Susu formula lanjutan bubuk merupakan salah satu makanan tambahan pemulihan yang diberikan kepada balita penderita gizi buruk. Bentuk susu bubuk selain disukai oleh anak-anak, juga disukai oleh mikroba terutama bakteri dan kapang sebagai sumber nutrisi. Beberapa bakteri akan hancur pada suhu tinggi selama proses pembuatan susu bubuk, namun bakteri-bakteri pembentuk spora seperti B. cereus dapat bertahan terhadap proses pemanasan. Menurut Fardiaz (1989), bakteri ini bersifat thermodurik yaitu secara alami mempunyai kemampuan untuk resisten terhadap suhu panas sehingga tidak mati oleh proses pasteurisasi.
Pencemaran susu bubuk oleh B. cereus, dapat terjadi melalui debu dan udara yang masuk kedalam susu atau alat pemerah susu dan penanganan susu yang kurang bersih. Bakteri ini dapat membentuk spora pada kondisi lingkungan yang sesuai, misalnya pada makanan yang dibiarkan terlalu lama berada pada suhu kamar setelah dimasak, sehingga spora bakteri bisa tumbuh. apabila dalam jumlah yang cukup banyak (105-107 sel/gram) dapat menyebabkan intoksikasi.
Keberadaan bakteri pada susu bubuk terutama B. cereus dapat dihitung jumlah rata-ratanya dengan menggunakan metode hitungan cawan dan dilakukan uji biokimiawi sebagai uji konfirmasi/uji penegasan terhadap keberadaan B. cereus. Uji biokimiawi yang dilakukan yaitu; uji reduksi nitrat dan motilitas, uji Voges Prokauer, dan uji fermentasi glukosa anaerob. Selain itu, untuk melihat bentuk dari B. cereus dilakukan perwarnaan Gram.
1. Total Plate Count
Sebanyak 48 sampel susu bubuk diperiksa jumlah total bakterinya dengan menggunakan metode hitungan cawan (total plate count) pada media Plate Count Agar (PCA). Pada saat diinkubasi sel-sel mikroba akan memperbanyak diri dengan cepat dalam waktu 18-24 jam sehingga terbentuk massa sel yang disebut koloni. Koloni bakteri yang tumbuh mempunyai berbagai macam bentuk dan ukuran yang merupakan hasil biakan murni ataupun bukan, seperti terlihat pada Gambar 1 berikut ini ;
Gambar 1. Berbagai bentuk dan ukuran koloni pada media PCA Cawan yang mengandung jumlah koloni antara 25 sampai 250 dihitung jumlah mikroba per gram atau mililiter, sehingga akan didapatkan jumlah rata-rata total bakteri yang didapat dari sampel tersebut seperti pada Tabel 1 di bawah ini.
Tabel 1. Jumlah mikroorganisme dengan metode hitungan cawan
Kecamatan Jumlah sampel Rata-rata jumlah koloni (cfu/gram) Caringin 5 1,9 x 103 ± 3,6 x 102 Cijeruk 7 6,9 x101 ± 2,5 x 101 Jasinga 7 2,3 x103 ± 1,9 x 103 KelapaNunggal 5 2,0 x 102 ± 1,3 x 102 Lebakwangi 3 1,0 x 103 ± 1,3 x 102 Nanggung 5 1,2 x 102 ± 4,7 x 101 Parung 5 1,1 x 102 ± 9,3 x 101 Sukajaya 5 1,5 x 102 ± 9,9 x101 Sukamana 4 6,0 x 102 ± 1,1 x 102 Tenjolaya 2 8,3 x 101 ± 6,7 x 101 Jumlah 48 6,5 x 102 ± 2,9 x 102
Berdasarkan SNI 01-6366-2000 mengenai batas maksimum cemaran mikroba pada susu bubuk adalah 5x104 cfu/gram. Apabila mengkonsumsi makanan dengan kontaminan mikroba lebih dari 5x104 cfu/gram dapat menyebabkan gangguan pada tubuh. Hasil perhitungan yang terlihat pada tabel rata-rata jumlah mikroba yang terdapat pada sampel berada dibawah 5x104 cfu/gram. Untuk memastikan keamanan susu formula lanjutan bubuk tersebut,
maka perlu dilakukan pengujian terhadap cemaran mikroba yang lebih spesifik. Salah satunya pengujian terhadap keberadaan bakteri Bacillus cereus karena bakteri ini dapat membentuk spora dan dapat menyebabkan gangguan terutama pada saluran pencernaan..
Spora dari bakteri Bacillus lebih tahan dari bentuk vegetatifnya terhadap pemanasan, kekeringan, bahan preservatif makanan, dan pengaruh lingkungan lainnya. Selain itu, spora B. cereus sering ditemukan pada makanan, seperti susu, sereal, rempah, dan makanan kering lainnya, serta sering ditemukan pada permukaan daging, yang kemungkinan disebabkan kontaminasi debu atau tanah (Soejoedono 2002). B. cereus dapat menghasilkan dua jenis toksin, yaitu heat-labile enterotoxin yang dapat mengakibatkan diare dan heat-stable toxin yang menyebabkan respons muntah-muntah pada manusia.
2. Presumtif B. Cereus
Pemeriksaan B. cereus dengan menggunakan metode pembiakan pada media selektif Manitol Egg Yolk Polymixine agar akan membentuk koloni yang berukuran besar seperti bentuk koloni khamir dengan lingkaran pengendapan kuning telur yang berwarna putih sehingga dapat dibedakan dengan koloni-koloni bakteri lain yang tumbuh pada media yang sama. Media ini mengandung antibiotika Polymixine yang dapat membunuh bakteri-bakteri yang rentan terhadap antibiotik tersebut sedangkan B. cereus sangat resisten terhadapnya. (Cowan dan Steel 1974).
A B
Gambar 2. A: Koloni Bacillus yang memfermentasi manitol (berwarna kuning), B : B. cereus yang tumbuh pada media MYP, tidak memfermentasi manitol.
Perhitungan dilakukan terhadap cawan yang memiliki jumlah koloni presumtif B. cereus antara 15-150 koloni, kemudian diambil 5 koloni atau lebih untuk diisolasi pada nutrient agar miring (Rhodehamel dan Harmon 1998). Hasil yang didapat seperti terlihat pada Tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2. Presumtif B. cereus dari media mannitol egg yolk polymixine agar
Kecamatan Jumlah sampel Jumlah sample presumtif positif Persentase presumtif (%) Rata-rata presumtif (cfu/gram) Caringin 5 5 100 2,6 x 10² ± 1,2 x 10² Cijeruk 7 7 100 8,6 x 10 ± 4,1 x 10 Jasinga 7 4 57 8,00 ± 6,80 KelapaNunggal 5 5 100 4,7 x 10 ± 3,2 x 10 Lebakwangi 3 2 67 6,00 ± 5,30 Nanggung 5 4 80 3,60 ± 2,50 Parung 5 5 100 2,2 x 10² ± 1,1 x 10² Sukajaya 5 2 40 1,00 ± 0,60 Sukamana 4 4 100 8,5 x 10 ± 4,3 x 10 Tenjolaya 2 0 0 0,00 ± 0,00 Jumlah 48 38 74,4 7,2 x 10 ± 3,6 x 10
B. cereus merupakan bakteri gram positif yang tidak memfermentasi
manitol sehingga akan membentuk koloni yang berwarna merah jambu dengan zona presipitasi disekelilingnya (Batt 2000). Koloni yang dikelilingi zona presipitasi (bening) mengindikasikan bakteri tersebut menghasilkan lesitinase. Hasil pertumbuhan bakteri pada media selektif tersebut sekitar 74,4 % diduga mengandung B. cereus, dengan jumlah rata-rata 7,2 x 10± 3,6 x 10cfu/gram.
Hasil yang dinyatakan 0 mempunyai dua arti, yang pertama berarti di dalam media benar-benar tidak ada pertumbuhan bakteri, arti yang kedua di dalam media ada pertumbuhan bacillus tetapi bersifat memfermentasi mannitol sehingga
menyebabkan warna kuning pada media, contohnya B. pumillus. Beberapa strain dari B. cereus yang mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat seperti B. mycoides, B. thuringiensis, dan B. anthracis dapat memberikan gambaran yang sama dengan B. cereus, sehingga perlu dilakukan uji biokimiawi sebagai uji konfirmasi seperti uji reduksi nitrat dan motilitas, uji Voges Proskauer dan uji fermentasi glukosa anaerob, selain itu juga dilakukan pewarnaan Gram sebagai pewarnaan diferensial. Interpretasi hasil : jika 50% isolat dari satu sampel memperlihatkan hasil reaksi positif maka seluruh sampel dinyatakan positif mengandung B. cereus (Rhodehamel dan Harmon 1998).
3. Definitif B. Cereus
Pewarnaan Gram dilakukan untuk melihat bentuk bakteri, selain itu juga mengelompokan bakteri menjadi Gram positif atau Gram negatif. Bakteri gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal sehingga sel berwarna ungu tua, sedangkan bakteri gram negatif kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan aseton alkohol dan ketika diberi larutan pemucat safranin sel akan menyerap zat pewarna ini sehingga sel tampak bewarna merah. Terjadinya perbedaan warna sel ini dapat disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi permukaan (Pelczar dan Chan 1986). Hasil perwarnaan gram B. Cereus di bawah mikroskop akan terlihat bentuk batang berwarna ungu dan kadang-kadang ditemukan sporanya yang terletak di tengah-tengah sel (Gambar3).
Kemampuan memfermentasi berbagai karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi mikroorganisme. Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media biakan yang digunakan, dan juga faktor lingkungan (suhu, pH, Aw, dll). Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa adalah salah satu senyawa yang sering digunakan oleh mikroorganisme dalam proses fermentasi dan akan menurunkan pH membentuk asam yang ditandai dengan perubahan warna media dari merah menjadi kuning (Lay 1994).
Pada uji fermentasi glukosa anaerob digunakan sistem anaerobik Gaspak. Sistem ini menggunakan kontainer anaerobik dan Gaspak yang merupakan amplop berisi pembangkit hidrogen dan karbon dioksida, serta katalis palladium suhu kamar. Dalam penggunaanya air ditambahkan kedalam amplop Gaspak sehingga dihasilkan hydrogen. Kemudian hidrogen ini akan bereaksi dengan oksigen pada permukaan katalis untuk membentuk air sehingga tercipta keadaan anaerobic (Pelczar dan Chan 1986).
Beberapa mikroorganisme seperti B.cereus mampu menggunakan molekul bukan oksigen sebagai akseptor terakhir dengan melakukan respirasi anaerobik. Mikroorganisme tersebut menggunakan nitrat (NO3-) sebagai akseptor terakhir yang direduksi menjadi nitrit (NO2-). Karena media yang digunakan bersifat semisolid maka nitrit tersebut tidak dapat direduksi lagi menjadi nitrogen (N2). Keberadaan nitrit dalam media biakan di uji dengan penambahan reagent A dan C yang akan bereaksi dengan menunjukan perubahan warna menjadi orange atau merah bata. Selain itu motilitas dan pertumbuhan bakteri akan tampak jelas dipermukaan media yang terlihat lebih keruh (ada gumpalan putih), ini berkaitan dengan sifat B. cereus sebagai bakteri aerob (Lay 1994).
Uji Voges Proskauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol. Dilakukan penambahan larutan alphanapthol dan KOH 40% adalah untuk menentukan adanya asetoin
(asetilmetilkarbinol) yang merupakan senyawa yang membantu sintesis
2,3-butanadiol. Adanya asetoin ditunjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi
Uji biokimiawi yang dilakukan terhadap 38 sampel presumtif B. cereus
yaitu uji reduksi nitrat yang menggunakan media semisolid nitrat dan reagent A dan C memperlihatkan hasil reaksi positif dengan terbentuk warna merah pada sepanjang tusukan dan permukaan media, ini menunjukan adanya pertumbuhan.
B. cereus, uji voges prokauer menggunakan voges prokauer broth serta reagent
alphanapthol dan KOH 40%, menunjukan hasil reaksi positif setelah 1-3 jam
dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah, sedangkan untuk hasil uji fermentasi glukosa anaerob ditunjukan dengan perubahan warna menjadi kuning, yang berarti terjadi telah terjadi penurunan pH.
A B
- + C
Gambar 3. Hasil uji biokimiawi Keterangan :
Gambar A : Uji reduksi nitrat, hasil positif ditunjukan oleh tabung kiri dan hasil negaitf ditunjukan oleh tabung kanan.
Gambar B : Uji fermentasi glukosa anaerob, hasil positif ditunjukan oleh tabung kiri yang memperlihatkan perubahan warna dari merah menjadi kuning.
Gambar C : Uji Voges Prokauer, hasil positif terjadi perubahan warna menjadi merah.
Table 3. Definitif B. cereus dari hasil uji konfirmasi
Kecamatan N N definitif Persentase definitive (%) Rata-rata definitive (cfu/gram) Caringin 5 3 60 8,4 x 10³ ± 2,8 x 10³ Cijeruk 7 3 43 2,4 x 10² ± 7,8 x 10¹ Jasinga 7 0 0 0,00 ± 0,00 KelapaNunggal 5 4 80 6,9 x 10² ± 1,7 x 10² Lebakwangi 3 0 0 0,00 ± 0,00 Nanggung 5 1 20 3,1 x 10² ±1,6 x 10² Parung 5 2 40 9 x 10¹ ± 4,5 x 10¹ Sukajaya 5 1 20 3,1 x 10² ± 3,1 x 10¹ Sukamana 4 3 75 2,3 x 10³ ± 7,6 x 10² Tenjolaya 2 0 0 0,00 ±0,00 Jumlah 48 17 33,8 1,2 x 10³ ± 4 x 10²
Rata-rata jumlah definitif B. cereus adalah 1,2 x 103 ± 4 x 102 cfu/gram, pada 33,8% sampel. Menurut standar yang dikeluarkan oleh Pemerintah Australia dan New Zealand (Standard 1.6.1-Microbiological Limits for Food 2001), untuk susu formula lanjutan bubuk jumlah B. cereus yang dapat diterima adalah 102 cfu/gram dan sampel dinyatakan ditolak jika mengandung ≥ 103 cfu/gram. Definitif B. cereus yang terdeteksi pada sampel berada diatas Standard 1.6.1-Microbiological Limits for Food. Pernyataan ini diperkuat oleh Becker et al.
(1994) yang telah melakukan penelitian di 17 negara mengenai cemaran mikroba pada susu formula lanjutan bubuk dan ditemukan 50% sampel terkontaminasi oleh
B. Cereus.
Susu formula lanjutan bubuk tersebut sebaiknya tidak diberikan pada penderita gizi buruk karena dapat meyebabkan diare tipe sedang. Diare tipe ini walaupun dapat sembuh dengan sendirinya dalam waktu 24 jam, apabila sering terjadi maka dapat menganggu pertambahan berat badan balita yang mengalami gizi buruk.