UjiIn vitro
Karakterisasi Isolat Bakteri
Karakterisasi bakteri merupakan tahap yang penting untuk memastikan isolat bakteri yang digunakan merupakan isolat bakteri yang diinginkan. Karakterisasi bakteri dapat dilakukan dengan mengamati morfologi koloni dan sifat biokimia bakteri, menggunakantestkit, ataupun secara molekuler (Suryani et al. 2010). Hasil karakterisasi bakteri patogen dan probiotik berdasarkan sifat morfologi dan biokimia (Tabel 3) menunjukkan bahwa isolat bakteri yang digunakan merupakan isolat patogen A. hydrophila (SNI 7309: 2009) dan probiotikBacillus(P4I1 dan P4I2) (Cowan 1974).
Pemberian Penanda Resistensi Antibiotik
Pemberian penanda resisten antibiotik pada isolat bakteri digunakan untuk memantau keberadaan bakteri tersebut pada lingkungan pemeliharaan (Widanarni
et al. 2004; Bolstridge et al.2009). Antibiotik yang digunakan adalah rifampisin 100μ g/mL. Sebelumnya dilakukan pengukuran zona hambat menggunakan disk rifampisin 5μ g untuk mengetahui sensitivitas masing-masing isolat bakteri terhadap antibiotik rifampisin. Hasil pengukuran zona hambat (Gambar 1) menunjukkan bahwa seluruh isolat bakteri yang digunakan (patogen dan probiotik) sensitif terhadap antibiotik rifampisin dengan diameter zona hambat sebesar 27 mm (A. hydrophila), 25 mm (probiotik Bacillus P4I1) dan 22 mm Tabel 3 Hasil karakterisasi isolat bakteri patogenA. hydrophiladan probiotik
Bacillusberdasarkan morfologi koloni dan sifat biokimia
Media
Morfologi Koloni dan Sifat Biokimia Bentuk
Sel Gram
Jenis Bakteri Warna Elevasi Tepian Motil Katalase Oksidase
TSA Krem Cembung Halus + + + Batang
pendek
Negatif (-)
A. hydrophila
RS Kuning Cembung Halus + + + Batang
pendek
Negatif (-)
TSA Putih Cembung Halus + + - Batang Positif
(+)
Bacillus (P4I1)
TSA Putih Cembung Halus + + - Batang Positif
(+)
Bacillus (P4I2)
(probiotik Bacillus P4I2) (NCCLS 2002). Hasil penelitian Costa dan Cyrino (2006) menyebutkan bahwa bakteri A. hydrophila sensitif terhadap antibiotik chloramphenicol, gentamicin, kanamycin, nitrofurantoin, norfloxacin, rifampicin, streptomycin, trimetoprim+sulphamethoxazole. Sedangkan bakteri Bacillus
sensitif terhadap antibiotik chlorampenicol, novobiocin, rifampicin, tetrasiklin, dan neomycin (Honget al.2004).
Gambar 1 Zona hambat yang terbentuk terhadap antibiotik rifampisin (A. A. hydrophila, B.BacillusP4I1,C.BacillusP4I2)
Resistensi antibiotik merupakan sifat bakteri yang menunjukkan kebal atau tahan terhadap antibiotik tertentu (Byarugaba 2010). Resistensi antibiotik dapat terjadi melalui dua proses yaitu resistensi yang terjadi karena mutasi spontan dalam kromosom serta resistensi yang dikarenakan perpindahan plasmid. Resistensi pada kromosom bersifat lebih stabil dan tidak dapat dipindahkan secara horisontal pada bakteri lain, sedangkan resistensi plasmid bersifat tidak stabil/mudah hilang serta mudah ditransfer pada bakteri lain yang belum memiliki gen tersebut (Cruzet al.2012).
Mekanisme resistensi terhadap rifampisin terjadi karena bakteri mengubah struktur sub unit β-RNA polimerase yang dikode oleh gen rpo B sehingga merusak dan mematikan situs tersebut (Montoya et al. 2007). Bockstael dan Aerschot (2009) menambahkan bahwa sejumlah mekanisme terjadi saat bakteri mengembangkan sifat resistensinya terhadap rifampisin yang akhirnya dapat memodifikasi gugus hidroksil dan mengganggu pengikatan RNA polimerase. Lebih lanjut, Hong et al. (2004), menyatakan bahwa resistensi bakteri terhadap antibiotik rifampisin bersifat stabil sampai 200 generasi. Hal ini juga terjadi pada bakteri A. hydrophila (Janda dan Scoot 2010) dan Bacillus (Nicholson dan Maughan 2002, Tupinet al.2009).
A
Hasil uji penghambatan bakteri probiotik Bacillus RifR terhadap A. hydrophilaRifR dapat dilihat pada Tabel 4. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi terbaik dari probiotik Bacillus RifR dan gabungan keduanya setelah diuji tantang dengan A. hydrophila RifR secara in vitro adalah pada konsentrasi 104CFU/mL. Hasil tersebut kemudian dijadikan acuan pada pengujian probiotik secarain vivo. Pada hasil pengujian kombinasi isolat probiotik BacillusP4I1 RifR dan Bacillus P4I2 RifR pada media TSA, tidak menunjukkan adanya aktivitas antagonis yang ditunjukkan dengan tidak adanya zona hambat yang dihasilkan. Dengan demikian kedua isolat probiotik dapat digunakan secara bersamaan untuk menghambat pertumbuhanA. hydrophilaRifR.
Hasil uji bakteri probiotik Bacillusterhadap A. hydrophila secara in vitro
menunjukkan bahwa isolat probiotik Bacillus P4I1 RifR, Bacillus P4I2 RifR dengan kepadatan 104CFU/mL dan kombinasi (BacillusP4I1 RifR104CFU/mL+
Bacillus P4I2 RifR 104 CFU/mL) mampu menghambat populasi A. hydrophila
RifR. Jumlah populasi A. hydrophila tanpa pemberian probiotik adalah 1010CFU/mL, sedangkan jumlah populasiA. hydrophilapada perlakuan probiotik berada pada kisaran 104 – 106 CFU/mL. Hal ini diduga disebabkan adanya senyawa ekstraseluler yang dihasilkan oleh Bacillus. Defoirt et al. (2010) menyatakan bahwa Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, dan
Bacillus thuringiensis terbukti menghasilkan senyawa N-acylhomoserine lactone
yang dapat mencegah terjadinya quorum sensing dari A. hydrophila, A.
Tabel 4 Penghambatan bakteri probiotikBacillusterhadapA. hydrophilasecara
in vitro
Perlakuan
ProbiotikBacillus
(CFU/mL) A. hydrophilaRif
R
(CFU/mL)*
A. hydrophilaRifR (CFU/mL)** P4I1 RifR P4I2 RifR
A 103 -103 1010 104 - 104 105 - 106 106 - 108 B - 103 103 1010 - 104 106 - 105 106 - 106 108 C 103 103 103 1010 104 104 104 105 105 104 106 106 108 D - - 103 1010 E 104 104 - Tidak bersifat antagonistik
* : kepadatanA.hydrophilayang diinokulasikan
salmonicida, Edwardsiella tarda, dan Vibrio salmonicida. Penelitian lain juga menyebutkan bahwa secara in vitro, probiotik Bacillus dapat menghambat pertumbuhan A. hydrophila. (Sansawat dan Thirabuyanon 2009; Al-Faragi dan Alsapar 2012).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi probiotik yang lebih tinggi (106CFU/mL) menghasilkan aktivitas penghambatan yang kurang optimal dibandingkan konsentrasi 104 CFU/mL. Hasil yang sama juga ditunjukkan oleh Widanarniet al.(2010), yaitu penambahan bakteriVibrioSKT-b dengan dosis 106 CFU/mL menunjukkan nilai kelangsungan hidup larva udang windu (Penaeus monodon) yang lebih rendah dibandingkan dosis 104CFU/mL. Nikoskelainen et al. (2001) mengemukakan bahwa penggunaan probiotik dalam dosis tinggi ternyata tidak menjamin perlindungan yang lebih baik terhadap hewan inang. Hal ini diduga karena adanya persaingan nutrisi dan oksigen yang tinggi dalam media sehingga menyebabkan keseimbangan bakteri didalamnya terganggu.
UjiPostulat Koch
Jumlah kematian ikan setelah diinfeksi dengan patogen A. hydrophila
dapat dilihat pada Tabel 5. Hasil uji Postulat Koch I menunjukkan bahwa terjadi kematian mulai pada jam ke-18 pascainfeksi dan pada jam ke-24 terjadi kematian 100% pada ikan lele dumbo. Hasil isolasi bakteri pada media R-S (Gambar 2) dari ikan yang menunjukkan gejala klinis kemudian disuntikkan kembali pada ikan sehat untuk uji Postulat Koch II. Pada uji Postulat Koch II menghasilkan kematian pada ikan lele dumbo mulai pada jam ke-17 pascainfeksi dan terjadi kematian 100% ikan lele dumbo pada jam ke-22.
Tabel 5 Kematian ikan lele dumbo pasca infeksiA. hydrophilapada ujiPostulat Koch
Postulat
Koch Jumlah ikan yang mati (ekor)
17 jam 18 jam 19 jam 20 jam 21 jam 22 jam 23 jam 24 jam I - 1 - 1 2 3 2 1 II 1 1 - 2 4 2 -
-Ikan yang terinfeksi A. hydrophila menunjukkan gejala klinis yaitu terdapat luka/borok pada permukaan kulit. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gardeniaet al.(2010) yaitu gejala klinis yang terlihat pada ikan yang terserangA. hydrophilaumumnya ditandai dengan adanya hemoragi pada kulit, insang, rongga mulut, dan borok pada kulit. Pada ujiPostulat KochII, terjadi peningkatan jumlah kematian ikan lele dumbo pada waktu yang lebih singkat yaitu 17 jam pascainfeksi A. hydrophila. Pada uji Postulat Koch I, kematian ikan lele dumbo mulai terjadi pada jam ke-18 pascainfeksi A. hydrophila. Hal ini menandakan terjadinya peningkatan virulensi bakteri A. hydrophila terhadap ikan lele dumbo. Mangunwardoyo et al. (2010) menyebutkan bahwa peningkatan virulensi bakteri disebabkan karena bakteri tersebut memproduksi toksin dalam tubuh ikan, sedangkan penurunan virulensi bakteri disebabkan oleh beberapa faktor
dalam sel bakteri menurun bahkan hilang. Selain itu, kandungan nutrien dalam media juga mempengaruhi patogenisitas dan aktivitas bakteri. Hasil penelitian Sarkar dan Rashid (2012) menunjukkan bahwa patogenisitas A. hydrophila
berbeda-beda pada ikan Heteropneustes fossilis, Clarias batrachus, Labeo rohita, Catla catla, Cirrhinus cirrhosus, dan Anabas testudineus serta menunjukkan kematian 60-100% setelah 2-11 hari pascainfeksi. Yulianto et al. (2013) menambahkan bahwa terjadi kerusakan jaringan organ yang semakin parah seiring dengan meningkatnya konsentrasi bakteri A. hydrophila yang disuntikkan pada ikan komet (Carassius auratus).
Gambar 2 BakteriA. hydrophilapada media RS hasil ujiPostulat KochI
UjiIn vivo
Penelitian tahap akhir ini merupakan uji biologis probiotikBacillus untuk menekan pertumbuhan A. hydrophila dan mencegah serangan penyakit Motile Aeromonads Septicemia pada ikan lele dumbo. Parameter yang diamati selama penelitian ini yaitu:
Tingkat Kelangsungan Hidup/Survival Rate(SR)
Tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo dapat dilihat pada Gambar 3. Berdasarkan pengamatan tingkat kelangsungan hidup ikan selama 30 hari perlakuan, diketahui bahwa perlakuan dengan pemberian probiotik Bacillus P4I1 RifRdan perlakuan kombinasi probiotik (BacillusP4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) menunjukkan tingkat kelangsungan hidup yang signifikan lebih tinggi dibanding perlakuan Bacillus P4I2 RifR, kontrol negatif (K-), dan kontrol positif (K+) (P<0.05). Selain itu, perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I2 RifR juga menunjukkan hasil yang berbeda nyata terhadap kontrol (+) (P<0.05).
Tingginya tingkat kelangsungan hidup pada perlakuan Bacillus P4I1 RifR dan kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR + Bacillus P4I2 RifR) dibandingkan perlakuan lain (Bacillus P4I2 RifR dan kontrol) diduga karena jumlah A. hydrophila dalam media pemeliharaan semakin menurun karena pengaruh pemberian probiotik. Hal ini sejalan dengan hasil uji in vitro yang menunjukkan bahwa penghambatan A. hydrophila oleh probiotik Bacillus P4I1 RifR dan kombinasi (Bacillus P4I1 RifR + Bacillus P4I2 RifR) lebih baik dibandingkan probiotik Bacillus P4I2 RifR. Selain itu, jumlah A. hydrophila pada perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I1 RifR dan perlakuan kombinasi probiotik
(Bacillus P4I1 Rif + Bacillus P4I2 Rif ) semakin menurun sampai akhir penelitian dibandingkan pada perlakuan lain (BacillusP4I2 RifRdan kontrol).
a b a c b 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 P 4 I 1 P 4 I 2 K o m K + K -K e l a n g s u n g a n h i d u P erla k u a n
Ket: Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 3 Kelangsungan hidup ikan lele dumbo (C. gariepinus) pada perlakuan probiotik Bacillus P4I1 RifR,Bacillus P4I2 RifR, Kom (Bacillus P4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Penggunaan probiotikBacillusdapat meningkatkan kelangsungan hidup dan pertumbuhanzoeadanmysisudang putih (Litopenaeus vannamei) terutama ketika probiotik ditambahkan dalam media pemeliharaan dibandingkan lewat pakan mikro-alga (Silva et al. 2013). Hasil penelitian Baskar dan Kannan (2009) menyebutkan bahwa probiotik Bacillus sp., dan Bacillus cereus yang diaplikasikan pada media pemeliharaan dapat menghambat pertumbuhan Vibrio
pada media pemeliharaan larva udang windu (Penaeus monodon) serta meningkatkan nilai ketahanan hidup larva udang windu tersebut. Hasil penelitian lain menyebutkan bahwa probiotik Lactobacillus plantarum yang diaplikasikan lewat media pemeliharaan juga efektif untuk meningkatkan kelangsungan hidup, aktivitas enzim dan memperbaiki kualitas air pada budidaya kepiting Portunus pelagicus(Talpuret al.2013).
Laju Pertumbuhan Harian
Laju pertumbuhan harian ikan lele dumbo ditampilkan pada Gambar 4. Berdasarkan pengamatan laju pertumbuhan ikan selama 30 hari perlakuan, diketahui bahwa perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I1 RifRmenunjukkan laju pertumbuhan yang signifikan lebih tinggi dibanding perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I2 RifR dan kontrol positif (K+) (P<0.05), akan tetapi tidak berbeda signifikan dengan perlakuan pemberian kombinasi probiotik (Bacillus
P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) dan kontrol negatif (K-) (P>0.05). Selain itu, perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I2 RifR tidak berbeda nyata dengan seluruh perlakuan kecuali perlakuan pemberian probiotik Bacillus P4I1 RifR (P>0.05).
hydrophiladalam air setelah pemberian probiotikBacillusP4I1 RifR, maka sistem imun dalam tubuh ikan dapat meningkat yang disertai dengan peningkatan pertumbuhan. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Sun et al. (2010) yang menyebutkan bahwa probiotik jenis Bacillus pumilus dan Bacillus clausii dapat meningkatkan performa pertumbuhan dan respons imun ikan Epinephelus coloides. Ziaei-Nejad et al. (2005) menyatakan bahwa probiotik Bacillus spp. yang diaplikasikan lewat media pemeliharaan dapat meningkatkan pertumbuhan dan tingkat kelangsungan hidup udang putih India (Fenneropenaeus indicus).
a b a b b c a b 0 0 ,2 0 ,4 0 ,6 0 ,8 1 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 P 4 I 1 P 4 I 2 K o m K + K -L a j u p e r t u m b u h a n h a r P e r la k u a n
Ket: Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 4 Laju pertumbuhan ikan lele dumbo (C. gariepinus) pada perlakuan probiotikBacillus P4I1 RifR,Bacillus P4I2 RifR, Kom (Bacillus P4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Selain itu, peningkatan pertumbuhan diduga juga disebabkan karena penurunan tingkat stres ikan terhadap faktor kualitas air. Sehingga energi dari pakan yang masuk dalam tubuh ikan sebagian besar diarahkan untuk pertumbuhan. Fu et al. (2007) menyebutkan bahwa energi yang masuk dalam tubuh ikan yang berasal dari pakan akan sebagian besar digunakan untuk metabolisme, sebagian lagi digunakan untuk pertumbuhan dan sisanya dibuang dalam bentuk feses. Stres pada ikan menyebabkan penurunan pertumbuhan, tingkah laku yang abnormal, penurunan sistem imun ikan dan resistensi terhadap penyakit (Lupatsch et al. 2010). Faktor penyebab stres pada ikan dapat berasal dari kualitas air (Luzet al. 2008, Brogowskiet al.2005, Mallya 2007), kepadatan (Naserizadehet al. 2013) serta proses penanganan dan pengangkutan yang buruk (Adeyemoet al.2009).
Total Bakteri pada Media Pemeliharaan
Hasil penghitungan jumlah bakteri probiotik dan patogen pada media pemeliharaan dapat dilihat pada Gambar 5. Populasi bakteri pada media pemeliharaan ikan pada semua perlakuan berada pada kisaran 103-104 CFU/mL (Gambar 5a). Hasil penelitian menunjukkan bahwa total Bacillus RifR (Gambar
5b) mengalami peningkatan seiring dengan lamanya waktu perlakuan. Total
Bacillus RifR tertinggi terdapat pada perlakuan Bacillus P4I1 RifR, kemudian diikuti oleh perlakuan kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR + Bacillus P4I2 RifR), dan BacillusP4I2 RifR. Adapun hasil penghitungan populasi A. hydrophila
(wild type dan RifR) pada perlakuan probiotik menunjukkan pola penurunan dari 103 CFU/mL pada awal penelitian menjadi 102 CFU/mL pada akhir penelitian. Sedangkan populasi A. hydrophila pada perlakuan kontrol (+) menunjukkan hasil yang tetap tanpa terjadi penurunan (Gambar 5c dan 5d).
Gambar 5 Kelimpahan bakteri pada media pemeliharaan ikan lele dumbo pada perlakuan probiotikBacillusP4I1 RifR,BacillusP4I2 RifR, Kom (BacillusP4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Populasi bakteri di media pemeliharaan pada semua perlakuan berfluktuasi selama pengamatan (Gambar 5a). Hal ini diduga karena faktor lingkungan (DO dan pH) serta kandungan nutrien dalam media pemeliharaan yang berfluktuasi. Uddin dan Al-Harbi (2012) menyatakan bahwa jumlah bakteri dalam kolam budidaya bervariasi tergantung suhu, salinitas, oksigen terlarut, pH, dan total padatan terlarut/Total Dissolved Solids(TDS).
Total probiotikBacillusRifR(Gambar 5b) menunjukkan peningkatan pada semua perlakuan probiotik. Hal ini menunjukkan bahwa probiotik Bacillus RifR mampu tumbuh dan berkembang dalam media pemeliharaan. Menurut George et al.(2011) bakteriBacillusdapat ditemukan pada air dan sedimen. Hasil penelitian Al-Harbi dan Uddin (2010) menyatakan bahwa 6.25% dari total bakteri pada media pemeliharaan ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) dan 5.44% dari total bakteri pada kolam budidaya polikultur ikan mas (Cyprinus carpio) dan ikan lele
b a
Keberadaan Bacillus dalam air tersebut diduga yang berperan dalam menekan jumlahA. hydrophila.
PopulasiA. hydrophilapada seluruh perlakuan sudah terdeteksi pada awal pengamatan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri A. hydrophila merupakan bakteri oportunistik yang dapat ditemukan pada lingkungan perairan (Sharma et al. 2009). Pada perlakuan probiotik Bacillus P4I1 RifR, penurunan populasi A. hydrophila lebih cepat dibanding perlakuan probiotik Bacillus P4I2 RifR dan kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR + Bacillus P4I1 RifR) serta perlakuan kontrol positif (K+). Hal ini menunjukkan kemampuan penghambatan pertumbuhan A. hydrophila oleh probiotik Bacillus P4I1 RifR lebih baik dibandingkan probiotik Bacillus P4I2 RifR dan sejalan dengan hasil uji in vitro
dimana probiotik Bacillus P4I1 RifR menunjukkan kemampuan menghambat A. hydrophila yang lebih baik dibandingkan probiotik Bacillus P4I2 RifR. Hasil penelitian Purivirojkul dan Areechon (2007) menunjukkan bahwa Bacillus yang diisolasi dari saluran pencernaan udang Penaeus monodon dapat menghambat pertumbuhan A. hydrophila, Streptococcus agalactiae dan Vibrio harveyi dalam air. Lebih lanjut Murillo dan Villamil (2011) menambahkan bahwa penghambatan pertumbuhan A. hydrophila oleh Bacillus dikarenakan bakteri ini menghasilkan enzim antara lain esterase lipase, leucine arylamidase, acid phosphatase, lipase, dan Naphthol-AS-BI- phosphohydrolase.
Gambaran Darah Total Eritrosit
Pemeriksaan total eritrosit bertujuan untuk mengetahui kondisi kesehatan ikan dengan cara menghitung total eritrosit dalam darah (Alamanda et al. 2007). Hasil pengamatan terhadap total eritrosit dalam penelitian ini ditampilkan pada Gambar 6.
Ket: Huruf yang berbeda pada pola yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 6 Total eritrosit darah ikan lele dumbo pada pada perlakuan probiotik
Bacillus P4I1 RifR, Bacillus P4I2 RifR, Kom (Bacillus P4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Berdasarkan Gambar 6 terlihat bahwa pada awal penelitian (H0), jumlah eritrosit ikan masih sama pada setiap perlakuan yaitu sebesar 1.518±0.00 x106 sel/mL kemudian terjadi penurunan pada hari ke-7 pasca penambahan A. hydrophila dalam air. Namun, pada hari-hari berikutnya terlihat peningkatan jumlah eritrosit sampai akhir penelitian kecuali pada perlakuan kontrol negatif (K-).
Pada hari ke-7 terjadi penurunan eritrosit pada semua perlakuan dengan nilai terendah pada perlakuan kontrol positif (K+) yaitu sebesar 0.955±0.02 x106 sel/mL; disusul oleh perlakuan probiotik Bacillus P4I2 RifR, kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR+ Bacillus P4I2 RifR ), BacillusP4I1 RifR dan kontrol negatif (K-) dengan masing-masing 1.259±0.07 x106 sel/mL; 1.412±0.08 x106 sel/mL; 1.445±0.04 x106 sel/mL dan 1.585±0.01 x106 sel/mL. Berdasarkan uji lanjut Duncan diketahui bahwa pada hari ke-7 terdapat beda nyata antaraBacillus P4I1 RifR, kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) dan Bacillus
P4I2 RifR dengan kontrol positif (K+). Penurunan nilai eritrosit ini diduga karena adanya produk ekstraseluler yang dihasilkan oleh A. hydrophila antara lain aerolysin dan hemolisin (Yousr et al. 2007). Produk ini berkaitan dengan tingkat virulensi dari bakteri tersebut. Aerolysin dan hemolisin menunjukkan aktivitas hemolisis secara in vitromenggunakan media agar darah (Blood agar) (Chirila et al. 2008). Toksin ini bekerja membunuh sel dengan membentuk struktur heptametrik yang dapat melubangi membran plasma (Iacovache et al. 2006, Knappet al.2010).
Setelah terjadi penurunan eritrosit pada hari ke-7, selanjutnya jumlah eritrosit berangsur-angsur naik sampai akhir penelitian. Kenaikan jumlah eritrosit mencapai nilai tertinggi pada akhir penelitian dan terjadi pada perlakuan probiotik
Bacillus P4I2 RifR yaitu sebesar 2.291±0.03 x106 sel/mL; kemudian disusul dengan perlakuan probiotik Bacillus P4I1 RifR (1.862±0.02 x106 sel/mL); kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) (1.819±0.00 x106 sel/mL); K+ (1.513±0.06 x106 sel/mL) dan K- (1.513±0.08 x106 sel/mL). Peningkatan jumlah eritrosit ini diduga karena efek pemberian probiotik. Hasil penelitian Sharma et al. (2013) menyebutkan bahwa pemberian probiotik komersial dapat meningkatkan total eritrosit pada ikanCirrhinus mrigalaHam.
Total Leukosit
Respon imun pada ikan teleostei terdiri dari respon imun non spesifik dan respon imun spesifik. Respon imun tersebut diperankan oleh sel darah putih atau leukosit yang terdiri dari limfosit untuk pertahanan spesifik serta monosit dan granulosit untuk pertahanan non spesifik (Magnadottir 2010). Leukosit membantu membersihkan tubuh dari benda asing, termasuk invasi patogen melalui sistem tanggap kebal. Ikan yang sakit akan menghasilkan banyak leukosit untuk memfagosit bakteri dan mensintesis antibodi (Uribe et al. 2011). Hasil pengukuran nilai total leukosit dapat dilihat pada Gambar 7.
Leukosit total darah ikan uji pada awal pengukuran menunjukkan nilai yang sama yaitu 5.698±0.00 x105 sel/mL. Peningkatan leukosit terjadi pada hari ke-7 disemua perlakuan, kecuali kontrol negatif (K-) karena pada perlakuan tersebut tidak diinfeksi dengan A. hydrophila. Hasil uji Duncan menunjukkan bahwa terdapat beda nyata antara perlakuan probiotik Bacillus P4I2 RifR dan kombinasi probiotik (BacillusP4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dengan kontrol. Hari
dengan masing-masing nilai untuk probiotik Bacillus P4I2 RifR, kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR +Bacillus P4I2 RifR), probiotik Bacillus P4I1 RifR, kontrol positif (K+) serta kontrol negatif (K-) adalah 9.12±0.01 x105 sel/mL; 8.709±0.03 x105 sel/mL; 7.943±0.02 x105 sel/mL; 6.918±0.07 x105 sel/mL; serta 6.309±0.02 x105 sel/mL. Hasil uji Duncan menunjukkan berbeda nyata antara perlakuan probiotik Bacillus P4I2 RifR dan kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) dengan kontrol positif (K+). Hal ini menunjukkan bahwa probiotikBacillus P4I2 RifR lebih cepat merangsang sistem imun ikan uji dibandingkan probiotik Bacillus P4I1 RifR. Peningkatan jumlah leukosit pada perlakuan probiotikBacillus P4I2 RifR, kombinasi probiotik (BacillusP4I1 RifR+
BacillusP4I2 RifR) dan BacillusP4I1 RifR diduga karena populasi A. hydrophila
dalam air meningkat sehingga merangsang sistem imun ikan. Picchietti et al.
(2009) menyatakan bahwa sistem imun pada larva Dicentrarchus labrax dapat distimulasi dengan pemberian probiotik Lactobacillus delbrueckii dengan merangsang perpindahan sel T danAcidophilic Granulocytes (AGs) pada lapisan lendir. Selanjutnya Balaji et al. (2012) menyatakan bahwa probiotik L. acidophilusdan B. subtilis dapat meningkatkan total leukosit ikan mas (Cyprinus carpio) setelah diuji tantang denganA. hydrophila.
Ket: Huruf yang berbeda pada pola yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 7 Total leukosit darah ikan lele dumbo pada pada perlakuan probiotik
Bacillus P4I1 RifR, Bacillus P4I2 RifR, Kom (Bacillus P4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Nilai leukosit mengalami penurunan mulai hari ke-21 sampai akhir penelitian, namun dari hasil uji Duncan terlihat bahwa perlakuan probiotik
Bacillus P4I2 RifR (7.244±0.02 x105 sel/mL) dan kombinasi probiotik (Bacillus
P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) (7.413±0.05 x105 sel/mL) berbeda nyata dengan perlakuan kontrol positif (K+) yaitu sebesar 5.888±0.05 x105 sel/mL. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi sistem imun ikan sudah kembali normal karena populasiA. hydrophiladalam media pemeliharaan sudah terkontrol.
Hemoglobin
Hemoglobin (Hb) merupakan bagian dari eritrosit yang bertugas mengangkut oksigen untuk diedarkan ke seluruh tubuh (Souza dan
Bonilla-Rodriguez 2007). Kadar hemoglobin selama penelitian ditampilkan pada Gambar 8.
Nilai hemoglobin pada awal perlakuan menunjukkan nilai yang sama untuk semua perlakuan yaitu sebesar 6.86±0.00 g%. Penurunan nilai hemoglobin pada semua perlakuan terjadi pada hari ke-7. Hasil uji Duncan menunjukkan terdapat beda nyata antara perlakuan probiotik Bacillus P4I2 RifR, probiotik
BacillusP4I1 RifR, kombinasi probiotik (BacillusP4I1 RifR +BacillusP4I2 RifR), kontrol negatif (K-) dan kontrol positif (K+). Nilai masing-masing perlakuan adalah sebesar 6.5±1.3 g%; 5.3±0.8 g%; 5.31±1.5 g%; 6.9±0.7 g%; 5.1±0.9 g%. Penurunan nilai hemoglobin ini diduga disebabkan oleh infeksi A. hydrophila
karena toksin yang dihasilkan. Mohapatra dan Swain (2008) menyebutkan bahwa toksin yang dihasilkan oleh A. hydrophila dapat menyebabkan sel darah merah menjadi lisis dan pendarahan pada kulit serta organ internal ikan. Selanjutnya Saputra et al. (2013) menambahkan bahwa kadar hemoglobin berbanding lurus dengan jumlah eritrosit, semakin tinggi kadar hemoglobin semakin tinggi pula jumlah eritrosit.
Ket: Huruf yang berbeda pada pola yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 8 Kadar hemoglobin darah ikan lele dumbo pada pada perlakuan probiotik Bacillus P4I1 RifR,Bacillus P4I2 RifR, Kom (Bacillus P4I1 RifR+BacillusP4I2 RifR) dan kontrol
Pada hari ke-7, ikan lele dumbo pada semua perlakuan (kecuali K-) mengalami penurunan hemoglobin, selanjutnya nilai hemoglobin berangsur-angsur naik sampai akhir penelitian. Kenaikan jumlah hemoglobin mencapai nilai tertinggi pada akhir penelitian terjadi pada perlakuan probiotik BacillusP4I2 RifR dan probiotik Bacillus P4I1 RifR yaitu sebesar 7.6±0.8 g%; dan 7.5±1.3 g%; kemudian disusul dengan perlakuan kombinasi probiotik (Bacillus P4I1 RifR+Bacillus P4I2 RifR) (6.7±1.55 g%); kontrol negatif (K-) (6.7±0.98 g%) dan kontrol positif (K+) (6.3±0.28 g%). Kenaikan jumlah hemoglobin ini diduga bahwa ikan telah mengalami pemulihan dan dapat beradaptasi dengan kondisi lingkungan. Selain itu, peningkatan kadar hemoglobin pada ikan disebabkan karena sistem imun ikan sudah mulai terbentuk dan ikan mengalami pemulihan dari infeksi. Hasil penelitian Talpur et al. (2014) menyatakan bahwa pemberian
oligosaccharide(GOS) danMannan-oligosaccharide(MOS) dapat meningkatkan kadar hemoglobin ikanChanna striatayang diuji tantang denganA. hydrophila.
Hematokrit
Pemeriksaan hematokrit bertujuan untuk mengetahui kondisi kesehatan