Hasil
Pembuktian Keberadaan Gen btpac-bd1
Data hasil pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 disajikan pada Gambar 4, Gambar 5 dan Gambar 6.
Seleksi Mikroba Rekombinan dengan Marka Genetik
Seleksi mikroba rekombinan dilakukan dengan menginokulasi kultur koleksi B. megaterium btpacBD1 dalam LB-tet padat (media seleksi). Koloni-koloni tunggal terlihat pada cawan petri setelah diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Gambar 4). Koloni tunggal yang tumbuh diduga merupakan B. megaterium btpacBD1 yang tersisipi plasmid pMMbtpac-bd1 rekombinan yang mempunyai gen penyandi resisten terhadap antibiotik tertrasiklin.
Gambar 4. Koloni tunggal B. megaterium btpacBD1 pada media seleksi
Deteksi Plasmid Rekombinan pMMbtpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid dan PCR
Data visualisasi plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1 hasil ektraksi koloni tunggal B. megaterium btpacBD1 pada gel agarosa 1% ditunjukan dengan pita tunggal yang berukuran yang lebih besar dari 10 kpb dengan konformasi plasmid yang relaxed open circular (Gambar 5). Adanya pita tunggal DNA ini menunjukkan keberadaan plasmid pMMbtpac-bd1 sehingga dapat diuji PCR untuk mendeteksi keberadaan gen btpac-bd1. Data visualisasi produk hasil amplifikasi PCR pada gel agarosa 1%. menunjukkan adanya pita tunggal yang berukuran antara 2000 pb dan 3000 pb (Gambar 6). Adanya pita tunggal DNA ini
17 menunjukkan keberadaan gen btpac-bd1 sehingga kultur koleksi B. megaterium
btpacBD1 merupakan mikroba rekombinan yang telah terkonfirmasi sehingga dapat digunakan untuk ekspresi protein rekombinan dan optimasi komposisi media untuk produksi enzim PAc.
Gambar 5. Hasil visualisasi plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi koloni tunggal B. megaterium
btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol positif; 3: Kontrol negatif (air); 4: Plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi
Gambar 6. Hasil visualisasi gen btpac-bd1 hasil PCR dari plasmid hasil ekstraksi kultur B. megaterium
btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol negatif (air); 3: Kontrol positif; 4: Gen btpac-bd1 hasil PCR. 10000 6000 3000 2000 250 pb 1 2 3 4 3000 Relaxed open circular Supercoiled Circular (single strand) pb 1 2 2 3 4
18
Optimasi Media dengan metode Central Composite Design
Sebanyak 22 unit percobaan telah dilakukan. Aktivitas enzim PAc, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc adalah sebagai respon pada setiap percobaan disajikan pada Lampiran 6. Pada saat penelitian, sampel diambil dan diuji aktivitas enzim PAc, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc setiap 6 jam selama 48 jam kultivasi. Namun, hanya jam ke-48 yang memberikan model yang mewakili respon yang dapat digunakan untuk optimasi komposisi media produksi PAc rekombinan dari B. megaterium btpacBD1. Data hasil analisa model permukaan respon pada jam ke-48 disajikan pada Lampiran 7–11 dan Gambar 7 dan 8.
Respon: Aktivitas Enzim PAc
Sebelum uji aktivitas PAc rekombinan, dilakukan pengukuran kadar 6-APA untuk pembuatan kurva standar. Dari kurva standar 6-APA pada Lampiran 4 dan diperoleh persamaan matematika Y=0.459X+0.001 R2=0.991. Dari persamaan tersebut, maka nilai konsentrasi 6-APA dapat diketahui sehingga dapat dilakukan perhitungan sesuai dengan rumus aktivitas PAc.
Lampiran 7 menjelaskan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (nilai p <0.0001) pada tingkat kepercayaan 95%. Uji lanjut ketidakcocokan model (lack of fit) pada Lampiran 7 menunjukkan bahwa hanya model kuadratik yang secara tidak nyata menunjukkan ketidakcocokan (nilai p > 0.1142 dan R2 = 0.86 pada Lampiran 7.
Selanjutnya dilakukan analisa ANOVA terhadap model permukaan respon kuadratik (Lampiran 7). Hasil analisa kembali menjelaskan bahwa model kuadratik secara nyata (nilai p <0.0001) dapat menjelaskan data yang ada dengan uji lanjut ketidakcocokan model menunjukkan nilai p : 0.1142. Dengan demikian model kuadratik adalah model yang mewakili respon dan digunakan untuk optimasi komposisi media produksi PAc rekombinan dari B. megaterium.
Lampiran 7 (lanjutan) juga menjelaskan tentang perkiraan pengaruh setiap peubah dan interaksinya disertai dengan hasil uji beda nyata. Peubah yang mempunyai pengaruh nyata terhadap model pada tingkat kepercayaan 99% ditunjukkan dengan nilai p < 0.01. Dengan demikian model yang dapat menjelaskan data yang diperoleh adalah:
Y= 1.132 – 0.324 X12– 0.129 X22– 0.257 X1X2
Dimana Y adalah aktivitas PAc (U/mL), X1 adalah konsentrasi xilosa (%) dan X2 adalah konsentrasi CaCl2 (mM). Persamaan diatas menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 mempunyai pengaruh yang nyata terhadap aktivitas enzim PAc di dalam cairan kultivasi. Baik xilosa dan CaCl2 berpengaruh secara kuadratik. Hasil ini menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 mempuyai hubungan langsung dengan enzim PAc yang disintesis B. megaterium.
19 Plot permukaan respon sebagai fungsi dari dua peubah akan lebih memudahkan untuk melihat pengaruh dari peubah-peubah tersebut mengingat model yang digunakan adalah kuadratik. Pengaruh antar variabel terhadap aktivitas enzim PAc disajikan pada Gambar 7.
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Original Scale Aktivitas (U/ml)
Design points above predicted value
Design points below predicted value 1.8 0.027 X1 = A: xilosa X2 = B: CaCl2 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 0.5 1 1.5 2 A k ti v it a s ( U /m l) A: xilosa (%) B: CaCl2 (mM
Gambar 7. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level variabel terkodekan terhadap aktivitas PAc
Respon: Kadar Protein
Berdasarkan hasil pengukuran kadar protein standar BSA (Bovine Serum Albumin), maka diperoleh kurva standar pada Lampiran 5 dan diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan matematika Y=0.018X+0.193 R2=0.995. Dari persamaan tersebut, maka kadar protein pada ekstrak enzim kasar dapat diketahui.
Lampiran 8 menjelaskan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor tidak memberikan pengaruh yang nyata (nilai p: 0.0191) pada tingkat kepercayaan 95% sehingga uji selanjutnya tidak perlu dilakukan.
Respon: Aktivitas Spesifik Enzim PAc
Lampiran 9 menjelaskaan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (p-value <0.0001) pada tingkat kepercayaan 95%.
Uji lanjut ketidakcocokan model (lack of fit) pada Lampiran 9 menunjukkan bahwa hanya model kuadratik yang secara tidak nyata menunjukkan ketidakcocokan (nilai p > 0.2688 dan R2 = 0.79 pada Lampiran 9 (lanjutan)). Selanjutnya dilakukan analisa ANOVA terhadap model permukaan respon
20
kuadratik. Hasil analisa kembali menjelaskan bahwa model kuadratik secara nyata (nilai p <0.0001) dapat menjelaskan data yang ada (Lampiran 9).
Lampiran 9 juga menjelaskan tentang peubah yang mempunyai pengaruh nyata terhadap model pada tingkat kepercayaan 99% ditunjukkan dengan nilai p < 0.01. Dengan demikian model yang dapat menjelaskan data yang diperoleh adalah:
Y= 11.191 – 3.368 X12– 1.519 X22– 2.025 X1X2
Dimana Y adalah aktivitas spesifik PAc (U/mg), X1 adalah konsentrasi xilosa (%) dan X2 adalah konsentrasi CaCl2 (mM). Persamaan diatas menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 mempunyai pengaruh yang nyata terhadap aktivitas enzim PAc secara kuadratik. Berikut adalah plot pengaruh antar variabel terhadap aktivitas spesifik enzim PAc (Gambar 8).
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Original Scale Akt.Spesifik (U/mg)
Design points above predicted value
Design points below predicted value
178.022 1.95 X1 = A: xilosa X2 = B: CaCl2 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 50 100 150 200 A k t. S p e s if ik ( U /m g ) A: xilosa (%) B: CaCl2 (mM
Gambar 8. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level terkodekan terhadap aktivitas spesifik PAc
Optimasi menggunakan perangkat lunak Design Expert versi 9 dilakukan untuk mendapatkan komposisi media yang dapat menghasilkan enzim PAc dengan aktivitas dan aktivitas spesifik tertinggi. Pada komposisi media yang mengandung 0.49% xilosa dan 2.40 mM CaCl2, secara teoritis akan menghasilkan aktivitas tertinggi 1.318 ± 0.406 U/mL dengan kadar protein 0.0101 ± 0.001 mg/mL dan aktivitas spesifik 130.669 ± 50.241 U/mg (Lampiran 10). Komposisi media hasil optimasi diverifikasi sebanyak 2 kali ulangan sebanyak 6 erlenmeyer untuk produksi enzim PAc dari B.megaterium. Verifikasi komposisi media optimal menghasilkan aktivitas enzim PAc 1.294 ± 0.171 U/mL dengan kadar protein 0.0102 ± 0.0003 mg/mL dan aktivitas spesifik 125.910 ± 13.309 U/mg (Lampiran 11).
21 Produksi Skala Bioreaktor
Penentuan Waktu Panen Enzim Terbaik
Data hasil penentuan waktu panen enzim terbaik (berupa plot data hasil pengukuran nilai absorbansi OD sel dan aktivitas PAc) yang diproduksi selama 60 jam dilakukan untuk mengetahui kapan waktu produksi enzim PAc dengan aktivitas tertinggi (Gambar 9 dan Lampiran 12).
Gambar 9. Kurva pertumbuhan B. megaterium
btpacBD1( ) dan aktivitas PAc ( ) dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi 150 rpm selama 60 jam.
Gambar 9 dan Lampiran 12 menjelaskan bahwa kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 dan aktivitas volumetrik (U/mL) ditentukan setiap 6 jam selama 60 jam. Fase eksponensial (log) terjadi antara jam 0 – 30 jam setelah kultivasi. Fase adaptasi (lag) tidak terdeteksi mungkin disebabkan oleh rentang waktu pengambilan sampel yang lebih panjang dari fase lag. Selanjutnya, fase stasioner terjadi antara jam 30 – 42 sebelum memasuki fase kematian, yaitu antara jam 48 – 60 waktu kultivasi. Aktivitas mulai terbentuk pada fase eksponensial (antara jam 18 – 42) dan mencapai aktivitas tertinggi pada fase kematian (jam ke-48) yaitu sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL). Selanjutnya, aktivitas PAc mengalami penurunan yang signifikan.
Berdasarkan aktivitas PAc tertinggi yang dihasilkan, jam ke-48 dipilih sebagai waktu terbaik untuk panen enzim PAc sehingga waktu kultivasi untuk proses produksi PAc selanjutnya dilakukan selama 48 jam.
Kurva pertumbuhan Bacillus megaterium btpacBD1
Data hasil pengukuran nilai absorbansi OD sel kemudian diterjemahkan dalam kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 (Gambar 10). Gambar 10 menunjukkan bahwa kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1selama 48 jam menunjukkan pola kurva pertumbuhan yang relatif sama dengan Gambar 9
22
Gambar 10. Kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1
Pengukuran Aktivitas, Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Enzim PAc pada Skala Bioreaktor
Data hasil analisa aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc pada setiap waktu kultivasi disajikan pada Lampiran 13 dan Gambar 11 sampai Gambar 15. Data hasil analisa aktivitas enzim PAc selama 48 jam kultivasi disajikan pada Gambar 11.
Gambar 11. Grafik hubungan antara rerata aktivitas enzim PAc dengan waktu
Gambar 11 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa aktivitas PAc menunjukkan pola yang sama dengan Gambar 9. Aktivitas PAc meningkat pada jam ke-18, setelah itu antara jam 18 – 42 aktivitas PAc relatif konstan (secara statistik tidak menunjukkan perbedaan berarti) dan aktivitas PAc tertinggi terjadi pada jam ke-48 yaitu sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL yang berarti bahwa 1 mL enzim ekstrak kasar (EEK) dapat mendegradasi senyawa penisilin G menjadi 6-APA sebesar 2.0687 ± 0.0820 µmol per menit pada kondisi suhu 50°C.
23
Gambar 12. Grafik hubungan antara rerata kadar protein dengan waktu
Gambar 12 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa kadar protein meningkat secara signifikan pada jam ke-30. Selanjutnya, kadar protein tertinggi didapatkan pada jam ke-48 yaitu sebesar 0.0078 ± 0.0008 mg/mL.
Gambar 13. Grafik hubungan antara rerata aktivitas spesifik enzim PAc dengan waktu
Gambar 13 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim PAc tertinggi terjadi pada jam ke-18 yaitu sebesar 1260.521 ± 27.5711 U/mg. Artinya, tiap 1 mg protein dalam EEK memiliki aktivitas sebesar 1260.521 ± 27.5711 Unit. Setelah itu, aktivitas spesifik PAc mengalami penurunan yang signifikan setelah jam ke-18.
Menurut Syamsuriputera (1995), kurva aktivitas PAc berhubungan dengan kurva pertumbuhan Berikut adalah kurva yang menunjukkan hubungan antara OD sel dengan aktivitas volumetrik PAc (Gambar 14A), kadar protein (Gambar 14B) dan aktivitas spesifik PAc (Gambar 14C).
24
Gambar 14. Kurva pertumbuhan B. megaterium
btpacBD1( ) dan aktivitas PAc ( ) (A) kadar protein ( ) (B) dan aktivitas spesifik PAc ( ) (C) dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi 150 rpm selama 48 jam.
25 Gambar 14A dan 14B menunjukkan bahwa aktivitas enzim PAc dan kadar protein mulai terbentuk pada fase log dan meningkat secara signifikan pada fase kematian (jam ke-48) yaitu masing-masing sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL dan 0.0078 ± 0.0008 mg/mL. Gambar 15C menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim PAc tertinggi terjadi pada fase log yaitu sebesar 1260.521 ± 27.5711 U/mg dan pada fase selanjutnya mengalami penurunan yang signifikan.
Analisa Bioinformatika Sinyal Peptida pada Gen btpac-bd1
Data hasil prediksi analisa bioinformatika menggunakan software signalP
version 4.1 pada gen btpac-bd1 disajikan pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil prediksi sinyal peptida pada gen btpac-bd1
Gambar 15 menjelaskan bahwa keberadaan sinyal peptida yang berkaitan dengan proses sekresi enzim PAc pada B. megaterium btpacBD1 tidak terdeteksi atau sangat lemah.
Pembahasan
Deteksi Plasmid Rekombinan pMMbtpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid dan PCR
PAc rekombinan diperoleh dengan cara kultivasi menggunakan isolat
Bacillus megaterium btpacBD1. Untuk memastikan keberadaan plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1 di dalam B. megaterium btpacBD1 rekombinan, maka perlu dilakukan uji keberadaan plasmid rekombinan tersebut dengan ekstraksi plasmid dan PCR. Media seleksi dalam penelitian ini yaitu media LB yang sudah ditambahkan tetrasiklin (tc) 1% dari total volume (LB cair-tet).
26
Tetrasiklin (tc) berfungsi sebagai antibiotik yang digunakan untuk menyeleksi bakteri rekombinan sehingga hanya B. megaterium btpacBD1 rekombinan yang dapat tumbuh dalam media ini karena plasmid pMM1525 yang digunakan sebagai vektor mempunyai gen penyandi resisten tc. Oleh karena itu, penambahan tc pada media dilakukan agar dapat menyeleksi bakteri rekombinan yang membawa plasmid, mempertahankan sifat resistensi dan mencegah kontaminasi, sehingga bakteri yang tumbuh dalam media produksi adalah bakteri yang mengandung plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1.
Sebelum melakukan ekstraksi plasmid rekombinan, perlu dilakukan seleksi mikroba B. megaterium btpacBD1 menggunakan marka genetik di dalam media LB padat-tet. Koloni tunggal yang tumbuh diduga membawa plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1. Koloni tunggal akan diproses untuk mengekstraksi plasmid rekombinan. Ekstraksi plasmid dilakukan karena pita tunggal tidak tervisualisasi saat proses PCR koloni dilakukan.
Koloni tunggal diinokulasi pada media LB cair-tet pada inkubator kocok pada suhu 37°C agitasi 70 rpm selama 20-24 jam hingga OD sel mencapai 0.6-0.8 pada panjang gelombang 578 nm (fase eksponensial). Selanjutnya, kultur disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan endapan diproses untuk mengekstraksi plasmid rekombinan.
Ekstraksi plasmid dilakukan dengan metode lisis alkali. Metode ini digunakan karena sel B. megaterium tidak dapat lisis jika dilakukan tanpa penambahan lisozim, tidak seperti sel E coli yang dapat lisis hanya dengan pemanasan di dalam buffer (Laemmli 1970).
Sel dipanen pada fase eksponensial karena sel bakteri relatif masih muda, sehingga memudahkan pemecahan membran sel. Lisis sel bakteri dilakukan secara kimia menggunakan lisozim yang merupakan suatu senyawa yang dapat merusak protein tanpa merusak molekul DNA maupun RNA. Proses lisis sel ini dipercepat dengan penambahan NaOH-SDS, yang akan menghilangkan molekul lipid sehingga membran sel perlahan akan pecah.
Sebagian besar protein dan RNA tidak larut sehingga penambahan larutan PCI diharapkan dapat mengekstrak protein dan memurnikan DNA. DNA dipisahkan dari debris sel dan protein melalui ekstraksi menggunakan larutan CI. Kloroform akan mendenaturasi protein dan melarutkan lipid serta memisahkan fase organik dan fase air dan pemisahan kedua fase ini disempurnakan oleh isoamilalkohol. Presipitasi protein akan terjadi tetapi DNA dan RNA tetap berada dalam fase air. Selanjutnya RNase akan mendegradasi molekul RNA (Susanti dan Ariani 2004).
Keberhasilan reaksi PCR dapat dipengaruhi oleh konsentrasi komponen seperti enzim DNA polimerase, DNA cetakan, primer, dNTP, buffer, serta kondisi reaksi PCR (Sambrook dan Russell 2001). Komposisi campuran PCR yang digunakan terdiri dari 0.5 µL primer xyl3 10 M, 0.5 µL primer xyl4 10 M, 5.0 µL 10x KAPA Buffer (B) with Mg2+, 0.5 µL dNTP, 0.2 µL KAPA Tag polymerase, 2,0 µL hasil ekstraksi sel dan 41.3 µL ddH2O steril.
Cetakan DNA (DNA template) yang digunakan dalam proses PCR adalah plasmid rekombinan hasil ektraksi yang mengandung gen pac. Menurut Sambrook dan Russell (2001), cetakan DNA yang digunakan dalam proses PCR dapat berupa bagian dari DNA genomik, fragmen DNA, plasmid rekombinan atau sampel lain yang mengandung DNA.
27 Primer yang digunakan dalam reaksi PCR yaitu primer forward (xyl3) dan primer reverse (xyl4). Kedua primer ini merupakan primer spesifik gen pac
sehingga hanya plasmid yang mengandung gen pac saja yang dapat teramplifikasi dan menghasilkan fragmen DNA. Primer akan memotong rantai DNA antara 18-24 nukleotida yang dirancang berpasangan dengan rantai DNA template.
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) digunakan sebagai sumber nukleotida dalam reaksi PCR. KAPA Taq polymerase memiliki keaktifan dalam suhu tinggi, sehingga penambahan enzim tidak perlu dilakukan pada setiap siklus. Komponen lain seperti 10x buffer with Mg2+ berperan sebagai buffer untuk mempertahankan kestabilan pH. Sedangkan Mg2+ berperan sebagai kofaktor DNA
Taq polymerase. Air ddH2O steril ditambahkan sebagai pelarut.
Siklus PCR yang digunakan dalam penelitian adalah sebanyak 30 siklus. Menurut Yuwono (2006), umumnya PCR dilakukan dengan mengulang siklus reaksi sebanyak 20–30 siklus. Jika siklus terlalu banyak, konsentrasi produk yang tidak spesifik akan meningkat, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.
Tahapan dalam PCR terdiri dari pra denaturasi, denaturasi, annealing dan
extension (polimerisasi). Pra denaturasi dilakukan diawal reaksi pada suhu 95°C selama 5 menit untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifkan DNA Taq Polymerase. Tahap denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit akan membuka untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA. Hal ini disebabkan oleh tingginya suhu denaturasi sehingga ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen terputus. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan.
Selanjutnya annealing yaitu saat penempelan primer pada cetakan DNA berjalan pada 61°C selama 35 detik. Suhu annealing mempengaruhi kespesifikan penempelan primer. Pada tahap ini, primer xyl3 dan primer xyl4 akan menuju daerah yang spesifik yang memiliki komplemen dengan primer dan ikatan hidrogen akan terbentuk.
DNA Taq polymerase akan membentuk ikatan hidrogen yang sangat kuat dan tidak akan terputus apabila terjadi reaksi polimerisasi. Nilai temperature of melting (Tm) adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA mengalami denaturasi (Yuwono 2006). Primer untuk PCR yaitu xyl3 dan xyl4 memiliki nilai Tm masing-masing 61°C dan 60.4°C. Proses extension pada suhu 720C selama 2 menit. Primer yang telah menempel akan mengalami pemanjangan oleh DNA polimerase sehingga menghasilkan dua pasang untai ganda.
Pita tunggal hasil elektroforesis dihasilkan karena etidium bromida (EtBr) akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan EtBr akan memendarkan sinar ultraviolet, jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA. Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan fragmen DNA gen btpac-bd1 hasil amplifikasi PCR berukuran antara 2000 bp dan 3000 bp (Gambar 4). Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Leonita (2013) dan Putri (2013) yang menyatakan bahwa pita tunggal hasil PCR koloni B. megaterium
BD1 dan CC1 rekombinan menunjukkan gen btpac-bd1 dan gen btpac-cc1 adalah fragmen DNA berukuran diatas 2000 pb. Sekuen nukleotida dari 2397 p bfragmen DNA penyandi penisilin asilase B. thuringiensis BD1 telah didepositkan pada
28
Menurut Wittman dan Krull (2010), ukuran pMM1525 adalah 7462 pb. Selanjutnya, konstruksi plasmid rekombinan menghasilkan konstruk pMM btpac-bd1 yang berukuran 9769 pb (Nurhayati 2009). Namun plasmid pMMbtpac-bd1
hasil ekstraksi menghasilkan pita tunggal yang berukuran lebih dari 10 kb. Kontrol positif plasmid pMMbtpac-bd1 memberikan 3 larik. Ketiga larik tersebut menunjukkan adanya berbagai bentuk konformasi DNA plasmid. Oleh karena itu, ukuran plasmid pMMbtpac-bd1 yang lebih dari 10 kb mungkin disebabkan oleh konformasi rilex open circular pMMbtpac-bd1. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Susanti dan Ariani (2004) yang menyatakan bahwa molekul DNA plasmid pHB201 memberikan 2 larik. Larik yang berada paling bawah adalah
super coiled monomer DNA,sedangkan pita paling atas merupakan DNA plasmid dengan konformasi rilex open circular. DNA plasmid memiliki konformasi
covalently closed circular (ccc).
Optimasi Media dengan metode Central Composite Design
Untuk mengevaluasi secara empiris hubungan antara suatu kelompok peubah dari suatu percobaan dan respon yang terukur berdasarkan kriteria tertentu dapat dilakukan suatu metode permukaan respon (Adinayarana dan Ellaiah 2002). Pengaruh peubah yang akan diuji terhadap proses perlu diketahui untuk mendekati model yang lebih mendekati kenyataan. Analisis lack of fit dilakukan untuk menunjukkan bahwa model yang dihasilkan adalah benar telah mewakili respon permukaan.
Produksi PAc rekombinan menggunakan modifikasi media Yang et al.
(2006) yang ditambahkan 1% tetrasiklin (12.5 mg/mL) dengan variasi xilosa dan CaCl2 yang berbeda (Lampiran 6). Media diatur pada pH 7 yang merupakan kondisi optimal untuk pertumbuhan bakteri. Proses kultivasi berlangsung pada suhu 28°C agitasi 180 rpm selama 48 jam. Hasil analisa permukaan respon (Gambar 7 dan 8) menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 berhubungan langsung dengan enzim PAc yang disintesis B. megaterium btpacBD1.
Enzim yang diperoleh yaitu PAc rekombinan merupakan enzim yang bersifat dapat diinduksi, karena bakteri akan mengekspresikan gen penyandi pembentukan enzim PAc secara berlebih jika pada media ditambahkan senyawa penginduksi yaitu xilosa. Plasmid pMM1525 mengandung promotor gen xilosa isomerase (xylA) yang kuat, sehingga penambahan induser spesifik yaitu xilosa dapat mendorong promotor gen xylA untuk meningkatkan produksi enzim rekombinan yang lebih tinggi (Yang et al. 2006). Penambahan penginduksi dengan jumlah yang tepat dapat meningkatkan produktivitas PAc rekombinan dari
B. megaterium btpacBD1, tetapi jika konsentrasi penginduksi yang diberikan terlalu banyak, maka akan menyebabkan inhibisi terhadap bakteri itu sendiri. Plasmid pMM1525 mengandung gen xylose-dependent repressor (xylR) yang merupakan gen pengkode protein represor yang menghambat transkripsi gen pac
jika tidak terdapat xilosa Dengan adanya gen xylR, protein represor yang dihasilkan akan semakin banyak, sehingga pengontrolan ekspresi gen juga akan semakin kuat. Setelah suatu induser yang berupa xilosa ditambahkan ke media, maka xylose repressor pada plasmid akan dibebaskan dengan menginaktivasi protein represor dengan cara berikatan dengan protein represor tersebut. Protein represor yang tidak aktif tidak dapat berikatan dengan operator sehingga RNA
29 polimerisase sel inang B. megaterium akan mentranskripsi sekuen gen yang berada di bawah sekuen promotor xylA yang memungkinkan terjadinya transkripsi gen pac jika diinduksi oleh xilosa. Hasil transkripsi tersebut kemudian ditranslasi menjadi protein rekombinan yang diinginkan (MoBiTec 2007).
Sedangkan Ca2+ merupakan kation bivalen yang merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang mempermudah interaksi dengan substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim (Susanti 2003). Hal ini berdasarkan penelitian Duggleby et al. (1995) yang menunjukkan bahwa Ca2+ mempengaruhi formasi dari enzim PAc aktif. Hal ini diperkuat oleh (Kasche et al. 2005: Ignatova et al. 2005) yang menyatakan bahwa Ca2+ adalah kofaktor untuk translokasi membran yang berperan dalam pelipatan