Fenotip reduksi pertambahan panjang akar pada perlakuan pH 4 dibandingkan dengan kontrol (pH6) secara visual tidak terlalu terlihat perbedaan namun pada perlakuan pH 4 + Al baik 1,2 mM maupun 1,6 mM terlihat sangat jelas (Lampiran 3).
Pengaruh pH 4 terhadap reduksi panjang akar menggunakan kontrol pH 6. Hasil analisis reduksi panjang akar disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata Reduksi panjang akar oleh cekaman pH rendah
pH 6 pH 4 Lama cekaman Pertambahan Panjang Akar (cm)/Jam Pertambahan Panjang Akar (cm)/Jam Reduksi Pertambahan panjang Akar (%) 8 jam 0,44 0,24 45 24 jam 1,25 0,64 49 48 jam 1,99 1,09 45 72 jam 2,84 1,49 48
Rata-rata reduksi pertambahan panjang akar perlakuan pH 4 adalah berkisar antara 48% dan 49% dibanding kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan pH 4 menyebabkan penurunan panjang akar sekitar 45%. Bertambahnya waktu perlakuan tidak menambah reduksi pertambahan panjang akar. Menurut Ismail dan Effendi (1993) pH yang paling baik untuk pertumbuhan kedelai adalah pH 6.8, namun pada pH 5.5-6.0 sudah dianggap cukup baik. Perlakuan dengan media tanam pH 6 menghasilkan pertambahan stimulasi perpanjangan akar lebih besar bila dibandingkan pH 4. Tingginya persentase stimulasi perpanjangan pada perlakuan pH 6 menunjukkan bahwa perakaran tanaman tumbuh normal di media kultur air pada pH 6 dibandingkan dengan pH 4.
Pengaruh Al terhadap reduksi pertambahan panjang akar
Penentuan konsentrasi Al untuk melakukan cekaman, didasarkan pada perbedaan pertambahan panjang akar antara kontrol dengan perlakuan cekaman minimal sebesar 50 persen (Ryan et al. 1994). Berdasarkan penelitian Anwar (1999) perlakuan 0,8 – 1,6 mM Al menyebabkan perpanjangan akar primer kedelai kultivar Lumut terhambat lebih dari 50%.
Oleh sebab itu, konsentrasi 1,2 mM Al dan 1,6 mM Al digunakan untuk melakukan cekaman dan pH 4 sebagai kontrol. Hasil reduksi pertambahan panjang akar dari tanaman kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman Al disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Rata-rata reduksi perpanjangan akar tanaman kedelai kultivar Lumut yang mendapat perlakuan Al pH 4 (kontrol) pH 4+1,2mM Al pH 4+1,6mM Al Lama cekaman Pertambahan Panjang Akar (cm) Pertambahan Panjang Akar (cm) Reduksi Perpanjangan Akar (%) Pertambahan Panjang Akar (cm) Reduksi Perpanjangan Akar (%) 8 jam 0,24 0,05 79 0,05 79 24 jam 0,64 0,19 70 0,08 88 48 jam 1,09 0,24 78 0,16 85 72 jam 1,49 0,3 80 0,2 87
Perlakuan cekaman 1,2 mM Al menyebabkan rata-rata reduksi pertambahan panjang akar sebesar 70% – 80% dan perlakuan cekaman 1,6 mM Al menyebabkan rata reduksi panjang akar 79% – 88%. Cekaman 1.6 mM Al menyebabkan rata-rata reduksi perpanjangan akar lebih tinggi dibandingkan dengan cekaman 1.2 mM Al.
Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi Al yang diberikan maka pertambahan akar semakin terganggu. Pertambahan waktu perlakuan tidak banyak berpengaruh terhadap reduksi pertambahan panjang akar. Menurut Anwar (1999) bahwa cekaman 1,2 mM Al dan 1,6 mM Al tidak begitu berbeda, hanya berbeda 1%. Pada kultivar Slamet (kultivar toleran) rata-rata reduksi pertambahan panjang akar sekitar 76%-78% pada cekaman 1,2 mM Al dan 79%-89% pada 1,6 mM Al (Mashuda 2006), sedangkan pada kultivar Lumut (peka) rata-rata reduksi pertambahan panjang akar pada 1,2 mM Al sebesar 70% - 80% dan pada perlakuan 1,6 mM Al sebesar 79% - 88%. Nilai rata-rata reduksi perpanjangan akar yang dimiliki kultivar Lumut tidak jauh berbeda dengan kultivar Slamet Ini menunjukkan bahwa penghambatan pertumbuhan akar kedua kultivar ini tidak jauh berbeda. Hal ini diduga diakibatkan pemberian cekaman aluminium yang terlalu tinggi
Agar pengaruh cekaman memberikan hasil yang nyata, maka respon tanaman yang mengalami cekaman harus menampakkan perbedaan yang cukup jelas. Berdasarkan hasil yang didapat, dari cekaman 1.6 mM Al menghasilkan rata-rata reduksi perpanjangan akar (RPA) yang lebih tinggi dibandingkan pada cekaman 1.2 mM Al, sehingga analisis ekspresi gen pada tahap berikutnya hanya menggunakan cekaman Al pada konsentrasi 1.6 mM Al.
Isolasi RNA Total
Isolasi RNA total telah berhasil dilakukan. RNA diisolasi dari ujung akar tanaman kedelai kultivar Lumut yang mendapat perlakuan cekaman pH dan Al. Integritas RNA total yang diisolasi pada penelitian ini adalah baik. Hal ini ditandai oleh dua pita rRNA yang dominan (28S dan 18S) yang utuh (Gambar 1). Karena mRNA terdapat bersama-sama dengan rRNA didalam RNA total, maka bilamana rRNA tersebut utuh maka mRNA juga utuh. RNA total ini kemudian digunakan untuk cetakan dalam sintesis cDNA total.
pH 6 pH 4 pH 4 + 1,6 mM Al 0 J 8 J 24 J 48 J 72 J 8 J 24 J 48 J 72J 8J 24J 48J 72J
28 s 18 s
Gambar 1. RNA total akar kedelai kultivar Lumut pada perlakuan pH 6, pH 4 dan pH 4 dengan cekaman 1,6mM Al.
Síntesis cDNA Total
cDNA total telah berhasil diisolasi dengan menggunakan RNA total sebagai cetakannya. Kemurnian cDNA dianalisis dengan PCR dengan menggunakan primer untuk ekson 1 – ekson 2 dari -aktin. Aktin juga digunakan sebagai kontrol internal karena setiap sel mempunyai aktin dan ekspresinya bersifat konstitutif. PCR dengan primer untuk ekson 1 – ekson 2 dari -aktin menghasilkan satu pita DNA berukuran 450 pb (Gambar 2) yang menunjukkan bahwa cDNA total adalah murni yang tidak terkontaminasi oleh DNA genom. Adanya kontaminasi DNA genom menyebabkan hasil amplifikasi -aktin menghasilkan 2 pita yaitu yang berukuran sekitar 450 pb dan 550 pb (Gambar 3) karena DNA genom mengandung intron diantara ekson 1 dan
ekson 2 yang berukuran sekitar 100 pb. cDNA total yang murni digunakan sebagai cetakan untuk analisis ekspresi gen melalui PCR.
pH 6 pH 4 pH 4 + 1,6 mM Al 0 J 8 J 24 J 48 J 72 J 8 J 24 J 48 J 72J 8J 24J 48J 72J
450 pb
Gambar 2. Hasil PCR Aktin yang berasal dari cetakan cDNA murni.
1 2
450 pb 550 pb
Gambar 3. Hasil PCR -aktin yang cDNAnya terkontaminasi DNA genom (1), dan cDNA murni (2).
Pengaruh Cekaman Aluminium Terhadap Ekspresi Gen Heterotrimerik Gα. Untuk membedakan pengaruh pH dan pengaruh Al terhadap ekspresi gen, maka kontrol yang digunakan untuk analisis gen pada perlakuan pH berbeda dengan perlakuan Al. Perlakuan pH menggunakan kontrol pH 6 sedangkan perlakuan Al menggunakan kontrol pH 4 karena perlakuan Al tidak dapat dilakukan pada pH 6.
Pita hasil PCR untuk melihat hasil ekspresi gen Gα disajikan pada Gambar 4 dan pengukuran intensitas pita disajikan pada Tabel 3 dan Tabel 4. Dari hasil pengukuran intensitas pita menunjukkan adanya perbedaan tingkat ekspresi gen. Hal ini menunjukkan bahwa adanya perbedaan respon gen terhadap berbagai cekaman yang dicobakan. pH 6 pH 4 pH 4 + 1,6 mM Al 0 J 8 J 24 J 48 J 72 J 8 J 24 J 48 J 72J 8J 24J 48J 72J -aktin 450 pb Gα 1380 pb
Gambar 4. Ekspresi gen Gα dan aktin pada perlakuan pH 6, pH 4, dan pH 4+1,6mM Al.
Tabel 3. Ekspresi baku gen Gα pada tanaman kedelai kultivar Lumut dengan perlakuan pH
Lama Ekspresi gen Gα
perlakuan pH 6.0 pH 4
Iapt IXpt EBX IApt Ixpt EBX %EBX 8 jam 45 76 1,69 47 78 1,66 98 24 jam 47 75 1,56 48 78 1,62 104 48 jam 47 76 1,61 49 82 1,67 104 72 jam 47 76 1,61 49 82 1,67 104 IApt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t
IXpt : Intensitas Gα pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t EBX : Ekspresi Baku gen Gα
%EBX : Ekspresi baku gen Gα dibandingkan dengan kontrol pH 6.0
Ekspresi gen Gα pada tanaman kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman pH 4 cenderung lebih tinggi daripada kontrol (pH 6). Pada 8 jam setelah perlakuan, pH tidak menyebabkan kenaikan ekspresi gen Gα, tetapi pada 24 jam sampai 72 jam, perlakuan pH 4 menyebabkan kenaikan ekspresi sekitar 4% dibandingkan dengan kontrol yaitu pH 6 , hal ini mungkin karena pH 4 berpengaruh terhadap ekspresi gen Gα pada cekaman yang lebih lama. Diduga bahwa ekspresi gen Gα akan meningkat dengan bertambahnya lama cekaman.
Analisis ekspresi gen dari tanaman kedelai kultivar Lumut yang diperlakukan dengan Al disajikan pada Tabel 4
Tabel 4. Ekspresi gen Gα dari kedelai kultivar Lumut yang medapat perlakuan Al Lama
Perlakuan
Ekspresi gen Gα pada pH 4
0 mM Al 1,6 mM Al
IApt IXpt EBX IApt EBX %EBX 8 jam 45 76 1,66 47 1,63 98 24 jam 47 75 1,62 48 1,64 101 48 jam 47 76 1,67 49 1,63 98 72 jam 47 76 1,67 49 1,72 103 IApt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t
IXpt : Intensitas Gα pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t EBX : Ekspresi Baku gen Gα
%EBX : Ekspresi baku gen Gα dibandingkan dengan kontrol pH 6.0
Hasil analisis ekspresi gen Gα menunjukkan bahwa ekspresi gen Gα tidak diinduksi oleh Al karena ekspresi baku gen Gα pada perlakuan 1,6 mM Al tidak berbeda dengan perlakuan pH 4. Tidak diinduksinya ekspresi Gα ini kemungkinan
tingginya konsentrasi Al yang diberikan atau waktu perlakuan yang terlalu lama Kemungkinan ekspresi gen Gα dapat terinduksi Al dengan cekaman yang lebih singkat misalnya dengan 5 jam perlakuan, atau pada konsentrasi Al yang lebih rendah. Tistama (2003) menyatakan bahwa ekspresi tertinggi gen gmali50 terjadi pada dosis Al yang lebih rendah yaitu 0.2 mM Al pada kultivar peka (Lumut) daripada kultivar toleran (Slamet) yang terjadi pada dosis 0.4 mM Al.
Pengaruh Cekaman pH dan Aluminium Terhadap Ekspresi Gen Peroksidase. Sama seperti analisis ekspresi gen Gα, ekspresi gen PER dianalisis secara terpisah antara tanaman yang diperlakukan dengan pH dan dengan Al. PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik untuk gen peroksidase menghasilkan pita berukuran 1300 pb (Gambar 5).
Ekspresi gen PER pada tanaman yang mendapat perlakuan pH 4 lebih tinggi daripada tanaman yang diperlakukan dengan pH 6. Ekspresi gen PER pada pH 4 berkisar 103% – 105% terhadap pH 6, yang menunjukkan bahwa perlakuan pH 4 cenderung meningkatkan ekspresi gen PER dibandingkan pH 6 (Tabel 5). Ini berarti bahwa ekspresi gen PER cenderung diinduksi oleh cekaman pH 4 pada kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al.
pH 6 pH 4 pH 4 + 1,6 mM Al 0 J 8 J 24 J 48 J 72 J 8 J 24 J 48 J 72J 8J 24J 48J 72J
PER 1300 pb
Aktin 450
Gambar 5. Ekspresi gen peroksidase pada tanaman kedelai kultivar Lumut yang ditanam pada pH 6, pH 4 dan pH 4+1,6 mM Al
Tabel 5. Ekspresi per dari kedelai kultivar Lumut yang mendapat perlakuan pH. Lama
Perlakuan
Ekspresi gen PER
pH 6.0 pH 4
IApt IXpt EBX IApt IXpt EBX % EBX 8 jam 45 91 2.02 47 99 2.11 104 24 jam 47 91 1.94 48 98 2.04 105 48 jam 47 92 1.96 49 99 2.02 103 72 jam 47 92 1.96 49 99 2.02 103 IApt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t
IXpt : Intensitas Per pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t EBX : Ekspresi Baku gen Per
Perlakuan Al cenderung menyebabkan penghambatan ekspresi gen PER. Hal ini dapat dilihat pada hasil analisis ekspresi gen yang disajikan pada Tabel 6. Pada berbagai lama perlakuan, ekspresi gen PER dari tanaman yang mendapat perlakuan pH 4 + 1,6 mM Al lebih rendah atau sama dengan ekspresi gen tersebut pada tanaman yang mendapat perlakuan pH 4. Sama seperti ekspresi gen Gα, terdapat kecenderungan bahwa gen PER diinduksi oleh pH 4 tetapi tidak oleh Al. Cekaman pH 4 dan pH 4+1,6 mM Al juga tidak menginduksi ekspresi gen GST 12 pada kedelai Lumut (Sawitri 2007).
Tabel 6. Ekspresi gen PER dari tanaman kedelai kultivar Lumut yang mendapat perlakuan pH 4 dan Al
Lama Perlakuan
Ekspresi gen PER pada pH 4 dan Al
0 mM Al 1,6 mM Al
Iapt Ixpt EBX IApt IXpt EBX % EBX 8 jam 47 99 2.11 49 98 2.00 99.01 24 jam 48 98 2.04 50 99 1.98 102.06 48 jam 49 99 2.02 49 99 2.02 103.06 72 jam 49 99 2.02 50 99 1.98 101.02 IApt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t
IXpt : Intensitas Per pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t EBX : Ekspresi Baku gen Per
%EBX : Ekspresi baku gen Per dibandingkan dengan kontrol pH 6.0
SIMPULAN
Ekspresi gen Gα dan PER pada tanaman kedelai kultivar Lumut cenderung diinduksi oleh cekaman pH 4 tetapi tidak oleh aluminium.
SARAN
Dilakukan penelitian lanjutan dengan konsentrasi Al yang lebih rendah dan dengan mengurangi lama cekaman.