Hasil
Survei Polimorfisme dari Marka Molekuler SSR
Survei polimorfisme dari marka SSR dilakukan pada tanaman F1 dan tetuanya yaitu padi varietas IR64 dan Hawara Bunar menggunakan beberapa marka SSR yang terpetakan pada posisi antara marka RM489 - RM517 pada kromosom 3 padi dan di luar daerah QTL tersebut pada semua kromosom padi yaitu sejumlah 12 kromosom. Seleksi ini dilakukan untuk mendapatkan marka-marka yang polimorfisme sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan kerapatan marka molekuler pada posisi target, yaitu antara marka RM489 dan RM517 dan sebagai alat seleksi background pada populasi (Gambar 3).
16
RM19 RM252 M RM278 RM556
Gambar 3 Contoh hasil survei polimorfisme marka SSR berdasarkan analisis PCR pada tanaman tetua (HB: Hawara Bunar, IR: IR64) dan tanaman F1 turunannya menggunakan marka SSR: RM19, RM252, RM278, dan RM556. Sebagai standar digunakan DNA standard 100bp (M).
Berdasarkan hasil survei parental marka polimorfisme, maka telah dilakukan survey dan penapisan terhadap 17 marka SSR yang terpetakan pada posisi di antara 2 marka RM489 dan RM517. Hasil penapisan menggunakan teknik PCR dengan template DNA dari kedua tetua dan tanaman F1 hasil persilangan kedua tetua tersebut diperoleh empat marka SSR yang polimorfisme, yaitu RM2790, RM14535, RM14543, dan RM14552.
Untuk dapat melakukan seleksi foreground dan background pada populasi BC2F3 175-63, terlebih dahulu dilakukan seleksi 110 marka SSR yang akan digunakan untuk memperoleh marka-marka yang polimorfisme. Tingkat polimorfisme marka SSR pada padi IR64 dan Hawara Bunar tiap kromosom berbeda-beda dengan total tingkat polimorfisme yang cukup tinggi yaitu sebesar 50% (Lampiran 4).
Peningkatan Kerapatan Marka Molekuler dan Identifikasi QTL
Keempat marka SSR yang yang terpetakan pada posisi diantara 2 marka RM489 dan RM517 pada kromosom 3 padi yaitu marka RM2790, RM14535, RM14543, dan RM14552, digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari populasi F2 (Gambar 4).
Data skoring pita DNA dari keempat marka SSR tersebut bersama-sama dengan marka RM489, RM545, dan RM517, serta data karakter RRG dan PPA dari populasi F2 yang berjumlah 364 tanaman digunakan untuk analisis pemetaan daerah QTL menggunakan software MAPMAKER/QTL ver. 3.0 (Lander dan Botstein 1989). Hasil dari analisis QTL untuk karakter PPA disajikan pada Gambar 5.
IR HB F1
100 bp
17
59 61 63 66 68 72 75 77 96 101 103 105 109 111 114 117 M F1 HB IR 121 122 125 131A 134 140B 146 147A 150168 173174A 181 182 183 202
374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387A 388 389 M F HB IR 390 392 393 395 396 398 399 400 98 106 107 113 130 177 190 191
Gambar 4 Contoh elektroforesis hasil PCR marka SSR RM14543 (a) dan RM14552 (b) pada gel agarose SFR 3% dalam buffer TBE 1x pada populasi F2.
Gambar 5 Posisi QTL untuk karakater PPA sebagai parameter toleransi Al pada populasi F2 hasil persilangan tetua padi var. IR64 x var. Hawara Bunar.
Seleksi foreground Populasi BC2F1
Seleksi foreground populasi BC2F1 dilakukan dengan analisis PCR untuk amplifikasi DNA dari masing-masing individu BC2F1 menggunakan primer-primer polimorfisme yang telah didapatkan sebelumnya dari analisis QTL pada populasi F2, yaitu RM2790, RM14535, RM14543, dan RM14552. Di antara hasil analisis di atas ditampilkan pada Gambar 6. Hasil skoring pita DNA pada analisis tersebut disajikan pada Tabel 2. Untuk meningkatkan efisiensi seleksi, maka seleksi foreground diperluas dengan menganalisis kedua marka pengapit lokasi QTL, yaitu RM489 dan RM517. Hasil dari analisis tersebut disajikan pada Tabel 3.
Dari 5 tipe konstitusi alel BC2F1 tersebut di atas (Tabel 3), diambil masing-masing satu nomor, yaitu 159, 175, dan 180 untuk ditanam dan digunakan untuk membentuk populasi BC2F2. Pemilihan nomor 159, 175 dan 180 didasarkan pada pola genotipe HH dan AH untuk marka RM2790 dan RM14535. Diharapkan dari individu tersebut akan dihasilkan individu BC2F2 yang diinginkan.
a b LOD RM489 RM545 RM14543 RM517 RM2790 RM14535 RM14552 1.0 2.0 3.0 4.0
18
39 43 44 46 48 57 66 68 72 81 85 87 89 102 103 110 114 M F1 HB IR 117 118 120 124 125 132133134135 141A142A144146148149153 155
142 143 145 148 149 151 153 155 156 157 159 160 161 164 166 169 M F1 HB IR 171 174 175 178 180
142 143 145 148 149 151 153 155 156 157 159 160 161 164 166 169 M F1 HB IR 171 174 175 178 180
Gambar 6 Contoh elektroforesis hasil PCR marka SSR RM14535 (a), RM14543 (b), dan RM14552 (c) pada gel agarose SFR 3% dalam buffer TBE 1x pada populasi BC2F1. Nomor-nomor pada tiap lajur menunjukkan nomor-nomor individu tanaman.
Tabel 2 Pola genotipe individu rekombinan BC2F1 dengan seleksi empat marka
No RM2790 RM14535 RM14543 RM14552 No. BC2F1 ∑tanaman 1 H H H H 75, 76, 79, 101, 153, 156 6 2 A H A A 100, 103, 105, 136, 143, 178, 180 7 3 H H A A 151, 155, 159 3 4 A A H H 149, 157, 160, 169 4 5 A H H H 174, 175 2 Total 22
Keterangan: A= IR64, B= HB, H: Heterozigot
Tabel 3 Pola genotipe individu rekombinan BC2F1 dengan seleksi enam marka
No RM489 RM2790 RM14535 RM14543 RM14552 RM517 No. BC2F1 ∑ tanaman 1 A H H H H A - 0 2 A A H A A A 180 1 3 A H H A A A 151, 159 2 4 A A A H H A - 0 5 A A H H H A 174, 175 2 Total 5
Keterangan: A= IR64, B= HB, H: Heterozigot a
b
19
Seleksi foreground Populasi BC2F2
Pengujian daya berkecambah biji dari 3 nomor BC2F1 yang terpilih, yaitu BC2F1 159, 175, dan 180 menunjukkan daya berkecambah biji yang berbeda-beda. Daya berkecambah BC2F1 159, 175, dan 180 berturut-turut sebesar 5%, 64.2%, dan 97.5%. Kecilnya daya kecambah BC2F1 159, menjadi alasan diikutsertakan juga BC2F1 151 dalam pengujian daya perkecambahan. Daya berkecambah BC2F1 151 sama dengan BC2F1 159 yaitu 5%, sehingga hanya biji BC2F1 175 dan 180 yang dipilih untuk seleksi lebih lanjut karena mempunyai daya berkecambah yang baik.
Populasi BC2F2 175 dan 180 digunakan untuk analisis nilai PPA dan RRG (Tabel 4; Gambar 7a dan 7b) bersamaan dengan mempersiapkan penanaman di rumah kaca. Masing-masing tanaman BC2F2 kemudian diseleksi dengan marka foreground (Gambar 8).
Tabel 4 Nilai statistik sifat toleransi cekaman Al berdasarkan karakter PPA dan RRG pada populasi BC2F2
Karakter BC2F2 151 BC2F2 159 BC2F2 175 BC2F2 180
PPA RRG PPA RRG PPA RRG PPA RRG
Minimum 0.35 0.40 0.7 0.6 0.00 0.00 0.55 0.00 Maksimum 2.00 2.40 2.15 2.45 1.95 3.15 2.45 4.00 Rata-rata 0.98 1.76 1.57 1.41 1.11 1.83 1.59 2.09 Deviasi 0.57 0.78 0.77 0.68 0.53 0.97 0.55 0.90 Berdasarkan nilai RRG dan konfigurasi alel pada marka RM14535, RM14543, dan RM14552, pada populasi 175 terpilih nomor 63 dan 68, sedangkan pada populasi 180 terpilih nomor 14, 18, 26, 50, 51, 53, 59, 60, 62, 63, 64, 85, dan 97. Untuk menyeleksi individu dari galur BC2F2 175, dan 180 maka dilakukan analisis gabungan antara profil introgresi masing-masing individu tanaman dengan karakter RRG, seperti pada Tabel 5.
Kecilnya konsistensi antara karakter fenotipik RRG dengan karakter genotipik (hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka SSR) pada populasi BC2F2 180 (Tabel 5) memungkinkan adanya pergeseran QTL pada posisi di antara marka yang diapit RM489 dan RM517 sehingga untuk analisis lebih lanjut, dipilih individu BC2F2 175-63 untuk dikembangkan menjadi populasi BC2F3 karena mempunyai nilai RRG yang cukup tinggi dan mempunyai pola heterozigot pada marka RM14535, RM14543, dan RM14552, sehingga masih memungkinkan untuk mendapatkan individu yang membawa alel dari Hawara Bunar pada marka-marka tersebut. Selain itu, kecilnya konsistensi antara karakter fenotipik dengan karakter genotipik juga disebabkan toleransi cekaman Al pada padi merupakan sifat kuantitatif dengan kontribusi banyak gen/QTL (Kochian et al. 2004; Nguyen et al. 2001a, 2002, 2003; Wu et al. 2000) sehingga mekanisme toleransi terhadap cekaman Al pada padi merupakan kombinasi beberapa mekanisme.
20
Gambar 7 Distribusi nilai PPA dan RRG pada populasi BC2F2 175 (a) dan 180 (b). Posisi nilai PPA dan RRG dari IR64 dan Hawara Bunar (HB) pada populasi ditunjukkan oleh garis tegak.
21
---RM14535--- M F1 HB IR 43 45 50 51 53 59 60 62 63 64 85 97
---RM14543--- ---RM14552--- 55 57 60 61 63 65 66 67 68 70 71 72 73 75 76 55 57 60 61 63 65 66 67 68 70 71 72 73 75 76
Gambar 8 Contoh elektroforesis hasil PCR marka SSR : RM14535, RM14543 dan RM14552 pada gel agarose SFR 3% dalam buffer TBE 1x pada populasi BC2F2 175.
22
Tabel 5 Nomor individu terpilih BC2F2 beserta nilai RRG dan konfigurasinya
No. Individu BC2F2 RM14535 RM14543 RM14552 RRG 1 175-63 H H H 3.15 2 175-68 H A A 3.10 3 180-14 H A A 3.30 4 180-18 H A A 3.00 5 180-26 A A A 3.10 6 180-50 A A A 3.65 7 180-51 H A A 3.00 8 180-53 A A A 3.50 9 180-59 A A A 3.50 10 180-60 H A A 3.20 11 180-62 A A A 3.00 12 180-63 A A A 4.00 13 180-64 A A A 3.30 14 180-85 A A A 3.50 15 180-97 H A A 3.00
Keterangan: A= IR, B= HB, H: Heterozigot
Seleksi Foreground dan Background Populasi BC2F3
Total 130 individu tanaman pada populasi BC2F3 yang merupakan turunan dari tanaman BC2F2 nomor 175-63 digunakan untuk analisis karakter RRG, PPA, dan daya tumbuh akar samping serta tinggi tanaman vegetatif, jumlah anakan vegetatif, umur berbunga, rata-rata panjang malai, jumlah malai, umur panen, total biji isi, rata-rata biji isi per malai, total biji hampa, rata-rata biji hampa per malai, total bobot biji isi, dan rata-rata bobot biji isi per malai (Lampiran 5). Selain itu juga dilakukan isolasi DNA untuk digunakan sebagai template pada analisis foreground dan background.
Analisis foreground menggunakan marka RM2790, RM545, RM14535, RM14543, dan RM14552 yang terpetakan pada posisi target. Contoh hasil PCR dari marka RM14543 pada populasi BC2F3 yang diturunkan dari BC2F2 175-63 disajikan seperti pada Gambar 9. Disamping seleksi foreground, galur-galur BC2F3 terpilih juga dilakukan seleksi background. Seleksi ini dilakukan menggunakan 50 marka SSR polimorfisme yang terdapat di luar daerah QTL pada kromosom 1 sampai 12. Untuk efisiensi, sebelum melakukan seleksi background pada populasi BC2F3 175-63, terlebih dahulu dilakukan amplifikasi marka-marka background dengan DNA generasi sebelumnya yaitu individu BC2F2 175-63 seperti diperlihatkan pada Gambar 10 dan 11. Hasil amplifikasi tersebut menunjukkan 44 marka mengikuti alel homozigot tetua IR64, 4 marka yaitu RM5, RM218, RM421, dan RM7434 mengikuti alel homozigot tetua Hawara Bunar, dan 2 marka yaitu RM168 dan RM130 mengikuti alel kedua tetua (heterozigot). Kedua marka yang bersifat heterozigot, RM168 dan RM130, selanjutnya dilakukan seleksi background pada populasi BC2F3 175-63 (Gambar 12). Analisis foreground dan background ini digunakan untuk menentukan individu BC2F3 terpilih sebagai kandidat galur toleran terhadap cekaman Al dengan potensi produktivitas yang tinggi. Terpilih 2 nomor kandidat galur toleran terhadap cekaman Al dengan produktivitas yang tinggi yaitu BC2F3 175-63-34 dan -119.
23 Masing-masing mempunyai karakter yang berbeda. Kandidat individu toleran cekaman Al yang terpilih ini didasarkan pada nilai karakter RRG, PPA, dan karakter agronomi yang lain (Tabel 6).
Pembahasan Survei polimorfisme marka molekuler SSR
Hasil survei parental diperoleh 55 marka SSR yang bersifat polimorfisme dari total 113 marka yang digunakan yang berarti 48.7% marka bersifat polimorfisme. Diantara hasil PCR untuk tujuan survei parental ini seperti ditampilkan pada Gambar 3. Hasil pada Gambar 3 menunjukkan beberapa marka SSR yang bersifat monomorf dan polimorfisme. Marka yang bersifat polimorfisme seperti marka RM278 dan RM556 yang memiliki dua pita dengan ukuran pita yang sama antara kedua tetua Hawara Bunar (HB) dan IR64 (IR). Marka yang bersifat polimorfisme adalah marka RM19 dan RM252, terlihat adanya perbedaan ukuran pita DNA hasil amplifikasi PCR antara tetua Hawara Bunar (HB) dan IR64 (IR) dengan ukuran 200 bp. Polimorfisme ini terlihat juga pada sampel tanaman F1-nya, yaitu diperolehnya 2 pita DNA hasil amplifikasi. Dengan diperolehnya profil polimorfisme beberapa marka SSR pada tanaman tetua maka marka-marka tersebut dapat digunakan untuk membantu seleksi foreground dan background pada populasi silang balik selanjutnya yang diperoleh.
Peningkatan Kerapatan Marka Molekuler dan Identifikasi QTL
Menurut Akhmad (2009), Hariyanto (2009), dan Miftahudin et al. (2008), QTL untuk karakter toleransi Al pada populasi F2 hasil persilangan padi var. IR64 dengan Hawara Bunar berada pada kromosom 3 yang diapit oleh marka RM231, RM514, dan RM517. Marka RM231 dan RM517 terpaut dengan karakter RRG dan marka RM514 terpaut dengan karakter PPA. Dengan tim peneliti yang sama, Miftahudin et al. 2009, menyebutkan bahwa posisi QTL untuk toleransi Al terletak pada kromosom 3 di daerah yang diapit oleh marka RM489 dan RM517 yang berjarak 13.7 cM pada lengan pendek kromosom 3 padi. Hal ini sejalan dengan Nguyen (2001a) yang menyebutkan bahwa terdapat QTL toleransi cekaman Al pada kromosom 3 padi yang diapit oleh marka CDO1395 dan RG391. Kedua marka ini terpaut dengan karakter panjang akar selama cekaman Al dan panjang akar relatif sebagai parameter toleransi Al pada tanaman. Jarak antara marka RM517 dengan RG391 cukup dekat yaitu 1.082.580 bp (Lampiran 6).
Hasil analisis menunjukkan bahwa lima marka SSR yaitu RM2790, RM545, RM14535, RM14543, dan RM14552 dapat dipetakan di antara marka RM489 dan RM517 dengan rata-rata jarak antar marka menjadi 3 cM. QTL untuk karakter toleransi terhadap cekaman Al dapat dipetakan di daerah antara marka RM2790 dan RM14552. Analisis QTL menunjukkan bahwa pada daerah tersebut tidak dijumpai QTL untuk karakter RRG (LOD=1.2), tetapi telah ditemukan daerah QTL untuk karakter PPA (LOD=3.4) dengan puncak QTL berada pada daerah antara marka RM2790 dan RM545. QTL tersebut menjelaskan sekitar 21% dari variasi fenotip populasi F2 yang dipelajari (Gambar 5).
24
M -- IR-- -- HB-- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
M 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 5 8 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78
M 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 10410510610 7108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121122 123124125 126127
25
M RM505 RM234 RM531 RM547 RM201 RM222 RM332 RM16 RM457 (IR RM106)
M RM130 RM168 RM427 RM555 RM209
Gambar 10 Contoh elektroforesis hasil amplifikasi DNA tanaman BC2F2 175-63 dengan beberapa primer background. 63 F1 HB IR 300 bp 200 bp 400 bp 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 63 F1 HB IR 100 bp 200 bp 100 bp 63 HB IR 63 HB IR 63 HB IR 63 F1 IR 63 HB IR 63 HB IR
26
Gambar 11 Konstitusi background galur BC2F2 175-63 (jarak genetik didapatkan dari Mc Couch 2001 dan CIAT 2006).
RM283---IR64 31.4 RM575---IR64 52.6 RM5---HB 117.8 1 RM555---IR64 34.7 RM341---IR64 82.7 RM475---IR64 95.5 RM573---IR64 143.7 RM450---IR64 150.8 RM208---IR64 186.4 2 RM489---IR64 29.2 RM2790 30.0 RM545 33.3 RM14535 34.0 RM14543 34.5 RM14552 35.5 RM517---IR64 42.9 RM218---HB 67.8 RM157A----IR64 78.4 RM168---H 171.2 RM130---H 208.2 3 RM6770---IR64 13.2 RM6659---IR64 31.1 RM252---IR64 99.0 RM303---IR64 116.9 RM317---IR64 142.8 4 QTL
27 Gambar 11 Lanjutan RM413---IR64 10.4 RM548---IR64 28.6 RM289---IR64 36.2 RM459---IR64 93.7 RM421---HB 111.2
5
RM204---IR64 25.1 RM7434---HB 114.46
RM5752----IR64 10.9 RM427---IR64 11.4 RM336---IR64 61.0 RM505---IR64 78.6 RM234---IR64 124.77
RM1376---IR64 15.2 RM547---IR64 27.3 RM38---IR64 28.0 RM531---IR64 90.38
28 Gambar 11 Lanjutan RM409---IR64 45.6 RM201---IR64 81.2
9
RM222---IR64 11.3 RM304---IR64 73.010
RM332---IR64 27.9 RM167---IR64 37.5 RM457---IR64 83.0 RM206---IR64 102.911
RM19---IR64 20.9 RM247---IR64 32.3 RM1036---IR64 40.1 RM309---IR64 74.5 RM463---IR64 75.512
29 ---Populasi BC2F3 175-63--- M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ---Populasi BC2F3 175-63--- M IR HB 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 ---Populasi BC2F3 175-63--- M 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 3 7 38 39 40 41 42
Gambar 12 Contoh elektroforesis hasil amplifikasi DNA populasi BC2F3 175-63 dengan primer RM168 pada suhu annealing 550C (seleksi background).
100 bp
100 bp
30
Tabel 6 Perbandingan karateristik individu padi BC2F3 175-63-34 dan -119 dengan tetua IR64 dan Hawara Bunar
Karakter BC2F3 175-63-34 BC2F3 175-63-119 IR64 HB RRG (cm) 2.3 4.5 1.1 3.1 PPA (cm) 4.2 2.9 2.2 3.3 rata-rata panjang akarsamping (cm) 3.0 6.8 3.3 3.2
tinggi tanaman vegetatif (cm) 106.2 104.8 96.6 185.2
jumlah anakan vegetatif 9 12 9 3
umur berbunga (HST) 82 76 76 81
umur panen (HST) 121 121 111 114
jumlah malai 14 12 11 5
rata-rata panjang malai (cm) 24.3 22.5 22.6 49.5
total biji isi 1044 695 939 410
rata-rata biji isi/malai 75 58 85 86
total biji hampa 540 307 239 114
rata-rata biji hampa/malai 39 26 23 23
total bobot biji isi (g) 34.3 16.4 21.6 17.1 rata-ratabobot biji isi/malai
(g/malai) 2.45 1.4 1.9 3.5 konfigurasi marka foreground RM2790-RM545-RM14535-RM14543-RM14552 IR-HB-H-H-H IR-HB- HB-HB-HB IR-IR- IR-IR-IR HB-HB- HB-HB-HB %marka background mengikuti IR64 90.0 90.0 100.0 0.0
Analisis secara in silico menunjukkan bahwa daerah yang diapit RM2790 dengan RM14535 terdapat gen-gen yang berpotensi dalam toleransi Al seperti gen MATE efflux protein (Miftahudin 2010) diantaranya gen OJ1203D03.1 yang menyandikan protein Os03g08910 yang berperan dalam drug transmembrane transport yang memungkinkan transpor aktif zat terlarut (makromolekul, mikromolekul, dan ion) melintasi membran dengan mekanisme antiport. Selain itu juga terdapat gen Os03g11734.1-.2 dan -.3 yang juga berperan dalam MATE efflux protein (EMBLEBI 2012; PlantPAN 2012; TJL 2012).
Dengan menggunakan marka AFLP (Miftahudin et al. 2002) dan analisis sinteni pada rye, gandum, barley, dan padi (Miftahuin et al. 2005), didapatkan marka yang mengapit gen yang mengendalikan toleransi Al pada tanaman sereal yaitu marka BCD1230. Marka ini terletak pada daerah genomik konservatif untuk sifat toleransi Al pada lengan panjang kromosom homolog 4 pada gandum (AltBH), rye (Alt3), dan barley (Alp). Dengan menggunakan klon BAC padi berukuran160 kb dan analisis BLAST, daerah gen Alt3 pada rye sisnteni dengan daerah yang diapit oleh marka BCD1230 dan B6 pada klon tersebut yang didalamnya terdapat marka B11, B25, B27, dan B26. Analisis keterpautan populasi F2 pada rye menunjukkan bahwa produk PCR dari marka B11 berko-segregasi dengan lokus gen Alt3. Hal ini berarti gen Alt3 berlokasi sangat dekat dengan marka B11 atau
31 marka B11 adalah gen Alt3. Roslim (2011) telah membuktikan bahwa marka B11 merupakan salah satu gen pengendali toleransi cekaman Al pada padi. Lokasi QTL yang sedang diteliti (antara marka RM489 dan RM517) pada kromosom 3 ini terletak tidak jauh dari lokasi marka B11 dan OsGSTL2 (gen penyandi glutathione S-transferase) (Hu et al. 2011).
Seleksi Foreground Populasi BC2F1
Analisis foreground menggunakan empat marka SSR dari populasi BC2F1 yang berjumlah 180 individu (Lampiran 7), menghasilkan 5 kombinasi genotipe seperti pada Tabel 2. Tabel 2 di atas menunjukkan bahwa terdapat 5 kelompok introgresi antara kedua tetua IR64 dan Hawara Bunar dengan pola introgresi marka-marka RM2790-RM14535-RM14543-RM14552 masing-masing adalah H-H-H-H, A-H-A-A, H-H-A-A, A-A-H-H, dan A-H-H-H dengan H adalah lambang genotipe heterozigot dan A adalah lambang genotipe IR64. Kelompok introgresi pertama adalah populasi tanaman yang memiliki introgresi heterozigot pada posisi marka RM2790 sampai dengan RM14552. Jumlah tanaman yang memiliki tipe introgresi ini terdapat 6 tanaman. Kelompok introgresi kedua memiliki introgresi heterozigot hanya pada posisi marka RM14535 dengan jumlah tanaman 7 tanaman. Kelompok ketiga memiliki introgresi heterozigot pada posisi marka RM2790 dan RM14535 dengan jumlah tanaman 3 tanaman. Kelompok introgresi keempat dan kelima memiliki introgresi heterozigot pada posisi marka RM14543 dan RM14552 dengan penambahan introgresi heterozigot pada posisi marka RM14535 pada kelompok introgresi kelima. Jumlah tanaman pada kelompok introgresi ini berturut-turut adalah 4 dan 2 tanaman. Secara keseluruhan hasil seleksi foreground menggunakan 4 marka di atas diperoleh 22 individu rekombinan BC2F1 dengan 5 kombinasi tipe introgresi genotipe seperti pada Tabel 2.
Untuk mempersempit ragam populasi yang akan dipilih pada seleksi selanjutnya dan sekaligus mendesain daerah diluar RM489 dan RM517 pada kromosom 3 cenderung mengikuti IR64, maka dilakukan seleksi lagi dengan marka RM489 dan RM517 mengikuti IR64 seperti pada Tabel 3. Dengan penambahan marka seleksi RM489 dan RM517 tersebut, didapatkan 3 kelompok, yaitu kelompok kedua, ketiga, dan kelima. Kelompok kedua terdapat 1 tanaman yaitu BC2F1 180 dan pada kelompok ketiga dan kelima diperoleh masing-masing 2 tanaman berturut-turut yaitu BC2F1 151, 159, 174, dan 175.
Seleksi Foreground Populasi BC2F2
Analisis toleransi Al terhadap 120 tanaman dari masing-masing populasi BC2F2 terpilih yaitu populasi nomor 151, 159, 175, dan 180 menunjukkan bahwa sifat toleransi terdistribusi secara normal pada tiap populasi tersebut dengan rata-rata nilai PPA berturut-turut sebesar 0.98, 1.57, 1.11, dan 1.59 serta nilai RRG berturut-turut sebesar 1.76, 1.41, 1.83, dan 2.09 untuk populasi 151, 159, 175 dan 180 (Tabel 4). Untuk analisis pada populasi BC2F2, dipilih tanaman BC2F2 175 dan 180. Hal ini berdasarkan pada pola genotipe HH dan AH untuk marka RM2790 dan RM14535 serta masih tingginya daya berkecambah biji pada populasi tersebut.
Berdasarkan data fenotipik RRG pada populasi BC2F2 175, 65% dari populasi mengikuti karakter tetua IR64, 5.2% dari populasi mengikuti karakter
32
tetua Hawara Bunar, dan sisanya mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya. Pada populasi BC2F2 180, 10% dari populasi mengikuti IR64, 18% dari populasi mengikuti Hawara Bunar dan sisanya yaitu 72% dari populasi mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya.
Nilai PPA pada populasi BC2F2 175 menunjukkan bahwa 46.2% dari populasi mengikuti karakter Hawara Bunar dan sisanya mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya. Berbeda dengan populasi BC2F2 175, nilai PPA pada populasi BC2F2 180 ada yang mengikuti karakter tetua IR64 yaitu sebesar 11.4%, yang mrngikuti karakter tetua Hawara Bunar sebesar 20% dan sisanya mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya. Distribusi frekuensi data fenotipik RRG dan PPA pada populasi BC2F2 175 dan 180 disajikan pada Gambar 7.
Hasil analisis foreground pada populasi BC2F2 175, sebesar 13.3% pada marka RM14535 mengikuti pola introgresi homozigot Hawara Bunar dan dengan nilai yang sama mengikuti pola introgresi homozigot IR64 serta sisanya mengikuti pola introgresi heterozigot. Pada marka RM14543, sebesar 6.7% mengikuti pola introgresi homozigot Hawara Bunar, 60% mengikuti pola introgresi homozigot IR64, dan sisanya mengikuti pola introgresi heterozigot. Pada marka RM14552, yang mengikuti mengikuti pola introgresi homozigot Hawara Bunar, IR64, dan heterozigot berturut-turut sebesar 13.3%, 53.3%, dan 33.4% (Lampiran 8). Populasi BC2F2 180 yang mengikuti mengikuti pola introgresi homozigot Hawara Bunar, IR64, dan heterozigot pada marka RM14535 berturut-turut sebesar 1%, 54.4%, dan 44.6% (Lampiran 9).
Individu terpilih BC2F2 untuk dikembangkan menjadi populasi BC2F3 dan diseleksi lebih lanjut adalah BC2F2 175-63 karena mempunyai nilai RRG yang cukup tinggi, mempunyai pola introgresi heterozigot pada marka RM14535, RM14543, dan RM14552, sehingga masih memungkinkan untuk mendapatkan individu yang membawa alel dari Hawara Bunar pada marka-marka tersebut.
Seleksi Foreground dan Background Populasi BC2F3
Karakter-karakter fisiologi seperti RRG, PPA, dan daya tumbuh akar samping mempunyai pola pewarisan yang berbeda-beda. Frekuensi individu BC2F3 175-63 yang mengikuti karakter tetua IR64 pada analisis RRG, PPA, dan daya tumbuh akar samping berturut-turut sebesar 10.2%, 0.8%, dan 21.9%; sedangkan yang mengikuti karakter tetua Hawara Bunar berturut-turut sebesar 9.4%, 82.8%, dan 64.8%. Sisanya mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya (Lampiran 10).
Demikian halnya pada pengamatan karakter-karakter agronomi. Karakter tinggi tanaman vegetatif, jumlah anakan vegetatif, jumlah malai, rata-rata panjang malai, total biji isi, dan total bobot biji isi berturut-turut yang mengikuti karakter tetua IR64 sebesar 67.6%, 42.9%, 30.4%, 32.0%, 7.8%, dan 8.7% dari total populasi BC2F3 175-63. Sedangkan yang mengikuti karakter tetua Haawarabunar berturut-turut sebesar 0%, 8.9%, 7.8%, 0%, 28.4%, dan 79.6%. Sisanya mengikuti perpaduan karakter kedua tetuanya (Lampiran 11). Hal ini menunjukkan bahwa distribusi pewarisan sifat masing-masing karakter dalam populasi menunjukkan nilai yang berbeda-beda.
Hasil seleksi foreground (Gambar 9 dan Lampiran 5) menunjukkan bahwa ada 32 individu atau 24.6% dari total populasi BC2F3 175-63 dengan genotipe pada marka RM545 mengikuti genotipe homozigot Hawara Bunar yang
33 merupakan titik puncak daerah QTL di kromosom 3. Dua diantaranya adalah individu BC2F3 terpilih yaitu BC2F3 175-63-34 dan -119.
Kedua individu terpilih ini memiliki nilai PPA dan RRG yang lebih tinggi dari nilai PPA dan RRG pada tetua IR64 serta individu BC2F3 175-63-34 memiliki nilai PPA yang jauh lebih besar yaitu 4.2 daripada nilai PPA pada tetua Hawara Bunar yang sebesar 3.3 dan individu BC2F3 175-63-119 memiliki nilai RRG yang jauh lebih besar yaitu 4.5 daripada nilai RRG pada tetua Hawara Bunar yang sebesar 3.1. Selain itu, individu terpilih BC2F3 175-63-119 memiliki nilai rata-rata akar samping dua kali lipat dari nilai rata-rata akar samping pada kedua tetua. Hal ini berarti, individu terpilih BC2F3 175-63-119 mempunyai daya tumbuh akar yang sangat baik.
Hasil analisis background menunjukkan bahwa marka-marka yang digunakan di luar kromosom 3 cenderung telah homozigot mengikuti tetua IR64 (Gambar 10, 12, dan 13) yaitu berkisar 87.76% – 91.84% (Lampiran 5). Pada kedua individu terpilih sebesar 90.0% (Lampiran 12 dan 13) dari 50 marka