hantu
Hasil uji daya inhibisi enzim lipase pankreas diperoleh IC50 yang lebih rendah pada minyak atsiri rimpang bangle hantu yaitu 0.67 µg/mL dan kristal minyak atsiri bangle hantu yaitu 10.76 µg/mL, sedangkan pada Fraksi E ekstrak etil asetat hasil kromatografi kolom diperoleh IC50 18.74 µg/mL. Berdasarkan IC50 yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa senyawa aktif pada fraksi E ekstrak etil asetat memiliki daya hambat yang lebih rendah daripada senyawa aktif yang terkandung dalam minyak atsiri dan kristal minyak atsiri. Dugaan sementara senyawa aktif adalah suatu senyawa golongan terpenoid. Berdasarkan hasil uji fitokimia minyak atsiri mengandung senyawa golongan terpenoid. Menurut Iswantini et al. (2011), senyawa aktif dari tanaman obat yang dapat menghambat lipase pankreas adalah steroid, polifenol, dan terpenoid.
Identifikasi kandungan senyawa aktif yang dapat menghambat aktivitas enzim lipase pankreas dilakukan pada ekstrak n-heksana, minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri rimpang bangle hantu menggunakan gas chromatography and mass
spectrometry (GC-MS) karena berdasarkan uji fitokimia n-heksana dan minyak atsiri mengandung senyawa golongan terpenoid yang bersifat non-polar dan volatil. Kondisi GC-MS sebagai berikut: Injektor mode split 101:1, suhu 250 °C. waktu alir 37,14 menit, kolom yang digunakan adalah: Agilent 19091S-436 HP-5MS, panjang 60 m, diameter 0,25 mm, suhu maksimum kolom 350°C, aliran pertama 1 mL/menit, kecepatan rata-rata 26 cm/s. Gas pembawa helium, suhu detektor 250°C, dengan jenis pengionan Electron Impact (EI). Kromatogram ion total dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana, distilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri bangle hantu ditunjukkan pada Gambar 8.
Berdasarkan hasil GC-MS yang ditampilkan pada kromatogram dan spektrum massa yang dibandingkan dengan database Wiley7n.L, senyawa-senyawa utama yang terkandung dalam ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri rimpang bangle hantu ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel 4 Perbedaan senyawa utama yang terkandung dalam destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri, dan ekstrak n-heksana bangle hantu (Zingiber ottensii Va).
Sampel Senyawa Waktu retensi
(menit)
Kelimpahan (%) Destilat kasar minyak atsiri Zerumbon 22.87 29.50
α-Humulena 16.35 13.07
Sabinena 6.68 10.30
Terpinen-4-ol 10.17 8.60 2-β-Pinena 6.79 6.53
Kristal minyak atsiri Zerumbon 22.42 100
Ekstrak n-heksana Zerumbon 22.73 42.06
α-Humulena 16.28 20.94
Gambar 8 Kromatogram ion total hasil GC-MS (a) kristal minyak atsiri, (b) minyak atsiri, dan (c) ekstrak n-heksana
Waktu (menit) terpinen-4-ol α-humulena zerumbon Waktu (menit) Waktu (menit) (a) (b) (c)
Urutan komponen utama minyak atsiri rimpang bangle hantu pada penelitian ini adalah zerumbon, α-humulena, sabinena, terpinen-4-ol, dan 2-β -pinena. Hasil ini tidak menunjukkan perbedaan yang jauh dengan yang dihasilkan Thubthimthed et al. (2003), yaitu zerumbon, terpinen-4-ol, p-cymene, sabinena, dan humulena. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan tempat tumbuh, teknik isolasi, teknik analisis, dan perbedaan klon varietas. Komponen utama pada ekstrak n-heksana adalah zerumbon, terpinen-4-ol, dan α-humulena, sedangkan sabinena dan 2-β-Pinena memiliki persen kelimpahan <1% karena senyawa tersebut termasuk dalam monoterpena yang sangat volatil diduga menguap pada saat proses pengeringan simplisia dan evaporasi. Kristal minyak atsiri yang didapatkan adalah senyawa murni zerumbon dengan waktu retensi 22,28 menit dan persen kelimpahan 100% ditunjukkan dengan adanya satu peak pada kromatogram ion total hasil GC-MS.
Berdasarkan analisis GC-MS bahwa ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri pada waktu retensi ±22 menit menunjukkan adanya senyawa aktif yang sama yaitu zerumbon. Daya hambat destilat kasar minyak atsiri lebih tinggi dari zerumbon dan ekstrak n-heksana, diduga karena adanya senyawa aktif lain selain zerumbon, yaitu sabinena dan 2-β -pinena yang saling menguatkan pada destilat kasar minyak atsiri yang berpotensi menghambat aktivitas lipase sehingga daya hambat terhadap enzim lipase lebih tinggi dari senyawa zerumbon, sedangkan pada ekstrak n-heksana daya hambatnya lebih rendah dari kristal zerumbon diduga karena persen kelimpahan sabinena dan 2-β-pinena yang terdapat pada ekstrak n-heksana kurang dari 1%.
Hasil senyawa murni pada kristal minyak atsiri yang diperoleh pada penelitian ini adalah zerumbon (Lampiran 13). Zerumbon merupakan suatu seskuiterpena berbentuk kristal golongan terpenoida yang terdiri dari tiga satuan isoprena yang memiliki bobot molekul (BM) 218 m/z, bersifat nonpolar, volatil, memiliki struktur keton silang terkunjugasi pada sebelas cincin karbon (Gambar 9), dan memiliki karakteristik sitotoksik yang selektif terhadap garis sel kanker dan garis sel normal, serta sebagai antiinflamasi dan kemoterapi (Murakami et al. 2002).