Sampel biologis yang dianalisis pada penelitian ini berupa sampel plasma darah dari subjek keturunan suku jawa. Penggunaan sampel plasma darah orang keturunan suku jawa penting sehingga metode analisis menjadi lebih spesifik.
Preparasi merupakan langkah yang sangat penting pada analisis sebelum larutan sampel dianalisis menggunakan metode KCKT. Teknik preparasi sampel plasma darah pada penelitian ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Alvi dan Hammami (2011). Sampel plasma pertama kali dispike dengan senyawa kafein dan SI karena subjek uji tidak diberi perlakuan untuk mengkonsumsi kafein. Protein pada plasma diendapkan dengan bantuan penambahan metanol dan sentrifugasi. Sampel plasma harus disaring menggunakan microsyringe untuk menghilangkan kontaminasi zat yang mungkin ada dalam sampel sebelum diinjeksikan pada KCKT. Ultrasonikasi dilakukan untuk menghilangkan gelembung udara pada sampel yang dapat mengacaukan pembacaan absorbansi. Larutan yang akan dianalisis menggunakan KCKT harus jernih dan bebas dari kontaminasi zat atau gelembung udara karena jika masih terdapat kontaminasi zat atau gelembung udara pada sampel bisa mengakibatkan kerusakan kolom.
Optimasi pemilihan standar internal dilakukan sebelum optimasi sistem KCKT. Optimasi sistem KCKT pada penelitian ini dilakukan dengan optimasi berbagai perbandingan komposisi fase gerak aquabidestilata : metanol dan optimasi kecepatan alir fase gerak campuran aquabidestilata : metanol. Kandidat standar internal yang dioptimasi adalah asetanilida, nikotinamida dan papaverin. Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan pada Gambar 1, senyawa nikotinamida tidak dapat dijadikan standar internal karena memiliki puncak yang bertabrakan dengan puncak senyawa dalam blanko plasma. Puncak senyawa asetanilida dan papaverin terpisah dari puncak noise dalam blanko plasma. Puncak senyawa papaverin yang dihasilkan memiliki waktu retensi yang dekat dengan puncak senyawa kafein, sedangkan puncak senyawa asetanilida memiliki waktu retensi yang cukup jauh dengan senyawa kafein sehingga senyawa asetanilida dipilih sebagai SI pada penelitian ini.
Gambar 1. Kromatogram tumpang tindih antara blanko plasma dengan senyawa kafein dan beberapa kandidat SI (asetanilida, nikotinamida dan papaverin) menggunakan sistem KCKT
yang optimum (fase diam kolom C18:250 x 4,6 mm, 5µm; fase gerak campuran aquabidestilata :
metanol dengan perbandingan 60:40; kecepatan alir 1,0 mL/menit
Berdasarkan spektrum yang dihasilkan oleh spektrofotometer UV pada pembacaan absorbansi senyawa kafein dan asetanilida, dipilih panjang gelombang pengamatan untuk senyawa kafein dan SI asetanilida yaitu 255 nm. Spektrum hasil pembacaan oleh spektrofotometer UV dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Tumpang tindih spektrum senyawa kafein dan asetanilida. Pembacaan absorbansi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200nm - 400nm
Kondisi optimum sistem KCKT yang dapat memisahkan kafein, SI dan matriks sampel plasma dioptimasi pada berbagai perbandingan komposisi fase gerak dan kecepatan alir. Kecepatan alir yang dioptimasi pada sistem KCKT menggunakan kecepatan alir 0,5 mL/menit dan 1,0 ml/menit menggunakan fase gerak aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40. Pada kecepatan alir 0,5 mL/menit, waktu retensi yang dihasilkan lebih lama dibandingkan pada kecepatan alir 1,0 mL/menit. Selain itu pada kecepatan alir 0,5 ml/menit dihasilkan puncak yang melebar. Sedangkan pada kecepatan alir 1,0 ml/menit dihasilkan puncak yang lebih sempit dan waktu retensi yang lebih cepat, sehingga kecepatan alir 1,0 ml/menit dipilih sebagai kecepatan alir optimum pada penelitian ini. Data tailing factor dan waktu retensi dari kafein dan kandidat SI (asetanilida, nikotinamida, papaverin) pada optimasi fase gerak dan kecepatan alir dapat dilihat pada tabel I.
Tabel I. Nilai tailing factor dan waktu retensi dari kafein dan kandidat SI (asetanilida, nikotinamida, papaverin) pada optimasi
Komposisi fase gerak (aquabidesti lata : metanol) Kecepa tan alir (ml /menit) tf kafein tf asetanili da tf nikotina mida tf papaver in tR kafein tR asetanili da tR nikotina mida tR papaver in 40 : 60 0,5 1,408 - 1,500 - 6,895 - 5,755 - 1,0 1,411 - 1,535 - 3,462 - 2,882 - 50 : 50 0,5 1,342 - 1,442 - 7,941 - 5,964 - 1,0 1,349 1,192 1,481 1,318 3,990 6,151 2,988 3,207 60 : 40 0,5 1,218 - 1,378 - 10,298 - 6,386 - 1,0 1,247 1,100 1,414 1,227 5,233 9,292 3,202 6,314
Komposisi fase gerak yang dioptimasi pada sistem KCKT yaitu perbandingan komposisi fase gerak aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40 dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit. Untuk komposisi fase gerak
aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 60:40 dihasilkan puncak dengan pemisahan paling baik dibandingkan pada komposisi fase gerak dengan perbandingan 50:50 dan 40:60. Namun pada perbandingan komposisi fase gerak 60:40 waktu retensi dari standar internal asetanilida terlalu lama yaitu mendekati 10 menit. Waktu retensi dikatakan efektif jika kurang dari 10 menit. Untuk perbandingan komposisi fase gerak
aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 50:50 menghasilkan pemisahan yang lebih baik dibandingkan pada perbandingan komposisi fase gerak 40:60. Selain itu pada perbandingan komposisi fase gerak 50:50 dihasilkan waktu retensi dari standar internal dibawah 7 menit (cukup cepat). Sehingga komposisi fase gerak aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 50:50 dipilih sebagai komposisi fase gerak optimum.
Gambar 3. Kromatogram senyawa: Kafein dan SI Asetanilida dalam sampel plasma
menggunakan sistem KCKT yang optimum (fase diam kolom C18:250 x 4,6 mm, 5µm; fase
gerak campuran aquabidestilata : metanol dengan perbandingan 50:50; kecepatan alir 1,0 mL/menit; detektor UV 255 nm
Keterangan : Data 1 (blanko plasma)
Data 2 (seri 1) : kafein 1,6 µg/mL; asetanilida 4 µg/mL Data 3 (seri 2) : kafein 8 µg/mL; asetanilida 8 µg/mL Data 4 (seri 3) : kafein 18 µg/mL; asetanilida 12 µg/mL
Puncak senyawa kafein dan SI asetanilida dalam kromatogram mempunyai nilai tf kurang dari 2, hal ini menunjukkan bahwa kafein dan SI asetanilida tidak cukup kuat tertahan dalam kolom dan dapat keluar serentak dari kolom (Snyder dkk., 2010). Nilai tR kafein dan SI asetanilida pada Gambar 3 adalah kurang dari 10 menit. Hal ini menunjukkan bahwa kedua senyawa tersebut dapat keluar dengan cepat dari kolom. Nilai tR senyawa kafein lebih cepat dibandingkan senyawa SI asetanilida, hal ini disebabkan karena waktu retensi suatu senyawa sangat dipengaruhi oleh interaksinya dengan fase diam
dan fase gerak yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan metode KCKT fase terbalik, sehingga semakin polar suatu senyawa maka interaksi dengan fase geraknya semakin kuat dan dapat dikatakan waktu retensinya semakin cepat.
Gambar 4 menunjukkan interaksi kafein atau SI asetanilida dengan fase diam. Interaksi kafein dengan fase diam lebih sedikit dibandingkan interaksi SI asetanilida dengan fase diam.
Gambar 4. Interaksi senyawa Kafein (A) dan SI asetanilida (B) dengan fase diam Keterangan :
Interaksi hidrofobik antara senyawa kafein/SI dengan fase diam
Gambar 5 menunjukkan gugus polar yang dimiliki kafein dan SI asetanilida dan interaksinya dengan fase gerak. Ditinjau dari strukturnya, gugus polar pada senyawa kafein lebih banyak dibandingkan gugus polar pada SI asetanilida sehingga interaksi kafein dengan fase gerak lebih besar dibandingkan interaksi SI asetanilida dengan fase gerak. Interaksi kafein dengan fase diam yang lebih sedikit dibandingkan interaksi SI asetanilida dengan fase diam serta interaksi kafein dengan fase gerak yang lebih besar dibandingkan interaksi SI asetanilida dengan fase gerak menyebabkan waktu retensi kafein lebih cepat dibandingkan waktu retensi SI asetanilida.
Gambar 5. Senyawa Kafein (A) dan SI Asetanilida (B) dengan gugus polarnya ( )
serta interaksinya dengan fase gerak aquabidestilata (H2O) dan metanol (CH3OH)
Keterangan :
Interaksi kafein/SI dengan pelarut aquabidestilata
Interaksi kafein/SI dengan pelarut metanol
Hasil kromatogram untuk senyawa kafein dan SI asetanilida menunjukkan pemisahan puncak yang sempurna dengan puncak senyawa lain yang berdekatan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai Rs > 2,0 mengidentifikasikan bahwa puncak senyawa dapat terpisah dengan baik dengan senyawa lain yang puncaknya berdekatan (Snyder dkk., 2010).
Pada tahap optimasi pemisahan kafein dan SI asetanilida dalam sampel plasma, digunakan 3 seri konsentrasi kafein maupun SI asetanilida menggunakan fase gerak
aquabidestilata dan metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40 serta kecepatan alir 0,5mL/menit dan 1,0 mL/menit. Penggunaan 3 seri konsentrasi bertujuan untuk membandingkan tinggi puncak kromatogram sebagai acuan seberapa besar kadar yang akan digunakan pada tahap validasi metode. Nilai tailing factor dan waktu retensi yang didapatkan dari sistem KCKT fase terbalik dengan fase gerak perbandingan
aquabidestilata:metanol dengan perbandingan 50:50 dan kecepatan alir 1,0 ml/menit telah memenuhi persyaratan analisis baik untuk kafein maupun SI (asetanilida), data disajikan pada Tabel II.
Tabel II. Nilai tf dan tR kafein dan SI pada berbagai tingkat Seri konsentrasi Senyawa Kadar (g/ml) tf (rata-rata ±SD) CV (%) tR (menit) (rata-rata ±SD) CV (%) rendah Kafein 1,6 1,349 ± 0,010 0,741 3,975 ± 0,011 0,266 SI asetanilida 4 1,181 ± 0,012 0,988 6,135 ± 0,030 0,489 tengah Kafein 8 1,329 ± 0,003 0,199 3,973 ± 0,011 0,276 SI asetanilida 8 1,182 ± 0,001 0,049 6,137 ± 0,032 0,524 tinggi Kafein 18 1,330 ± 0,003 0,189 3,976 ± 0,011 0,269 SI asetanilida 12 1,192 ± 0,003 0,256 6,142 ± 0,032 0,521 Keterangan : masing-masing senyawa dalam setiap kadar direplikasi sebanyak 3 kali.
Berdasarkan uji kesesuaian sistem didapatkan rata-rata nilai tailing factor kafein yaitu 1,332; rata-rata waktu retensi kafein adalah 4,005 menit, rata-rata resolusi kafein dengan senyawa lain yang puncaknya terdekat yaitu 2,029, rata-rata nilai tailing factor SI (asetanilida) yaitu 1,197, rata-rata waktu retensi SI (asetanilida) adalah 6,251, rata-rata resolusi SI (asetanilida) dengan senyawa lain yang puncaknya terdekat untuk replikasi 1, 2 dan 3 yaitu 8,468 sedangkan rata-rata resolusi SI dengan senyawa lain yang puncaknya terdekat untuk replikasi 4, 5 dan 6 yaitu 5,723. Nilai resolusi SI (asetanilida) pada replikasi 1, 2 dan 3 jauh berbeda dengan nilai resolusi SI (asetanilida) pada replikasi 4, 5 dan 6 karena puncak terdekat dari SI asetanilida pada replikasi 1, 2 dan 3 merupakan puncak senyawa kafein yang memiliki waktu retensi sekitar 4,0 menit, sedangkan puncak terdekat dari SI asetanilida pada replikasi 4, 5 dan 6 terdapat puncak senyawa lain pada waktu retensi sekitar 4,4 menit. Pada replikasi 4, 5 dan 6 terbaca puncak noise blanko plasma pada waktu retensi sekitar 4,4 menit, sedangkan pada replikasi 1, 2 dan 3 tidak terbaca puncak noise pada waktu retensi sekitar 4,4 menit. Hal tersebut menyebabkan resolusi pada uji kesesuaian sistem untuk SI pada replikasi 1, 2 dan 3 memiliki nilai resolusi yang lebih tinggi dibandingkan resolusi uji kesesuaian sistem pada replikasi 4, 5 dan 6. Berdasarkan penjelasan tersebut dapat dikatakan bahwa metode ini telah memenuhi kriteria tailing factor yang baik yaitu dibawah 2,0; waktu retensi yang efektif yaitu dibawah 10 menit dan resolusi yang baik yaitu diatas 2,0. Dari uji kesesuaian sistem tersebut didapatkan CV untuk parameter tailing factor, waktu retensi dan Height Equivalent of a Theoretical Plate
(HETP) baik untuk kafein maupun SI menunjukkan CV < 2% sehingga dapat dikatakan memenuhi kriteria batasan koefisien variansi untuk uji kesesuaian sistem. Data selengkapnya disajikan pada tabel III.
Tabel III. Data nilai tailing factor kafein dan SI (asetanilida), nilai waktu retensi kafein dan SI (asetanilida), nilai resousi kafein dan SI (asetanilida), dan nilai HETP kafein dan SI (asetanilida) pada
uji kesesuaian sistem
Tailing factor (Kafein) Waktu retensi (Kafein) Resolusi (Kafein) HETP (Kafein) Tailing factor (SI) Waktu retensi (SI) Resolusi (SI) Resolusi (SI) HETP (SI) 1 1,338 4,005 2,072 35,247 1,198 6,250 8,535 18,866 2 1,322 4,006 2,076 36,401 1,197 6,253 8,403 19,487 3 1,326 4,004 2,047 35,771 1,196 6,250 8,465 19,253 4 1,333 4,006 2,019 36,357 1,199 6,251 5,562 19,361 5 1,340 4,005 1,970 35,629 1,198 6,251 5,899 19,132 6 1,334 4,006 1,990 35,214 1,195 6,253 5,709 19,013 Rata -rata 1,332 4,005 2,029 35,770 1,197 6,251 8,468 5,723 19,185 CV (%) 0,5210 0,0204 2,146 1,450 0,1230 0,0219 0,7799 2,9521 1,191 KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa kondisi optimum sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) yang dapat memisahkan senyawa kafein dan SI asetanilida dari matriks sampel plasma adalah fase gerak campuran aquabidestiata : metanol dengan perbandingan (50:50) pada kecepatan 1,0 mL/menit; menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 255 nm; serta volume injeksi sejumlah 20 L.
SARAN
Perlu dilakukan tahap validasi metode setelah tahap optimasi dan jika metode ini valid dapat dikembangkan untuk kepentingan Therapeutic Drug Monitoring (TDM).
