Karakteristik Limbah Agar-agar
Limbah agar-agar kertas digunakan sebagai sumber karbon untuk memproduksi enzim selulase. Limbah hasil pengolahan ini terlebih dahulu dikeringkan kemudian dihaluskan menggunakan hammer mill dan disk mill,
selanjutnya diayak dengan menggunakan ayakan 100 mesh. Pengecilan ukuran partikel limbah ini diharapkan untuk memperluas permukaan sehingga mempermudah kapang dalam memanfaatkan limbah ini sebagai sumber karbon dalam menghasilkan enzim. Hasil analisis komposisi kimia limbah agar-agar kertas setelah dikeringkan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kimia limbah agar-agar kertas Komposisi Limbah agar-agar (% bk) Selulosa Hemiselulosa Lignin Abu Air 30,18 13,78 5,76 28,19 9,91
Hasil analisis kimia limbah agar-agar kertas menunjukkan bahwa kandungan selulosa limbah tinggi dan lignin yang rendah sehingga limbah agar-agar ini berpotensi sebagai substrat yang digunakan mikroorganisme untuk menghasilkan enzim selulase. Limbah agar-agar merupakan biomassa yang tidak hanya mengandung selulosa murni tetapi juga mengandung hemiselulosa dan lignin membentuk lignoselulosa. Menurut Rahmadani et al. (2013), Limbah cenderung berupa selulosa amorf, umumnya selulase lebih mudah menghidrolisis bagian amorf selulosa dibandingkan bagian kristalin.
Perbedaan sumber karbon yang digunakan sebagai induser penghasil selulase akan mempengaruhi aktivitas enzim selulase yang dihasilkan, hal ini dipengaruhi persentase komposisi penyusun sumber karbon. Lignin yang terdapat pada biomassa berpengaruh terhadap pelepasan dan hidrolisis polisakarida. Lignin yang melindungi selulosa tersusun atas makromolekul fenolik. Makromolekul tersebut dihubungkan oleh ikatan arilalkil dan eter yang bersifat tahan terhadap hidrolisis (Sethi et al. 2013). Lignin dapat menghalangi terjadinya interaksi enzim dengan selulosa sehingga akan perpengaruh terhadap glukosa yang dihasilkan.
10
Pertumbuhan Isolat Kapang EN
Kapang mempunyai masa pertumbuhan yang bervariasi dengan beberapa fase pertumbuhan sesuai aktivitas metabolismenya. Aktivitas metabolisme akan menurun setelah kapang melewati fase puncak pertumbuhannya. Kurva pertumbuhan kapang diperoleh dengan mengukur biomassa kering kapang dalam waktu tertentu pada media PDB. Fase-fase pertumbuhan tersebut sangat berpengaruh terhadap enzim yang dihasilkan oleh kapang. Enzim yang dihasilkan berfungsi untuk membantu dalam menguraikan makanan menjadi lebih sederhana yang kemudian dimanfaatkan untuk pertumbuhan dan perbanyakan sel pada fase eksponensial. Iqbal et al. (2011) menyatakan bahwa enzim selulase yang dihasilkan oleh kapang filamentous digunakan untuk melakukan aktivitas selulolitik yang diperlukan untuk pertumbuhan. Kurva pertumbuhan isolat kapang EN dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Kurva pertumbuhan isolat kapang EN pada media PDB
Berdasarkan Gambar 3 dapat dilihat bahwa fase lag kapang terjadi hingga hari ke-3. Kapang memproduksi enzim yang berfungsi untuk mendegradasi substrat yang ada di lingkungannya pada fase lag. Fase eksponensial merupakan fase percepatan pertumbuhan. Fase eksponensial kapang EN terjadi pada hari ke-3 hingga hari ke-12. Pemanenan enzim dapat dilakukan pada fase eksponensial pada pola kurva pertumbuhannya (Gandjar et al. 2006). Fase stasioner terjadi mulai pada hari ke-12. Pada fase stasioner, jumlah sel yang hidup sama dengan jumlah sel yang mati, pada fase ini pula metabolit sekunder diproduksi. Berdasarkan kurva pertumbuhan tersebut diduga waktu yang tepat untuk mengekstrak enzim selulase terjadi pada fase eksponensial yaitu hari ke-3 hingga hari ke-12.
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Bhat dan Maheshwari (1987) menyatakan bahwa fase eksponensial kapang Trichoderma reesei terjadi mulai hari ke-2 hingga hari ke-4. Fase stasioner terjadi mulai pada hari ke-4. Sporotrichum thermophile tidak mengalami fase lag dan fase stasioner terjadi pada hari ke-2.
Trichoderma reesei dan Sporotrichum thermophile memiliki fase pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan dengan isolat kapang EN. Hal ini disebabkan oleh sumber karbon yang digunakan lebih sederhana yaitu glukosa.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 B er a t k er ing m is ellia ( g ) Hari
11
Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Produksi Enzim Selulase
Penentuan konsentrasi limbah agar-agar dan waktu inkubasi dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan waktu inkubasi yang tepat untuk menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas tertinggi. Aktivitas selulase ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim penyusun selulase yaitu endoglukanase, β-glukosidase, dan selulase total. Da silva et al. (2005) menyatakan bahwa sistem pemecahan selulosa menjadi glukosa terdiri dari tiga jenis enzim penyusun selulase yaitu endo-β-1,4-glukanase, ekso-β-1,4-glukanase, dan β-glukosidase. Pengaruh konsentrasi limbah agar-agar kertas dan lama waktu inkubasi terhadap aktivitas endoglukanase, β-glukosidase dan selulase total yang dihasilkan dari kapang isolat EN dapat dilihat pada Gambar 4, 5, dan 6. Aktivitas enzim endoglukanase mewakili aktivitas pemecahan ikatan glikosidik secara acak terhadap selulosa. Enzim β-glukosidase menunjukkan aktivitas pemecahan yang menghasilkan glukosa sedangkan selulase total diukur untuk melihat kerja sinergis beberapa enzim penyusun selulase dalam menghasilkan glukosa (Deswal et al. 2011).
Gambar 4 Aktivitas endoglukanase pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%; ─▲─ 1,5%; ─x─ 2,0%)
Aktivitas endoglukanase diuji menggunakan substrat CMC. Enzim endoglukanase merupakan komponen enzim penyusun selulase yang pertama kali bekerja untuk memecah selulosa rantai panjang. Menurut Jahangeer et al. (2005), enzim endoglukanase aktif bekerja pada daerah amorf selulosa dan menghasilkan selooligosakarida. Aktivitas endoglukanase akan meningkat dengan semakin panjangnya rantai selulosa yang akan dihidrolisis. Gambar 4 memperlihatkan aktivitas tertinggi enzim endoglukanase yaitu 0,031 U/mL terjadi pada penambahan limbah agar-agar 1,5% dengan lama waktu inkubasi sembilan hari. Aktivitas endoglukanase terus meningkat seiring semakin lamanya waktu inkubasi, namun aktivitas menurun setelah diinkubasi melebihi waktu optimumnya. Penurunan aktivitas endoglukanase pada hari ke-12 diduga rantai panjang selulosa limbah agar-agar telah terpotong menjadi rantai selulosa yang lebih pendek dengan derajat
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0 3 6 9 12 15 18 21 24 A kti vi tas (U /m L ) Hari
ke-12
polimerisasi yang lebih rendah sedangkan enzim endoglukanase hanya aktif bekerja pada selulase rantai panjang dengan derajat polimerisasi tinggi.
Gambar 5 Aktivitas β-glukosidase pada beberapa konsentrasi limbah agar agar kertas terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%;
─▲─ 1,5%; ─x─ 2,0%)
Gambar 6 Aktivitas selulase total pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar kertas terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%;
─▲─ 1,5%; ─x─ 2,0%)
Aktivitas β-glukosidase diuji dengan menggunakan substrat p-NPG. Enzim
β-glukosidase akan bekerja optimum setelah enzim-enzim penyusun selulase lainnya bekerja dan menghasilkan komponen selulosa yang sederhana misalnya selobiosa. Lee et al. (2008) menyatakan bahwa β-glukosidase hanya akan bekerja memecah selobiosa untuk menghasilkan glukosa. Gambar 5 memperlihatkan bahwa aktivitas enzim β-glukosidase tertinggi (0,0036 U/mL) terdapat pada penambahan limbah agar-agar 1,5% dengan lama waktu inkubasi lima belas hari. Aktivitas β -glukosidase tertinggi terjadi pada inkubasi selama 15 hari diduga selobiosa yang dihasilkan oleh enzim penyusun selulase lainnya telah terakumulasi sehingga enzim
β-glukosidase bekerja lebih aktif pada hari ke-15. Oleh sebab itulah pada inkubasi sebelum 15 hari aktivitas β-glukosidase rendah.
0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0 3 6 9 12 15 18 21 24 A kti vi tas (U /m L ) Hari-ke 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0 3 6 9 12 15 18 21 24 A kti vi tas (U /m L ) Hari
ke-13
Pengukuran aktivitas selulase total dilakukan untuk mengukur aktivitas campuran beberapa enzim penyusun selulase dalam menghidrolisis bahan yang mengandung selulosa dan menghasilkan glukosa sebagai produk akhir. Penentuan aktivitas enzim selulase total dilakukan dengan menggunakan kertas saring Whatman no 1 sebagai substrat dalam pengujiannya. Aktivitas selulase total menggambarkan pengaruh sinergis enzim endoglukanase, eksoglukanase, dan
β-glukosidase. Gambar 6 memperlihatkan aktivitas enzim selulase tertinggi yaitu 0,013 U/mL terdapat pada penambahan limbah agar-agar 1,5% dengan lama inkubasi sembilan hari. Aktivitas mengalami kenaikan hingga hari ke-9 dan mengalami penurunan setelah inkubasi melebihi hari ke-9. Aktivitas selulase total yang dihasilkan masih rendah dikarenakan substrat yang digunakan merupakan selulosa tidak larut sehingga diperlukan waktu reaksi yang lebih lama agar enzim dapat berdifusi ke dalam serat selulosa. Aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh beberapa jenis kapang disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Perbandingan selulase isolat kapang EN dengan kapang jenis lainnya Enzim Kapang Aktivitas
(U/mL) Sumber karbon Referensi Endoglukanase β-glukosidase Selulase total Penicillium occitanis Aspergillus heteromorphus Trichoderma resesei Aspergillus niger Isolat kapang EN Penicillium occitanis Penicillium janthinellum Isolat kapang EN
Trichoderma resesei RUT C30
Aspergillus heteromorphus Aspergillus niger Helminthosporium sp. Cladosporium sp. Isolat kapang EN 23 83 2,63 11,3 0,031 21 2,3 0,0036 2,27 3,2 12,4 42,61 40,36 0,013 Pulp kertas Jerami gandum Sekam gandum Kulit pisang Limbah agar Pulp kertas Bagas tebu Limbah agar Karton Jerami gandum Kulit pisang Jerami padi Jerami padi Limbah agar Belghith et al. (2001) Singh et al. (2009) Maurya et al. (2012) Jadhav et al. (2013) Belghith et al. (2001) Adsul et al (2004) Szijarto et al. (2004) Singh et al. (2009) Jadhav et al. (2013) Sivaramanan (2014) Sivaramanan (2014)
Aktivitas endoglukanase, β-glukosidase, dan selulase total yang dihasilkan oleh isolat kapang EN masih sangat rendah dibandingkan dengan aktivitas enzim yang dihasilkan oleh kapang jenis lain (Tabel 2). Beberapa perlakuan dapat digunakan untuk meningkatkan aktivitas selulase kapang EN. Peningkatan aktivitas selulase yang telah dilakukan pada beberapa mikroorganisme antara lain: mengoptimasi sumber nutrisi kapang berupa sumber karbon dan sumber nitrogen dalam memproduksi selulase Fomitopsis sp. (Deswal et al. 2011) dan Bacillus amyoliquefaciens DL-3 (Lee et al. 2008), optimasi produksi selulase Marinobacter
sp. MSI032 dengan mengoptimasi perbedaan suhu, pH, dan pemberian ion logam yang mempengaruhi aktivitas selulase (Shanmughapriya et al. 2010), mutasi
Trichoderma sp dengan mensuspensikan spora ke dalam larutan mutagen ethidium bromide (EtBr) dan ethyl methane sulfonate (EMS)(Mursyid et al. 2007).
Limbah agar-agar dalam produksi enzim selulase berfungsi sebagai sumber karbon yang berguna untuk merangsang mikroorganisme untuk mengekskresikan enzim selulase ke lingkungan. Penambahan konsentrasi limbah agar-agar di bawah 1,5% menyebabkan terbatasnya sumber karbon sehingga pertumbuhan tidak optimal dan aktivitas enzim rendah. Penambahan konsentrasi limbah di atas 1,5%
14
menyebabkan penurunan aktivitas selulase. Hal ini disebabkan meningkatnya konsentrasi limbah agar-agar yang ditambahkan akan menimbulkan masalah sirkulasi oksigen sehingga pertumbuhan kapang terganggu. Menurut Saropah et al. (2012), semakin banyak sumber karbon dalam media pertumbuhan maka selulase yang dihasilkan semakin meningkat, akan tetapi sumber karbon yang berlebihan dapat menghambat pertumbuhan sel karena akan mengurangi jumlah oksigen dalam media sehingga menurunkan produksi selulase.
Karakteristik Ekstrak Kasar Enzim Selulase
Karakterisasi enzim selulase dilakukan pada ekstrak kasar enzim selulase. Karakterisasi ini meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, pengaruh ion logam dan pengaruh konsentrasi substrat. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas enzim selulase total menggunakan substrat kertas saring Whatman no 1,
endoglukanase menggunakan substrat CMC, dan β-glukosidase menggunakan substrat p-NPG terlihat bahwa aktivitas tertinggi yaitu endoglukanase sehingga untuk karakterisasi ekstrak kasar enzim selulase ini menggunakan CMC sebagai substrat.
Nilai pH Optimum Enzim Endoglukanase
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH, maka dari itu diperlukan bufer dengan pH tertentu supaya enzim dapat bekerja optimum. Enzim merupakan molekul amfoter yang mengandung sejumlah besar kelompok asam dan basa terutama terdapat pada permukaan. Muatan-muatan pada kelompok-kelompok tersebut akan berubah berdasarkan konstanta disosiasi asam terhadap pH lingkungannya. Perubahan-perubahan yang terjadi pada muatan-muatan oleh pH dapat berpengaruh terhadap aktivitas, stabilitas struktural dan daya kelarutan enzim (Chaplin dan Bukle 1990). Penentuan pH optimum dilakukan dengan penambahan bufer pada rentang pH 3-9. Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa pH disajikan pada Gambar 7.
Gambar 7 Pengaruh pH terhadap aktivitas endoglukanase
Berdasarkan Gambar 7 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas pada pH 4 dan pH tersebut merupakan pH optimum aktivitas ekstrak kasar endoglukanase dengan aktivitas 0,042 U/mL. Aktivitas ekstrak kasar endoglukanase mengalami penurunan pada pH 5 dan menurun drastis hingga pH 9.
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0 2 4 6 8 10 Ak tiv it a s (U/m L ) pH
15
Harshvardhan et al. (2013) menyatakan bahwa enzim selulase yang diuji menggunakan substrat CMC aktif pada kisaran pH 3-9. Hasil penelitian Thongekkaew et al. (2008) menunjukkan pH optimum endoglukanase Pichia pastoris yaitu 3,5. Menurut Yuan et al. (2012), endoglukanase yang dihasilkan oleh
Fusarium oxysporum sangat reaktif pada pH 4,5-5,5. Menurut Rastogi et al. (2010) enzim yang mampu bertahan pada kondisi asam digolongkan ke dalam enzim asidofil.
Suhu Optimum Enzim Endoglukanase
Suhu merupakan faktor yang mempengaruhi laju katalisis reaksi enzimatis. Kenaikan suhu hingga batas tertentu dapat meningkatkan aktivitas enzimatis sampai pada kondisi suhu optimum, namun kenaikan suhu yang berlebih dapat menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Penentuan suhu optimum dilakukan pada suhu 30-80 oC. Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa suhu disajikan pada Gambar 8.
Gambar 8 Pengaruh suhu terhadap aktivitas endoglukanase
Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa suhu memperlihatkan aktivitas endoglukanase meningkat seiring dengan peningkatan suhu hingga suhu optimum terjadi pada suhu 60 oC dengan aktivitas 0,042 U/mL. Penurunan aktivitas terjadi dimulai pada suhu 70 oC. Hasil penelitian Yuan et al.
(2012) menunjukkan bahwa suhu optimum endoglukanase yang dihasilkan dari
Fusarium oxysporum yaitu 60 oC. Adekele et al. (2012) menyatakan bahwa aktivitas optimum enzim endoglukanase Bacillus coagulans Co4 terjadi pada suhu 60 oC. Kenaikan suhu melebihi suhu optimum dapat mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim.
Panas yang ditimbulkan akibat kenaikan suhu dapat mempercepat reaksi dan meningkatkan kecepatan molekul karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi. Kenaikan suhu melebihi suhu optimum menyebabkan protein enzim dan substrat mengalami perubahan konformasi yang bersifat detrimental. Perubahan konformasi substrat mengakibatkan gugus reaktif mengalami hambatan dan tidak dapat lagi memasuki sisi aktif enzim (Suhartono 1989).
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0 20 40 60 80 100 Ak tiv v it a s (U/m L ) Suhu (oC)
16
Kinetika Enzim Endoglukanase
Mekanisme kerja enzim ditentukan oleh jumlah atau konsentrasi substrat yang tersedia. Hasil penelitian menyebutkan konsentrasi substrat yang memberikan aktivitas endoglukanase optimum adalah 1%. Penambahan konsentrasi di bawah 1% menunjukkan aktivitas enzim yang terus meningkat. Penambahan konsentrasi di atas 1% memperlihatkan aktivitas enzim tidak mengalami kenaikan (Gambar 9). Kanti (2003) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat yang rendah, kecepatan reaksi enzim meningkat secara tajam. Kecepatan reaksi enzim mulai menurun dan mencapai batas kecepatan maksimum ketika ditambahkan substrat dengan konsentrasi lebih besar dari nilai Km.
Gambar 9 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim endoglukanase
Gambar 10 Kurva Lineaweaver-Burk endoglukanase pada penentuan Km dan Vmaks Konstanta Michaelis (Km) dan kecepatan maksimum reaksi (Vmaks) merupakan dua parameter kinetika enzim. Kinetika enzim berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa nilai Km enzim selulase sebesar 0,244% dengan Vmaks 0,052 U/mL. Trivedi et al. (2011) menyatakan bahwa nilai Km enzim selulase Bacillus flexus yang diisolasi dari rumput laut sebesar 0,618%. Bacillus sp. dan Geobacillus sp. sebesar 0,108% dan 0,311% Rastogi et al. (2010). Menurut Saropah et al.(2012), nilai Km berfungsi sebagai ukuran konstanta disosiasi suatu enzim. Selulase bakteri selulolitik yang diisolasi dari bekatul memiliki nilai Km sebesar 1,694% dengan Vmaks 0,0086 U/mL.
Pengaruh Ion Logam
Beberapa ion logam ditambahkan pada reaksi uji aktivitas selulase isolat EN untuk mengetahui pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase. Ion logam dapat
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 Ak tiv it a s (U/m L ) Konsentrasi Substrat (%) y = 4,665x + 19,08 R² = 0,984 0 10 20 30 0 1 2 3 1 /V [1/S]
17
meningkatkan atau menurunkan aktivitas setelah berinteraksi dengan enzim. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim endoglukanase Konsentrasi ion logam yang digunakan yaitu 5 mM. Aktivitas relatif enzim endoglukanase tanpa penambahan ion logam yaitu 100%. Ion logam Na+, Mn2+, dan K+ sedikit meningkatkan aktivitas relatif menjadi 105,22%, 102,61%, dan 123,48%. Ion logam Ca2+, Co2+, dan Zn2+ sedikit menurunkan aktivitas relatif menjadi 83,48%, 64,35%, dan 93,31%. Penurunan aktivitas relatif enzim hingga 74% terjadi pada penambahan ion logam Hg2+ dengan aktivitas relatif yang tersisa 26%.
Hasil penelitian Yin et al. (2010) menunjukkan bahwa ion Na+, K+, dan Mn2+ pada konsentrasi 5 mM menghasilkan aktivitas relatif lebih tinggi dibandingkan kontrol.Penelitian yang dilakukan oleh Smriti dan Sanwal (1999) menyatakan ion Hg2+ merupakan penghambat yang kuat terhadap aktivitas enzim selulase yang diuji menggunakan substrat CMC. Menurut Lee et al. (2008), yaitu aktivitas relatif endoglukanase yang tersisa setelah penambahan ion Hg2+ sebesar 23,7%. Yin et al. (2010) menyatakan penurunan aktivitas endoglukanase akibat penambahan ion logam Hg2+ memperlihatkan bahwa sisi aktif enzim selulase memiliki gugus SH. Menurut Lee et al. (2008), inhibisi oleh ion Hg2+ bukan hanya disebabkan berikatan dengan gugus thiol tetapi juga akibat adanya interaksi dengan residu triptofan atau gugus karboksil pada asam amino enzim.
Pemurnian Enzim Endoglukanase Presipitat Enzim Endoglukanase
Enzim kasar hasil optimasi dengan aktivitas tertinggi selanjutnya dipresipitasi dengan menambahkan aseton. Presipitasi merupakan penambahan senyawa yang hanya menggumpalkan protein dan tidak menggumpalkan bahan lain sehingga dengan sendirinya akan memisahkan dan lebih memurnikan enzim yang dihasilkan (Suhartono 1989). Presipitasi dapat dilakukan dengan penambahan garam misalnya amonium sulfat, polimer misalnya polyethylene glycol (PEG), atau pelarut organik misalnya aseton atau alkohol (Scopes 1994).
0 20 40 60 80 100 120 140 Ak tiv it a s re la tif ( %) Ion logam
18
Presipitan yang digunakan pada penelitian ini yaitu pelarut organik aseton. Pemakaian aseton terbukti dapat mempertahankan stabilitas enzim, enzim yang diendapkan dengan pelarut organik biasanya relatif lebih murni (Suhartono 1989). Penambahan aseton ke suatu ekstrak yang berisi protein dapat menimbulkan presipitasi protein. Penambahan pelarut organik menurunkan konstanta dielektrik larutan sehingga kelarutan protein menurun (Harris 1989). Menurut Adeleke et al. (2012), presipitasi dengan penambahan aseton dapat menghasilkan aktivitas enzim yang lebih baik dibandingkan dengan penambahan amonium sulfat. Pengaruh kejenuhan aseton terhadap aktivitas enzim pada pelet setelah mengalami pengendapan disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Pengaruh kejenuhan aseton terhadap aktivitas endoglukanase Berdasarkan Gambar 12 dapat dilihat bahwa aktivitas spesifik tertinggi enzim selulase terdapat pada pengendapan aseton dengan konsentrasi 10% dengan aktivitas spesifik 0,372 U/mg. Adeleke et al. (2012) menyatakan bahwa selulase
Bacillus coagulans Co4 yang diisolasi dari kulit cokelat setelah dipresipitasi dengan 80% kejenuhan aseton memiliki aktivitas spesifik 0,29 U/mg protein. Aktivitas spesifik diperoleh dengan membandingkan aktivitas enzim terhadap konsentrasi protein. Aktivitas enzim endoglukanase pengendapan 10% sebesar 0,0252 U/mL dengan konsentrasi protein 0,065 mg/mL.
Menurunnya aktivitas endoglukanase seiring peningkatan konsentrasi aseton yang ditambahkan diduga protein enzim selulase mengalami denaturasi akibat terlalu banyaknya aseton yang ditambahkan. Pelarut organik biasanya mengikat pada sisi yang spesifik dari molekul protein dan merusak interaksi hidrofobik. Penggunaan pelarut organik dalam jumlah sedikit dan suhu yang rendah dapat mengurangi denaturasi protein (Harris 1989).
Enzim Endoglukanase Murni
Pemurnian dilakukan untuk mendapatkan enzim yang lebih murni dengan aktivitas lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak kasar. Hasil presipitasi enzim dapat dimurnikan menggunakan kromatografi kolom. Pada penelitian ini enzim selulase yang telah diendapkan, dimurnikan menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel dengan matriks Sephadex G-100.
Prinsip filtrasi gel menggunakan kromatografi dengan menggunakan bahan pengisi yang merupakan gel yang berpori-pori. Pori-pori pada permukaan gel ini
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0 10 20 30 40 50 60 70 80 A kti vi tas Sp es if ik (U /m g)
19
cukup kecil sehingga mencegah molekul besar untuk masuk ke dalamnya, tetapi dapat menampung molekul-molekul yang lebih kecil. Filtrasi gel digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul tinggi dari protein atau molekul lain dengan berat molekul rendah. Salah satu bahan yang penting sebagai gel adalah dekstran yang telah mengalami cross-linkage dengan bantuan epikhlorhidin. Hasil yang didapat dekstran tidak larut dalam air namun masih memiliki kemampuan menyerap molekul air di dalam molekulnya sendiri. Daya serap ini bergantung pada jumlah cross-linkage yang terjadi. Makin banyak ikatan silang yang terbentuk maka daya serapnya semakin kurang baik. Filtrasi gel merupakan teknik pemurnian yang kapasitasnya lemah namun metode ini efektif untuk pemisahan enzim dari pelarut penggumpal dan larutan garam yang tidak dikehendaki (Suhartono 1989).
Hasil fraksinasi enzim menggunakan filtrasi gel diperoleh 56 fraksi. Fraksi-fraksi yang diperoleh selanjutnya diuji aktivitas dan kadar protein untuk menentukan fraksi yang memiliki aktivitas tertinggi. Hasil pengujian aktivitas menunjukkan terdapat beberapa puncak dengan aktivitas tinggi yaitu fraksi 3, 7, 10, 16, dan 29 (Gambar 13). Hasil presipatasi dan fraksi-fraksi dengan aktivitas tinggi dihitung kelipatan pemurniannya untuk melihat tingkat kemurnian enzim pada setiap tahapan. Hasil presipitasi menggunakan aseton dengan kejenuhan 10% menghasilkan kelipatan pemurnian sebesar 1,093 kali. Hasil kelipatan pemurnian dari beberapa fraksi yang memiliki aktivitas tinggi diketahui bahwa fraksi 10 hasil filtrasi gel menghasilkan kelipatan pemurnian tertinggi yaitu 17,571 kali (Tabel 3).
Gambar 13 Fraksi-fraksi hasil pemurnian filtrasi gel (▲ aktivitas, ● konsentrasi protein)
Tabel 3 Kelipatan pemurnian enzim selulase
Tahapan Volume (mL) Aktivitas (U/mL)
Kadar Aktivitas Total Total Yield (%)
kelipatan pemurnian protein Spesifik Protein Aktivitas
(mg/mL) (U/mg) (mg) (U) Enzim kasar 800 0,036 0,156 0,233 124,800 29,120 100 1 Presipitasi 7 0,043 0,167 0,255 1,169 0,298 1,024 1,093 Filtrasi gel: Fraksi 3 4 0,009 0,076 0,113 0,305 0,034 0,118 0,483 Fraksi 7 4 0,010 0,136 0,076 0,546 0,041 0,142 0,325 Fraksi 10 4 0,004 0,001 4,100 0,004 0,016 0,056 17,571 Fraksi 16 4 0,003 0,010 0,329 0,041 0,013 0,046 1,409 -0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 -0.020 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 0.160 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 Ak tiv it a s (U/m L ) K o ns ent ra si P ro tein ( m g /m L ) Fraksi
ke-20
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memurnikan enzim selulase. Annamalai et al. (2011) menggunakan DEAE-Cellulose dilanjutkan dengan Sephadex G-75 untuk memurnikan selulase dari Bacillus licheniformis AU01. Kelipatan pemurnian menggunakan DEAE-Cellulose sebesar 5,53 kali, setelah dimurnikan menggunakan Sephadex G-75 kelipatan pemurnian mencapai 8,66 kali. Iqbal et al. (2011) menyatakan bahwa kelipatan pemurnian enzim selulase
Trichoderma viridae yang dimurnikan dengan Sephadex G-100 sebesar 2,33 kali. Tang et al. (2012) menggunakan Sephadex G-100, kelipatan pemurnian meningkat menjadi 34,96 kali. Murashima et al. (2002) memurnikan enzim endoglukanase
Rhizopus oryzae menggunakan macro-preMethl HIC diperoleh kelipatan pemurnian sebesar 5 kali. Pemurnian dilanjutkan menggunakan Superdex 200, kelipatan pemurnian menjadi 18,6 kali. Pemurnian dilanjutkan kembali menggunakan MonoS diperoleh kelipatan pemurnian sebesar 109 kali.
Berat Molekul Enzim dan Aktivitasnya
Berat molekul enzim ditentukan dengan elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu proses perpindahan partikel-partikel bermuatan suatu campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik (Suhartono 1989). Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sodium dodesil sulfat merupakan teknik elektroforesis gel untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya. Protein dengan berat