HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan MIC

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan ini meliputi persiapan kultur isolat bakteri asam laktat (BAL) hasil isolasi dari daging sapi yaitu uji katalase dan pewarnaan Gram serta persiapan bakteri uji, yang bertujuan untuk memeriksa karakteristik morfologis dan kemurnian isolat bakteri yang akan digunakan. Isolat yang digunakan terdapat 12 isolat bakteri asam laktat yang telah diisolasi dari daging sapi dan telah diidentifikasi pada penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006) dapat dilihat pada Tabel 3. Isolat bakteri asam laktat ini diisolasi dari daging sapi untuk mendapatkan biopreservatif alami yang berasal dari daging dang untuk daging. Karakterisktik morfologis yang diamati meliputi respon terhadap pewarnaan Gram, bentuk dan susunan sel serta uji katalase.

Tabel 3. Karakteristik Isolat Bakteri Asam Laktat Jenis Isolat Uji Katalase Pewarnaan Gram ^Morfologi Bakteri

2B1 Negatif Gram positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1A1 Negatif Gram Positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

2B3 Negatif Gram Positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

2D1 Negatif Gram Positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1D2 Negatif Gram Positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

2A2 Negatif Gram Positif ^{Bulat, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1D1 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1C3 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1B1 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1A5 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1A32 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

1C6 Negatif Gram Positif ^{Batang, susunan tunggal maupun rantai} pendek

Persiapan bakteri asam laktat dilakukan untuk mengetahui morfologis dan kemurnian isolat bakteri asam laktat tersebut. Pemeriksaan karakteristik yang dilakukan antara lain uji katalase dan pewarnaan Gram.

Morfologi isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari pengamatan mikroskopis dapat dilihat pada Lampiran 8. Menurut Fardiaz (1992), kelompok Lactobacillus sp. Mempunyai bentuk batang yang panjang, katalase negatif dan tergolong dalam bakteri Gram positif. Hasil pengujian menunjukkan bahwa jenis isolat 1D1, 1C3, 1B1, 1A5, 1A32, dan 1C6 tergolong dalam Gram positif yang mempunyai bentuk batang dengan susunan tunggal atau rantai. Isolat lainnya yaitu 2B1, 1A1, 2B3, 1A2, 2D1 dan 2A2 tergolong dalam kelompok bakteri Gram positif yang berbentuk bulat/ coccus susunan rantai pendek termasuk kedalam kelompok famili Strepcoccocaceae. Hal ini sesuai dengan penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa isolat bakteri tersebut tergolong dalam kelompok bakteri genus Lactobacillus sp dan Strepcoccocaceae (Hidayati, 2006). Karakteristik bakteri asam laktat yang diperoleh sesuai dengan Frazier dan Westhooff (1978), bahwa Lactobacillus sp. berbentuk batang, mempunyai susunan sel tunggal atau rantai, dan Gram positif. Sedangkan Streptococcus berbentuk bulat dengan susunan rantai panjang maupun pendek (Fardiaz, 1992).

Hasil dari persiapan kultur bakteri asam laktat ini menunjukkan bahwa kultur tidak tercemar, seperti yang diperoleh pada penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006) sehingga dapat dinyatakan bahwa kultur masih homogen dan tidak tercemar.

Karakteristik Bakteri Uji

Persiapan bakteri uji dilakukan untuk penentuan jumlah populasi awal dari bakteri uji. Total populasi awal bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Total Populasi Awal Bakteri Uji

Jenis Bakteri Uji Populasi awal OD

(cfu/ml)

Escherichia coli (ATCC 25922) 3,2 x 10⁶ 0,307

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 5,6 x 10⁶ 0,283

Bakteri uji yang digunakan antara lain Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) dan Salmonella typhimurium (ATCC 14028). Pemilihan ketiga bakteri uji ini mengacu pada ketentuan SNI 01-6366-2000 yang menyatakan bahwa ketiga bakteri tersebut perlu mendapatkan perhatian khusus sebagai cemaran mikroba pada daging (Tabel 1).

Penelitian Utama

Penelitian utama adalah identifikasi substrat antimikroba dari isolat BAL. Identifikasi substrat antimikroba ditentukan berdasarkan hasil konfrontasinya dengan bakteri uji. Identifikasi keberadaan substrat antimikroba dengan kecepatan sentrifugasi 6.000 rpm dan 10.000 rpm, pengujian terhadap asam organik, bakteriosin dan konsentrasi penghambatan minimum/MIC.

Identifikasi Keberadaan Substrat Antimikroba

Substrat antimikroba diperoleh dengan cara melakukan sentrifugasi terhadap kultur untuk memisahkan sel dan supernatant bebas sel pada kecepatan 6.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4^oC. Rataan diameter Zona Hambat 6.000 rpm dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan BAL terhadap Bakteri Uji

No kultur S. aureus S. typhimurium E. coli ATCC (25923) ATCC(14028) ATCC (25922)

---mm---2B1 8,46 ^a ± 3,00 9,69 ^a ± 1,86 5,00 ^a ± 0,00 1A1 11,59 ^a ± 5,96 11,51 ^a ± 2,31 7,22 ^a ± 1,92 2B3 11,04 ^a ± 5,92 10,69^a ± 4,93 6,11 ^a ± 1,93 2D1 7,75 ^a ± 2,38 11,03^a ± 2,82 6,00^a ± 1,72 1D2 10,88 ^a ± 5,33 9,00 ^a ± 3,56 7,49^a ± 2,93 2A2 9,30 ^a ± 4,39 8,55^a ± 0,78 5,00^a ± 0,00 1D1 10,96 ^a ± 5,50 8,35 ^a ± 2,90 5,00 ^a ± 0,00 1C3 9,51 ^a ± 4,70 9,68 ^a ± 4,09 6,03 ^a ± 0,94 1B1 10,37 ^a ± 4,89 8,99^a ± 3,89 10,42 ^a ± 1,25 1A5 8,99 ^a ± 3,92 11,76^a ± 2,97 7,87^a ± 4,97 1A32 7,55 ^a ± 2,30 11,67^a ± 2,95 5,73^a ± 1,27 1C6 7,98 ^a ± 3,18 8,98^a ± 3,44 5,00^a ± 0,00 Keterangan : Huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata Diameter lubang sumur 5 mm

Substrat antimikroba diperoleh dari sentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm tanpa penyaringan. Pengaruh pengujian sentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 20 menit terhadap zona hambat yang terbentuk cenderung lebih keruh. Hal ini disebabkan pada perlakuan sentrifuge dengan kecepatan 6.000 rpm (4^oC, 20 menit) tidak dilakukan penyaringan dengan kertas saring 0,22 µm, sehingga ada kemungkinan bahwa pada kecepatan 6.000 rpm ini belum terjadi pengendapan sel secara sempurna.

Berdasarkan hasil sidik ragam, perlakuan isolat yang berbeda terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (ATCC 25923) tidak berpengaruh nyata. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan masing-masing isolat terhadap bakteri uji tidak terdapat perbedaan. Hasil sidik ragam dengan perlakuan 12 isolat yang berbeda terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium (ATCC 14028) tidak berpengaruh nyata, begitu pula hasil sidik ragam terhadap bakteri uji E. coli (ATCC 25922). Hal ini menunjukkan bahwa pada kecepatan sentrifugasi 6.000 rpm (4^oC, 20 menit) antara 12 isolat tidak ada perbedaan terhadap zona bening yang terbentuk.

Substrat antimikroba isolat BAL 1C3, 1A1, 2B3, 1D2, 1B1, 1A5, 2D1, dan 1A32 yang dihasilkan dari kecepatan sentrifugasi 6.000 rpm (4^oC, 20 menit) dapat menghambat ketiga bakteri uji, sedangkan substrat isolat BAL 2B1, 1D1, 1C6, dan 2A2 tidak dapat menghambat bakteri uji. E.coli. seluruh bakteri asam laktat menghasilkan substrat antimikroba ditunjukkan oleh adanya zona hambat pada bakteri uji. Antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat berupa asam organik, hidrogen peroksida, diacetil dan bakteriosin.

Identifikasi Substrat Antimikroba dari Isolat BAL

Identifikasi jenis substrat antimikroba menggunakan supernatan bakteri asam laktat diperoleh dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Peningkatan kecepatan sentrifugasi bertujuan untuk mendapatkan supernatan yang betul-betul bebas sel, karena dengan kecepatan 6.000 rpm masih didapatkan zona hambat yang bersifat parsial, yang diduga masih terdapat sel-sel bakteri asam laktat yang belum mengendap secara sempurna. Hasil pengamatan dengan supernatan yang disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm diperoleh zona bening (penghambatan total dengan diameter untuk tiap-tiap ulangan yang relatif konstan).

Bakteriosin merupakan substrat antimikroba yang paling penting dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Identifikasi keberadaan bakteriosin dalam supernatan bebas sel dapat dilakukan melalui beberapa pengujian diantaranya: (a) netralisasi pengaruh asam dalam supernatan dengan penambahan buffer pH 7,0; (b) penambahan enzim proteolitik dan, (c) pengujian stabilitas melalui pemanasan.

Hasil konfrontasi antara supernatan yang sudah dinetralisasi dengan buffer phospat dan disterilkan melalui filter 0,22 µm adalah tidak didapatkan kembali zona hambat bening di sekitar sumur, sementara itu supernatan yang sama tapi tidak dinetralkan tetap menunjukkan adanya zona hambat seperti dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Aktivitas Asam Organik dari Isolat BAL tanpa Penambahan Buffer

No pH S. aureus S. typhimurium E. coli

Kulltur ATCC (25923) ATCC(14028) ATCC (25922) -mm --2B1 4,27^a ± 0,05 7,16 ^ab ± 1,36 8,27 ^ab ± 1,26 9,05 ^ab ± 1,82 1A1 4,00^bc ± 0,00 6,52 ^ab ± 1,56 10,19 ^a ± 0,44 7,52 ^b ± 2,55 2B3 4,10^bc ± 0,00 5,00 ^b ± 0,00 7,92 ^ab ± 0,36 7,51 ^b ± 1,31 2D1 3,90^d ± 0,00 5,00 ^b ± 0,00 9,31 ^ab ± 0,98 7,74^ab ± 1,09 1D2 4,20 ^b ± 0,09 5,00 ^b± 0,00 8,13 ^ab ± 0,92 8,23^ab ± 2,01 2A2 3,90^d ± 0,00 9,25 ^a ± 2,04 7,99 ^ab ± 0,70 10,08^ab ± 2,23 1D1 4,10^bc ± 0,00 7,67 ^ab ± 0,69 10,66 ^a ± 1,14 7,40 ^b ± 2,08 1C3 4,00^cd ± 0,00 5,00 ^b ± 0,00 8,00 ^ab ± 0,95 6,28 ^b ± 1,21 1B1 4,07 ^c ± 0,05 6,71 ^ab ± 1,52 6,88^b ± 2,27 7,13 ^b ± 1,25 1A5 3,93^d ± 0,05 7,08 ^ab ± 1,11 9,25 ^ab ± 1,17 12,38^a ± 0,74 1A32 4,10^bc ± 0,00 5,00 ^b ± 0,00 8,68 ^ab ± 0,41 8,47^ab ± 1,84 1C6 4,23 ^a ± 0,05 5,36 ^b ± 0,61 8,45 ^ab ± 0,89 10,22^ab ± 1,27 Keterangan : Huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata

Diameter lubang sumur 5 mm

Hasil konfrontasi berupa tidak terbentuknya zona hambat oleh supernatant bebas sel yang telah dinetralisasi menunjukkan bahwa tidak terdapat bakteriosin

dalam supernatan atau bila terdapat bakteriosin jumlah konsentrasinya terlalu rendah untuk mampu menghambat bakteri uji. Komponen utama substrat antimikroba yang mampu menghambat bakteri uji adalah asam organik, ditunjukkan oleh nilai pH dari masing-masing supernatan yang rendah yaitu antara 3,90 dan 4,27.

Asam organik merupakan salah satu substrat antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Asam organik seperti asam asetat dan asam laktat, merupakan hasil metabolit primer dari bakteri asam laktat. Asam organic memiliki kemampuan penghambatan melalui penurunan pH lingkungan sel bakteri. Asam laktat merupakan penghambat yang baik untuk bakteri bukan pembentuk spora pada lingkungan dengan pH 5,0 tetapi tidak efektif menghambat kapang dan khamir (Davidson dan Branen, 1993).

Pertumbuhan Salmonella dihambat pada pH dibawah 4,4 untuk asam laktat dan 5,4 untuk asam asetat. Produksi asam oleh isolat bakteri asam laktat mampu menghambat dan menonaktifkan strain enteropathogenic Escherichia coli. Asam laktat dapat menghambat Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens dan Staphylococcus aureus. Aksi sinergis dari asam laktat dan asetat dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan Salmonella (Vuyst dan Vandame, 1994).

Mekanisme penghambatan bakteri oleh asam-asam organik berhubungan dengan keseimbangan asam-basa, penambahan proton, dan produksi energi oleh sel. Keseimbangan asam basa pada sel mikroba ditunjukkan dengan pH yang mendekati normal. Interaksi dengan senyawa kimia akan mengganggu keseimbangan asam-basa dan mengakibatkan kerusakan sel. Protein, asam nukleat, dan fosfolipid dapat rusak oleh perubahan pH. Ketersediaan ion-ion logam akan mengganggu permeabilitas membran, karena membran kurang permeabel terhadap ion dibandingkan dengan molekul yang tidak bermuatan. Perubahan permeabilitas membran akan menghasilkan efek ganda, yaitu mengganggu transport nutrisi kedalam sel dan menyebabkan metabolit internal keluar dari sel (Davidson dan Branen, 1993).

Akumulasi dari produk akhir asam dan pH rendah seperti halnya pembentukan hidrogen peroksida akan menghasilkan spektrum penghambatan yang luas, meliputi bakteri Gram positif dan negatif. Pada pH yang telah diatur, asam dengan nilai pKa tertinggi akan memiliki jumlah asam yang tidak terdisosiasi

terbanyak, dan menghasilkan aktivitas antimikrobial terkuat. Asam asetat (pKa=4,74) memiliki jumlah asam tidak terdisosiasi 2 atau 4 kali lipat pada interval pH 4,0 4.6 dibandingkan dengan asam laktat (pKa=3,85), sehingga mempunyai kemampuan lebih menghambat dari pada asam laktat (Vuyst dan Vandame, 1994).

Nilai pH eksternal yang rendah mengakibatkan asidifikasi sel sitoplasma, sementara asam yang tidak terdisosiasi menjadi lipofilik. Asam lipofilik seperti asam laktat dan asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat masuk kedalam sel mikroba, dan pH intra seluler yang lebih tinggi, berdisosiasi untuk menghasilkan ion-ion hidrogen, dan menurunkan pH intraselulernya sehingga mengganggu sistem transport substrat (Surono, 2004). Sensitifitas bakteri terhadap asam tergantung pada beberapa faktor seperti aktivitas air, kadar garam, potensial redoks, dan perlakuan panas (Vuyst dan Vandame, 1994).

Penghambatan Asam Organik dari Isolat BAL terhadap Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Berdasarkan hasil sidik ragam, perlakuan isolat yang berbeda terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (ATCC 25923) menunjukkan hasil yang berpengaruh nyata (P<0,05). Isolat 2A2 mempunyai penghambatan yang paling besar yaitu (9,25 ± 2,04) dan memiliki nilai pH yang cukup rendah yaitu 3,90. Diantara isolat lainnya, 1C3, 2B3, 2D1, 1D2, 1A32 dan 1C6 memiliki diameter zona hambat yang sama dan paling kecil. Perbedaan aktivitas penghambatan masing-masing isolat BAL terhadap bakteri uji dipengaruhi oleh senyawa antimikroba yang dihasilkan. Bakteri uji S. aureus (ATCC 25923) tergolong dalam bakteri Gram positif. Struktur dinding sel bakteri Gram positif relatif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antimikroba untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja (Pelczar dan Chan, 1988). Aktivitas antimikroba (Asam Organik) dari isolat BAL terhadap Staphylococcus aureus (ATCC 25923) dapat dilihat pada Tabel 7.

Penghambatan Asam Organik dari Isolat BAL terhadap Salmonella typhimurium (ATCC 14028). Berdasarkan hasil sidik ragam, perlakuan isolat yang berbeda terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium (ATCC 14028) menunjukkan hasil yang berpengaruh nyata (P<0,05). Secara umum semua jenis isolat dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji Salmonella typhimurium (ATCC 14028). Isolat bakteri yang menghasilkan penghambatan terbesar pada bakteri uji S. typhimurium

adalah 1D1 dan 1A1 yaitu sebesar (10,66 ± 1,14) dan (10,19 ± 0,44). Jenis isolat 1B1 mempunyai penghambatan yang paling kecil terhadap bakteri uji S. typhimurium yaitu sebesar (6,88 ± 2,27). Jenis isolat lainnya memiliki keragaman diameter zona hambat sesuai dengan tingkat kepekaan S. typhimurim terhadap senyawa antimikroba yang dihasilkan. Bakteri uji S. typhimurium tergolong dalam bakteri Gram negatif. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba yang dihasilkan efektif dalam menghambat bakteri Gram negatif. Aktivitas antimikroba (asam organik) dari isolat bakteri asam laktat terhadap Salmonella typhimurium (ATCC 14028) dapat dilihat pada Tabel 7. Penghambatan Asam Organik dari Isolat BAL terhadap E. coli(ATCC 25922). Berdasarkan hasil sidik ragam, perlakuan isolat yang berbeda terhadap bakteri uji E. coli (ATCC 25922) menunjukkan hasil yang berpengaruh nyata (P<0,05). Penghambatan terbesar terhadap E. coli (ATCC 25922) dihasilkan oleh jenis isolat 1A5 yaitu sebesar (12,38±0,74), sedangkan terdapat lima isolat dengan penghambatan terkecil yaitu 1D1(7,40 ± 2,08), 1C3 (6,28 ± 1,21), 1A1 (7,52 ± 2,55), 2B3 (7,51 ± 1,31) dan 1B1 (7,13 ± 1,25). Keragaman penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh berbagai jenis isolat bakteri menunjukkan bahwa antimikroba yang dihasilkan memiliki keaktifan yang berbeda terhadap pertumbuhan bakteri uji E. coli. Menurut Fardiaz (1989), kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain: (1) konsentrasi zat pengawet, (2) waktu penyimpanan, (3) suhu lingkungan, (4) sifat-sifat mikroba seperti jenis, umur, konsentrasi, dan keadaan mikroba, (5) sifat-sifat fisik dan kimia makanan termasuk kadar air, pH, jenis senyawa dan jenis senyawa didalamnya. Kemampuan antagonistik isolat bakteri asam laktat terhadap bakteri uji E. coli dapat dilihat pada Gambar 1.

Menurut Scheved et al. (1993) bakteri asam laktat dapat menghasilkan substansi antimikroba seperti asam-asam organik, hidrogen peroksida, dan bakteriosin. Mekanisme dari masing-masing antimikroba yang dihasilkan memiliki mekanisme yang berbeda dalam menghambat bakteri uji.

Menurut Naidu (2000), bakteri Gram positif lebih tahan terhadap asam. Hal ini sesuai dengan hasil uji konfrontasi (Tabel 7) yaitu bakteri uji Gram negatif (Salmonella typhimurium (ATCC 14028) dan Escherichia coli (ATCC 25922) memiliki diameter zona hambat yang lebih besar dibandingkan dengan bakteri uji Gram positif yaitu Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Efek penghambatan dari asam organik terutama berasal dari jumlah asam yang tidak terdisosiasi (Jennie, 1996a). Bakteri asam laktat mempunyai hasil primer metabolitnya adalah asam laktat. Asam lipofilik seperti asam laktat dan asam asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba (Jennie, 1996a) sehingga merubah permeabilitas membran.

Uji antagonistik supernatan isolat bakteri asam laktat 2B1, 1D1, 1C6, dan 2A2 hasil sentrifugasi dengan kecapatan 6.000 rpm tidak dapat menghambat bakteri uji E. coli, namun supernatan isolat yang sama saat dihasilkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dapat menghambat ketiga bakteri uji. Hal ini diduga senyawa antimikroba yang masih membentuk kumpulan dalam isolat tersebut yang disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm belum pecah sehingga aktivitas senyawa antimikroba tersebut belum optimal. Sedangkan pada supernatan isolat bakteri asam laktat 2B3, 1D2, 2D1, dan 1A32 yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi 6.000 rpm dapat menghambat ketiga bakteri uji dengan menghasilkan zona bening, sedangkan supernatan isolat yang sama saat dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm tidak menghasilkan zona hambat pada bakteri uji Staphilococcus aureus. Hal ini diduga pada keempat isolat tersebut terdapat senyawa antimikroba lain selain asam organik, namun saat kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm senyawa antimikroba yang lain mengendap, sehingga tidak dapat menghambat aktivitas bakteri uji.

Rataan diameter zona hambat yang terbentuk dari substrat antimikroba (asam organik) 12 isolat bakteri, 1A5 mempunyai penghambatan yang paling baik terhadap ketiga bakteri uji dan memiliki nilai total asam tertitrasi cukup tinggi yang

berbanding lurus terhadap nilai pH. Nilai total asam tertitrasi substrat antimikroba isolat 1A5 dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Nilai Total Asam Tertitrasi Substrat Antimikroba Isolat 1A5

Ulangan Volume NaOH (ml) TAT (%)

1 6,1 0,55

2 6,5 0,59

3 6,2 0,56

Rataan 6,27 0,57

Hidrogen peroksida adalah salah satu substrat antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri. Kadar hidrogen peroksida yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dalam isolat bakteri asam laktat dalam penelitian ini tidak dapat diukur nilainya. Hal ini disebabkan produksi dari hidrogen peroksida yang sangat sedikit dan sifatnya yang mudah menguap (volatil).

Hidrogen peroksida dihasilkan oleh enzim NADH oksidase dan superoksidase dismutase, dimana oksigen berperan sebagai elektron akseptor ekternal dan NADH oksidase dimiliki oleh hamper semua bakteri asam laktat. Reaksi pembentukan hidrogen peroksida akan mengikat oksigen sehingga membentuk suasana anaerob yang tidak nyaman bagi bakteri aerob. Pengujian kadar hidrogen peroksida menunjukkan tidak ada hydrogen peroksida yang dapat dihitung, karena jumlahnya yang sangat sedikit dan bersifat volatil. Beberapa peneliti berpendapat bahwa hidrogen peroksida tidak dapat berakumulasi dalam jumlah banyak secara invivo, karena terdekomposisi oleh adanya peroksidase (Surono, 2004).

Bakteriosin lebih aktif pada bakteri Gram positif dibandingkan dengan Gram negatif (Vuys dan Vandame, 1994) dan mempunyai spektrum yang relatif sempit terdiri dari senyawa utama protein (Tagg et al., 1976). Bakteriosin dalam penghambatannya terlebih dahulu masuk kedalam sel sasarannya, melewati dinding atau membran sitoplasma agar dapat masuk ke dalam sel sasaran untuk menghambat bakteri (Hurst, 1983). Penelitian ini tidak metemukan bakteriosin pada 12 isolat, karena saat uji antagonistik antara 12 supernatan isolat bakteri asam laktat yang telah dinetralkan dengan bakteri uji, tidak terbentuk zona hambat.

Penentuan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Isolat BAL 1A5

Pengujian lebih lanjut terhadap antimikroba (asam organik) bakteri asam laktat adalah menentukan nilai MIC terhadap Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli enteropatogenik (ATCC 25922), dan Salmonella typhimurium (ATCC 14028). Konfrontasi antar supernatan bebas sel dalam media nutrient broth dengan konsentrasi yang berbeda digunakan untuk penentuan MIC. Menurut Consentino et al., (1999), MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terendah supernatan bebas sel yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90% selama inkubasi 24 jam.

Gambar 2. Minimum Inhibitory Concentration pada S. aureus

Gambar 3. Minimum Inhibitory Concentration pada E.coli

Hasil konfrontasi dari 12 isolat bakteri asam laktat yang digunakan menunjukkan bahwa isolat bakteri 1A5 memiliki aktivitas penghambatan yang paling baik. Nilai MIC substrat antimikroba isolat bakteri 1A5 dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9. Nilai MIC Substrat Antimikroba (Asam Organik) Isolat 1A5 terhadap Berbagai Bakteri Uji

Jenis Bakteri Uji Populasi Akhir (Nt) % Penghambatan Konsentrasi Substrat Antimikroba (%) (cfu/ml) = 100% -(Nt/Nox100%) S. aureus 10 5,21 x 10⁵ 49,83 Awal (No)= 20 4,61 x 10⁵ 51,67 5,6x10⁶cfu/ml 30 4,67 x 10⁵ 54,80 40 4,52 x 10⁵ 55,76 50 4,14 x 10⁵ 67,64 60 3,69 x 10⁵ 69,33 70 2,97 x 10⁵ 77,52 80 2,37 x 10⁵ 87,89 90* 1,92 x 10⁵ 91,77 100 1,52 x 10⁵ 93,03 S. typhimurium 10 3,34 x 10⁵ 49,33 Awal (No)= 20 3,32 x 10⁵ 52,67 4,4x10⁶cfu/ml 30 3,17 x 10⁵ 53,73 40 3,14 x 10⁵ 57,70 50 2,93 x 10⁵ 66,33 60 2,55 x 10⁵ 68,93 70 2,03 x 10⁵ 75,67 80 1,62 x 10⁵ 88,03 90* 1,38 x 10⁵ 91,45 100 1,12 x 10⁵ 92,76 E.coli 10 2,64 x 10⁵ 50,68 Awal (No)= 20 2,47 x 10⁵ 52,67 3,2x10⁶cfu/ml 30 2,46 x 10⁵ 53,73 40 2,38 x 10⁵ 57,70 50 2,20 x 10⁵ 66,33 60 1,92 x 10⁵ 68,60 70 1,5 x 10⁵ 75,52 80 1,2 x 10⁵ 88,14 90* 1,08 x 10⁵ 92,00 100 8,82 x 10⁴ 94,93

Keterangan :* Nilai MIC merupakan konsentrasi penghambatan terendah yang dapat menurunkan pertumbuhan bakteri uji lebih dari 90%

Konsentrasi minimum penghambatan atau MIC merupakan konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba lebih dari 90 %. Konsentrasi minimum penghambatan masing-masing bakteri uji berbeda-beda. Kosentrasi minimum penghambatan untuk bakteri uji Staphylococcus aureus (ATCC 25923) adalah sebesar 90%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan untuk dapat menghambat S. aureus lebih dari 90 % adalah 90% substrat antimikroba (asam organik) dari isolat bakteri 1A5. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba (asam organik) yang dihasilkan oleh isolat bakteri 1A5 dalam penghambatan terhadap Staphylococcus aureus (ATCC 25923) kurang efektif. Gambar 2 menunjukkan bahwa semakin bening larutan menunjukkan semakin banyak Staphylococcus aureus yang dihambat oleh 1A5. Penghambatan isolat bakteri 1A5 terhadap Staphylococcus aureus dapat dilihat pada Gambar 2.

Konsentrasi minimum penghambatan untuk bakteri uji Salmonella typhimurium (ATCC 14028) adalah sebesar 90%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan untuk dapat menghambat Salmonella typhimurium (ATCC 14028) lebih dari 90 % adalah 90% substrat antimikroba (asam organik) dari isolat bakteri 1A5. Gambar 4 menunjukkan bahwa semakin bening larutan menunjukkan semakin banyak Salmonella typhimurium yang dihambat oleh 1A5. Penghambatan isolat bakteri 1A5 terhadap Salmonella typhimurium dapat dilihat pada Gambar 4.

Konsentrasi minimum penghambatan untuk bakteri uji Escherichia coli (ATCC 25922) adalah sebesar 90%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan untuk dapat menghambat Escherichia coli (ATCC 25922) lebih dari 90 % adalah 90% substrat antimikroba (asam organik) dari isolat bakteri 1A5. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba (asam organik) yang dihasilkan oleh isolat bakteri 1A5 dalam penghambatan terhadap E. coli kurang efektif. Gambar 3 menunjukkan bahwa semakin bening larutan menunjukkan semakin banyak E. coli yang dihambat oleh 1A5. Penghambatan isolat bakteri 1A5 terhadap E. coli dapat dilihat pada Gambar 3.

Menurut Naufalin (2005), Nilai MIC senyawa antimikroba yang lebih rendah menunjukkan bakteri lebih sensitif terhadap senyawa tersebut. Hal ini membuktikan bahwa bakteri uji E. coli mempunyai taraf sensitifitas yang paling tinggi dari ketiga

bakteri uji terhadap antimikroba (asam organik) yang dihasilkan oleh isolat bakteri 1A5. Nilai MIC pada penghambatan Escherichia coli (ATCC 25922) lebih rendah dibandingkan dengan nilai MIC kedua bakteri uji yang lain, yaitu Salmonella typhimurium (ATCC 14028) dan Staphylococcus aureus (ATCC 25923), yaitu pada konsentrasi 90% supernatan bakteri asam laktat dapat menghambat pertumbuhan bakteri sebesar 91,45% dan 91,77%.

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif dengan dinding sel disusun oleh rantai tetrapeptida yang terdiri dari L-alanin-D-isoglutaminil-L-lisil-D-alanin serta jembatan interpeptida yang terdiri dari 5 unit glisin. Unit asam muramat disubtitusi oleh tetra peptida yang menghasilkan struktur yang kuat struktur sangat resisten terhadap kerusakan (Thorpe, 1995).