Bangle Hantu
Bangle hantu (Zingiber ottensii Va) termasuk salah satu jenis tumbuhan dari keluarga Zingiberaceae. Bangle hantu memiliki nama daerah panglai hideung (Sunda), bunglai hantu (Sumatera), lampoyang hitam, kunyit hitam, berseh hitam (Malaysia), phai dam dan plai muang (Bangkok). Bangle hantu tumbuh sebagai semak tak berbatang. Tanaman itu tumbuh berumpun-rumpun, dan berbatang basah, tingginya mencapai 200 cm, dengan rimpang berwarna ungu¸ dan berbau tidak sedap (Sirirugsa 1999).
Bangle hantu mempunyai klasifikasi: kingdom plantae, divisi Plantanum, sub divisi Spermatophyta, kelas Monocotyledonae, ordo Zingiberales, famili Zingiberaceae, genus Zingiber, dan spesies Zingiber ottensii Va (Marsusi et al. 2001). Tanaman dan rimpang bangle hantu ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1 Tanaman dan rimpang bangle hantu
Bangle hantu (Z. ottensii) digunakan masyarakat untuk meredam demam, batuk, dan kejang pada anak-anak. Rimpangnya mengandung minyak atsiri steroid dan flavonoid, sehingga berkhasiat sebagai karminatif. Minyak atsiri bangle hantu mengandung komponen utama zerumbon (40.1%), terpinen-4-ol (11.2%), p-cymene (6.9%), sabinen (6.5%) dan humulen (5.6%) (Thubthimthed et al. 2003). Bangle hantu memiliki sifat khas menghangatkan dan membersihkan darah (Suara
merdeka 2008). Menurut Sirirugsa (1999), rimpang bangle hantu (Z. ottensii) dapat digunakan sebagai penenang kejang dan obat sakit pinggang. Bangle hantu juga sebagai antibakteri, antioksidan, dan antialergi (Habsah et al. 2000).
Obesitas
Obesitas adalah kelebihan berat tubuh akibat tertimbunnya lemak, untuk pria dan wanita masing-masing melebihi 20% dan 25% dari berat tubuh. Seseorang yang memiliki berat badan 20% lebih tinggi dari nilai tengah kisaran berat badannya yang normal dianggap mengalami obesitas. Tingkat obesitas dapat diketahui dengan menghitung indeks massa tubuh (IMT). Klasifikasi IMT menurut WHO yang cocok untuk masyarakat Asia tahun 2000 adalah: kurus (IMT<18), normal (IMT=18-25), gemuk sehat (IMT=25-30), dan gemuk tidak sehat atau obesitas (IMT>30) (Siagian 2004). Obesitas digolongkan menjadi 3 kelompok:
• Obesitas ringan : kelebihan berat badan 20-40%
• Obesitas sedang : kelebihan berat badan 41-100%
• Obesitas berat : kelebihan berat badan >100%. Obesitas berat ditemukan sebanyak 5% dari antara orang-orang yang gemuk.
Terjadinya obesitas melibatkan beberapa faktor, diantaranya genetik, fisiologis, makanan, dan perilaku (gaya hidup). Secara ilmiah, obesitas terjadi akibat mengkonsumsi kalori lebih banyak dari yang diperlukan oleh tubuh. Obesitas meningkatkan resiko menderita penyakit jantung koroner, hiperlipidemia, penyakit hati dan kantong empedu, penyakit persendian (osteoarthritis), kanker, dan penyakit saluran pernapasan (Pi-Sunyer 1993). Penderita obesitas juga beresiko lebih tinggi menderita hipertensi, encok, dan tidur mendengkur dibandingkan orang yang berat tubuhnya normal (Miller et al. 1996).
Antiobesitas
Antiobesitas adalah bahan atau obat yang digunakan untuk menurunkan berat badan, yang dapat merangsang pembakaran lemak, menghambat penyerapan lemak, dan mengurangi nafsu makan (Birari & Bhutani 2007). Obat antiobesitas
yang beredar di pasar pada saat ini adalah orlistat yang dapat mengurangi penyerapan lemak usus melalui menghambat enzim lipase pankreas, dan sibutramine sebagai penekan anorektik atau nafsu makan. Kedua obat ini memiliki efek samping yang berbahaya, termasuk peningkatan tekanan darah, mulut kering, sembelit, sakit kepala, dan insomnia. Oleh karena itu, berbagai macam bahan alam telah dieksplorasi untuk pengobatan obesitas (Yun 2010).
Lipase
Lipase merupakan enzim utama dalam penguraian lipida, menghidrolisis trigliserida makanan dalam usus menjadi monogliserida dan asam lemak rantai panjang. Substrat dari enzim ini adalah trigliserida berantai panjang yang tidak larut dalam air, seperti minyak dan lemak. Monogliserida dan asam lemak serta sebagian lipase akan berdifusi masuk dalam pembuluh darah. Aktivitas enzim lipase pankreas yang meningkat akan meningkatkan penyerapan monogloserida dan asam lemak yang pada akhirnya menimbulkan penimbunan lemak dan menyebabkan obesitas (Raharjo et al. 2005). Menurut Birari & Bhutani (2007), lipase pankreas menghidrolisis 50%-70% dari total lemak asupan makanan dan merupakan enzim yang paling banyak dipelajari sebagai mekanisme kerja antiobesitas. Reaksi hidrolisis trigliserida oleh enzim lipase ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Reaksi hidrolisis trigliserida Lipase
Lipase dapat berinteraksi langsung dengan beberapa zat, salah satu contohnya adalah tetrahidrolipstatin (orlistat). Mekanisme orlistat yaitu dengan cara menghambat absorpsi lemak melalui penghambatan aktivitas lipase pankreas sehingga meningkatkan ekskresi lewat feses (Roche 2008). Orlistat dapat menghambat lipase dan secara klinis disetujui untuk digunakan dalam pengobatan obesitas, tetapi orlistat memiliki efek samping yang tidak menyenangkan pada gastrointestinal yaitu dapat menyebabkan kelebihan lemak pada feses (steatorrhea).
Xenical ®
Xenical adalah suatu obat yang digunakan sebagai penghambat enzim lipase saluran cerna dengan lama kerja yang panjang. Xenical mengandung bahan aktif orlistat yang digunakan untuk mengobati orang yang mengalami obesitas. Obat ini bekerja dengan mengabsorbsi lemak makanan dalam tubuh dan menekan nafsu makan (Genentech 2010). Menurut Yamamato et al (2000), orlistat adalah inhibitor kuat pada lambung dan lipase karboksilester, yang terbukti efektif untuk pengobatan obesitas manusia.
Orlistat merupakan turunan dari senyawa lipstatin yang diisolasi dari bakteri Streptomyces toxytricini. Orlistat merupakan agen yang menghambat lipase gastrointestinal. Semakin rendah aktivitas enzim yang dihasilkan usus mengurangi sekitar sepertiga jumlah lemak yang diserap dari makanan (Moyers 2005). Oleh karena trigliserida yang utuh tidak diserap, maka defisit kalori akan berdampak positif pada pengaturan berat badan. Struktur orlistat ditunjukkan pada Gambar 3.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2010 sampai dengan Mei 2011 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia Institut Pertanian Bogor (IPB), Pusat Studi Biofarmaka (LPPM) IPB, dan Pusat Laboratorium Forensik Mabes POLRI Jakarta.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelat KLT silika gel GF254, kolom kromatografi silika gel (Merck; 70-230 mesh; 1×25 cm), Spektrofotometer UV-Vis merk U-2800, GC-MS merk Agilent Technologies, rotary evaporator, destilator, dan eksikator.
Bahan yang digunakan adalah rimpang bangle hantu segar dan kering yang berasal dari Kebun Pusat Studi Biofarmaka Cikabayan Bogor, enzim lipase manusia dengan kode L9780-50 units, buffer fosfat, minyak wijen ABC, pereaksi tembaga, kloroform, heptana, Xenical® (orlistat), dan Na-dietilditiokarbamat.
Prosedur Penelitian
Sampel berupa rimpang bangle hantu diambil langsung dari Kebun Pusat Studi Biofarmaka Cikabayan Bogor. Sampel dideterminasi di LIPI Cibinong tujuannya untuk menghindari kesalahan dalam pemilihan sampel. Sampel dicuci sampai bersih untuk menghilangkan kotoran yang menempel, setelah itu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruangan, dan dibuat dalam bentuk serbuk. Sedangkan untuk sampel segar, bangle hantu setelah dicuci, diiris tipis, selanjutnya didestilasi untuk menghasilkan minyak atsiri. Penetapan kadar air ditunjukkan pada Lampiran 2, serbuk diekstraksi dan diuji fitokimia (Lampiran 4.), ekstrak diuji aktivitas inhibitor lipase pankreas in vitro (Lampiran 6). Ekstrak teraktif dipisahkan dengan kromatografi kolom silika gel dan diperoleh fraksi teraktif. Bagan alir penelitian ditunjukkan pada Gambar 4.
Ekstraksi
Sebanyak 5 kg rimpang bangle hantu segar diiris kemudian dimasukkan ke dalam distilator secara bertahap, lalu ditambahkan akuades dengan perbandingan sampel:akuades (1:2), selanjutnya proses destilasi air dilakukan selama 4 jam pada suhu 100-105 ˚C. Destilat yang diperoleh kemudian didiamkan selama 24 jam, lalu minyak yang terdapat dalam destilat dipisahkan dari lapisan airnya dan disimpan pada suhu 4 ˚C. Minyak yang diperoleh selanjutnya di uji inhibitor lipase pankreasnya dan di analisis dengan menggunakan GC-MS untuk mengetahui komponen senyawanya (Sabulal 2006).
Ekstraksi sampel kering rimpang bangle hantu menggunakan metode maserasi untuk menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini ada tiga macam, yaitu etanol, etil asetat, dan n-heksana yang mempunyai kepolaran berbeda dan dilakukan beberapa pengulangan secara berurutan. Pertama, sebanyak 900 g serbuk sampel direndam dalam n-heksana (1:4) sebanyak dua kali ulangan selama 24 jam lalu disaring untuk menghasilkan senyawa nonpolar. Kedua, residu hasil dari ekstraksi n-heksana direndam dalam pelarut etil asetat (1:4) untuk mengekstraksi senyawa yang lebih polar dari ekstrak pertama. Ketiga, maserasi residu hasil dari ekstraksi etil asetat menggunakan pelarut etanol (1:4) untuk mengekstraksi senyawa polar. Selanjutnya ekstrak n-heksan, etil asetat dan etanol dipekatkan dengan penguap putar vakum untuk menghilangkan pelarutnya. Ekstrak kental yang dihasilkan dari masing-masing pelarut kemudian di uji antiobesitas dengan menggunakan enzim lipase pankreas manusia. Ekstrak yang memiliki aktivitas tertinggi dianalisis menggunakan KLT yang berfungsi membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi kolom.
Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan campuran senyawa pada ekstrak kental yang memiliki aktivitas inhibitor lipase pankreas menjadi senyawa murninya dengan menggunakan fase diam berupa silika gel Merck ukuran 70-230 mesh, dimensi 1×25 cm, dan fase geraknya berupa pelarut
yang memiliki spot terbanyak terbanyak dan terpisah dengan baik pada KLT. Hasil kromatografi kolom ditampung setiap 5 mL dan dianalisis menggunakan KLT, selanjutnya fraksi yang diperoleh di uji aktivitas enzim lipase pankreas secara in vitro.
Uji In vitro
Metode uji in vitro yang digunakan mengacu pada metode Han et al (2005) dengan beberapa modifikasi yaitu menggunakan substrat triolein, buffer N-tris-(hidroksimetil)-metil-2-aminoetana-asam sulfat pada pH 7, suhu 37 ˚C dengan waktu inkubasi 30 menit, dan larutan pengompleks warna batokuproin dalam klo roform 0.05% (b/v). Metode uji yang digunakan yaitu menggunakan minyak wijen sebagai substrat dan pereaksi-pereaksi lain yang lebih sederhana. Sebanyak 15 µL substrat dan 100 µL ekstrak sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambah dengan 10 µL albumin 10% dan 1 mL larutan buffer pH 8. Setelah itu 100 μL enzim lipase pankreas dengan konsentrasi 1.4×10-5 µg/µL dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan diinkubasi selama 45 menit pada suhu 40 ˚C, selanjutnya ditambahkan 3 mL kloroform. Larutan dalam tabung kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 g selama 5 menit. Sebanyak 1 mL lapisan kloroform kemudian diambil dan ditambahkan 4 mL kloroform-heptena (1:1, v/v) lalu dikocok hingga homogen. Setelah itu larutan ditambahkan 2.5 mL pereaksi tembaga, dikocok 3 menit, dan disentrifuse kembali selama 10 menit. Lapisan kloroform kemudian diambil sebanyak 3 mL dan ditambahkan 0.25 mL larutan Na-dietilditiokarbamat, hingga berwarna kuning. Larutan kemudian diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm. Nilai yang diperoleh kemudian dikonversi dengan perhitungan sehingga diperoleh nilai aktivitas enzim. Aktivitas enzim dinyatakan dalam µmol asam oleat/L.menit. Kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan ekstrak, sedangkan untuk kontrol positif dilakukan dengan mengganti ekstrak dengan Xenikal® (Pradono et al. 2005). Tahapan ini ditunjukkan pada Lampiran 6. Prosedur pembuatan pereaksi tembaga dan natrium dietilditiokarbamat ditunjukkan pada Lampiran 5. Perhitungan lipase pankreas ditunjukkan pada Lampiran 7.
Selanjutnya fraksi hasil kromatografi kolom yang menunjukkan daya hambat paling tinggi dibandingkan dengan daya hambat pada minyak atsiri dan kristal minyak atsiri bangle hantu untuk mengetahui daya hambat paling tinggi yang selanjutnya akan di analisis dengan GC-MS untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung di dalamnya.
Gambar 4 Diagram alir penelitian Uji fitokimia
Uji inhibisi enzim
Uji inhibisi enzim
Ekstrak kasar Bangle Hantu
Maserasi bertingkat (n-heksan, etil asetat, etanol)
Ekstrak n-heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak etanol
Uji fitokimia Uji inhibisi enzim
Kromatografi kolom
Ekstrak terpilih
Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi n
Fraksi teraktif Sampel segar Bangle Hantu Destilasi Minyak atsiri Senyawa aktif Analisis Determinasi
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air dan Kadar Abu
Penentuan kadar air dari rimpang bangle hantu (Zingiber ottensii Va) dilakukan untuk mengetahui kandungan air pada bangle hantu sebagai persen bahan keringnya dan berfungsi untuk mengetahui ketahanan sampel dalam hal penyimpanan. Kadar air < 10% memiliki waktu simpan sampel yang relatif lebih lama dan terhindar dari pencemaran yang disebabkan mikroba (Winarno 1995). Kadar air yang diperoleh pada penelitian ini adalah 9.68%, 9.16%, dan 9.39% atau rata-rata 9.41%. Kadar air ini menunjukkan bahwa rimpang bangle hantu (Z. Ottensii Va) kering dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama.
Penentuan kadar abu juga dilakukan pada rimpang kering bangle hantu untuk mengidentifikasi kandungan mineral-mineral logam dalam rimpang tersebut. Menurut Dalimarta (2005), batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang dapat digunakan sebagai tanaman obat adalah 5%. Kadar abu yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 1.15%, 1.24%, dan 1.19% atau rata-rata 1.19% berdasarkan bobot basah. Berdasarkan kadar abu yang diperoleh pada penelitian ini, maka rimpang bangle hantu segar berpotensi untuk dijadikan obat karena kadar abu ini kurang dari batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang digunakan sebagai obat.
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi untuk menarik senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Kelebihan metode maserasi adalah peralatan sederhana, mudah dilakukan, dan tidak menggunakan pemanasan sehingga senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap panas dapat terekstrak. Kekurangan metode maserasi adalah waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi cukup lama. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini tiga macam, yaitu etanol, etil asetat, dan n-heksana yang mempunyai kepolaran berbeda dan dilakukan beberapa pengulangan secara berurutan. Pertama, ekstraksi menggunakan heksana untuk
menghilangkan komponen lemak yang mungkin akan mengganggu proses penanganan ekstrak selanjutnya, ekstrak n-heksana yang diperoleh disebut ekstrak nonpolar. Residu hasil dari ekstraksi n-heksana direndam dalam pelarut etil asetat untuk mengekstraksi senyawa yang lebih polar dari ekstrak n-heksana, dan didapatkan ekstrak etil asetat. Selanjutnya maserasi residu hasil dari ekstraksi etil asetat menggunakan pelarut etanol untuk mengekstraksi senyawa polar dan didapatkan ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan untuk menghilangkan pelarutnya dan mengetahui persen rendemen dengan rotary evaporator pada suhu 40 ˚C. Rendemen yang diperoleh adalah 1.32% untuk ekstrak n-heksana, 1.01% ekstrak etil asetat, dan 3.22% ekstrak etanol. Ekstrak kental yang dihasilkan dari masing-masing pelarut kemudian di uji fitokimia dan uji inhibisi enzim dengan menggunakan enzim lipase pankreas manusia.
Isolasi Minyak Atsiri Bangle Hantu
Isolasi minyak atsiri dari rimpang bangle hantu segar dilakukan dengan metode destilasi air menggunakan akuades sebagai pelarut. Proses destilasi dilakukan pada suhu 100-105 ˚C karena pada kisaran suhu tersebut air sebagai pelarut rimpang bangle hantu yang didestilasi mendidih, selanjutnya air menguap membawa minyak atsiri yang bersifat volatil. Setelah melewati kondensor, uap minyak atsiri akan mengalami kondensasi kembali menjadi cairan dan ditampung di alat penampung dan dipisahkan dari air.
Gambar 5 Destilat kasar minyak atsiri dan kristal minyak atsiri rimpang segar bangle hantu (Zingiber ottensii Va).
Bobot minyak atsiri bangle hantu adalah 0.897 g/mL sedangkan bobot air adalah 1 g/mL, dengan demikian minyak atsiri bangle hantu terdapat pada lapisan atas sedangkan air sebagai pelarutnya ada dilapisan bawah. Destilat kasar minyak atsiri bangle hantu yang dihasilkan tidak berwarna dan kristal yang diperoleh berwarna putih ditunjukkan pada Gambar 5. Rendemen destilat kasar minyak atsiri rimpang bangle hantu segar adalah 0.36% berdasarkan bobot basah, sedangkan rendemen kristal adalah 0.002%.
Uji Fitokimia
Ekstrak yang diperoleh selanjutnya diuji fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak. Hasil uji fitokimia ditunjukkan pada Tabel 1. Golongan senyawa dalam ekstrak kasar dapat ditentukan dengan melihat perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat lebih banyak mengandung senyawa metabolit sekunder daripada ekstrak n-heksan dan etanol, ini disebabkan etil asetat yang bersifat semi polar sehingga dapat mengekstrak senyawa nonpolar dan senyawa polar yang kepolarannya rendah.
Tabel 1 Hasil uji fitokimia bangle hantu kering, minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu (Zingiber ottensii Va)
Golongan senyawa Ekstrak Bangle hantu Kering Minyak Atsiri n-heksana etil asetat etanol
Saponin - + ++ + - Flavonoid - +++ ++ ++ - Alkaloid - - - - - Tanin - +++ ++ + - Kuinon - + ++ + - Steroid - ++ - - - Terpenoid +++ - - + +++
Keterangan: (+) hasil uji positif, sedikit. (++) hasil uji positif, sedang. (+++) hasil uji positif, banyak. (-) hasil uji negatif.
Senyawa terpenoid terdeteksi hanya pada ekstrak n-heksana dan minyak atsiri, karena terpenoid merupakan senyawa yang bersifat nonpolar dan volatil sehingga tidak terekstrak dalam etil asetat dan etanol. Senyawa alkaloid menunjukkan hasil yang negatif pada semua ekstrak, hal ini berbeda dengan hasil Pradono (2005) pada ekstrak segar bangle (Zingiber cassumunar). Hasil yang berbeda ini disebabkan perbedaan sumber sampel yang digunakan, dalam penelitian ini sampel yang digunakan adalah bangle hantu (Zingiber ottensii Va). Ekstrak etanol mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan kuinon, sedangkan pada ekstrak etil asetat mengandung flavonoid, saponin, tanin, kuinon, dan steroid. Pendugaan sementara golongan senyawa yang berperan dalam menghambat aktivitas lipase pankreas dapat dilihat berdasarkan hasil uji fitokimia.
Uji In Vitro Ekstrak Sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas
Berdasarkan hasil dari daya inhibisi ekstrak kasar bangle hantu, minyak atsiri bangle hantu, dan kristal minyak atsiri diketahui memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas. Tiap ekstrak memiliki IC50 berbeda dan ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Daya inhibisi ekstrak kasar dan minyak atsiri bangle hantu terhadap aktivitas lipase pankreas
Sampel IC50 (µg/mL)
Ekstrak etanol >1000
Ekstrak etil asetat 72.35
Ekstrak n-heksana 27.49
Destilat kasar minyak atsiri 0.67
Kristal minyak atsiri 10.76
Xenical (Orlistat) 746.68
Destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu ditentukan daya inhibisinya dengan cara melarutkan destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri, dan ekstrak kasar bangle hantu dalam buffer fosfat
dengan tujuan untuk mempertahankan pH lipase pankreas supaya tetap ber-pH 8 sehingga hidrolisis tetap dalam keadaan optimum. Enzim lipase bekerja dengan cara mempercepat hidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Reaksi hidrolisis lipase pankreas dihentikan dengan penambahan kloroform. Penambahan kloroform-heptana (1:1) berfungsi untuk mengekstraksi asam oleat yang terbentuk sebagai hasil hidrolisis minyak wijen, sedangkan yang berfungsi mengikat asam oleat bebas adalah pereaksi tembaga yang selanjutnya akan dikompleks dengan penambahan natrium dietilditiokarbamat membentuk warna kuning dengan lapisan kloroform-heptana yang mengandung asam oleat. Daya inhibisi enzim lipase pakreas terhadap destilat kasar minyak atsiri, kristal minyak atsiri dan ekstrak kasar bangle hantu ditunjukkan pada Lampiran 9.
Kontrol positif yang digunakan adalah Xenical® yang merupakan produk pelangsing komersial yang banyak digunakan masyarakat. Xenical mengandung bahan aktif orlistat yang digunakan untuk mengobati orang yang mengalami obesitas. Obat ini bekerja dengan mengabsorbsi lemak makanan dalam tubuh dan menekan nafsu makan (Genentech 2010). Larutan blangko (tanpa penambahan ekstrak) digunakan sebagai kontrol negatif. Uji inhibisi enzim ini menggunakan lima ragam konsentrasi untuk semua ekstrak yaitu: 62.5 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, dan 1000 µg/mL. Ragam konsentrasi ini dimaksudkan untuk melihat hubungan penambahan konsentrasi ekstrak terhadap daya inhibisi enzim lipase pankreas manusia.
Xenical yang mengandung orlistat sebagai kontrol positif memiliki IC50 746.68 µg/mL, hasil tersebut tidak berbeda jauh dengan yang dihasilkan oleh Shin et al. (2003) yaitu 800 µg/mL. Xenical memiliki daya hambat yang lebih kecil dari ekstrak etil asetat, ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri karena Xenical merupakan obat antiobesitas yang mengandung orlistat tidak murni sehingga memiliki daya hambat lebih kecil. Ekstrak etanol memiliki IC50>1000 µg/mL dimana lebih tinggi dari kontrol positif, ini diakibatkan oleh senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol berdasarkan uji fitokimia tidak mengandung steroid dan terpenoid. Berdasarkan penelitian sebelumnya, steroid dan terpenoid merupakan inhibitor lipase yang baik. Ekstrak etil asetat, n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri
memiliki IC50 lebih rendah dari Xenical, diduga senyawa aktif pada Xenical memiliki daya hambat yang lebih rendah dari senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak etil asetat, ekstrak n-heksana, destilat kasar minyak atsiri, dan kristal minyak atsiri. Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa daya hambat enzim lipase semakin tinggi pada senyawa yang bersifat nonpolar, diduga senyawa aktif sebagai penghambat enzim lipase adalah senyawa yang bersifat nonpolar.
Senyawa-senyawa yang diperkirakan dapat menghambat aktivitas lipase pankreas adalah flavonoid, saponin, steroid, tanin, dan triterpenoid. Ekstrak saponin kasar ginseng merah Korea dapat mengurangi bobot badan tikus pada konsentrasi 200 µg/mL (Kim & Kang 2009). Fraksi saponin dari ekstrak air daun Oolong tea menginhibisi lipase pancreas pada konsentrasi 500-2000 µg/mL (Han et al. 1999). Chikusetsusaponin juga dapat menghambat aktivitas lipase pada konsentrasi 125-500 µg/mL baik secara in vitro maupun in vivo pada rimpang Panax japonicas (Han et al. 2005). Xu et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa triterpenoidal saponin pada Platycodi radix diketahui dapat menghambat aktivitas lipase pankreas. Gordon et al. (2009) menyatakan senyawa aktif tanin pada buah jenis berry juga berpotensi sebagai antiobesitas dengan menghambat aktivitas lipase. Selain itu, senyawa tanin pada ekstrak tanin rimpang bangle (Z. cassumunar) juga memiliki potensi dalam menghambat aktivitas lipase (Iswantini et al. 2003). Senyawa 3-metiletergalangin yang diisolasi dari fraksi etil asetat Alpinia officinarum secara in vitro dapat menghambat aktivitas lipase pankreas dan in vivo mampu menurunkan kadar kolesterol tikus jantan (Shin et al. 2003).
Penentuan Eluen Terbaik dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Eluen terbaik adalah eluen yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan terpisah. Menurut Shin et al. (2003), fraksi etil asetat Alpinia officinarum memperlihatkan daya hambat (IC50 3000 µg/mL) lebih tinggi dibandingkan ekstrak air (IC50 9600 µg/mL), fraksi eter (IC50 9200 µg/mL), dan fraksi butanol (IC50>10000 µg/mL) menggunakan substrat triolein. Ekstrak etil asetat dianalisis dengan KLT G60F254 dari Merck dengan menggunakan pelarut kloroform:metanol (10:1-2:1) dan diperoleh 5 spot (Shin et al. 2003). Oleh karena itu, sampel yang digunakan untuk fraksinasi kromatografi kolom dalam penelitian ini digunakan
ekstrak etil asetat, selain memiliki IC50 72.36 µg/mL yang lebih rendah dari ekstrak etanol yaitu IC50>1000 µg/mL, ekstrak etil asetat mengandung senyawa saponin dan steroid yang diduga berpotensi sebagai inhibitor lipase yang baik pada konsentrasi tinggi maupun rendah (Iswantini 2003).
Berdasarkan hasil KLT menggunakan pelarut kloroform-metanol (K:M) (10:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, dan 4:6,) serta eluen tunggal kloroform (K) dan metanol (M) diperoleh jumlah spot terbanyak dan terpisah yakni 5 spot pada