Hasil
Identifikasi Enterobacteriaceae dan Frekuensi Keberadaan E. coli
Total Enterobacteriaceae pada media EMB dari tempe EMP, DRG, WJB dan CLR beragam sekitar 105-106 cfu/g (Tabel 1). Rata-rata jumlah Enterobacteriaceae pada tempe DRG, WJB, EMP, dan CLR yaitu berturut-turut 6.2, 6.0, 5.7, 4.9 cfu/g (Lampiran 2). Koloni Enterobacteriaceae selain E. coli tidak berwarna pada media EMB Agar (Gambar 2A). Jumlah koloni yang berwarna hijau metalik banyak ditemukan pada tempe EMP dibandingkan dengan tempe dari CLR, DRG, dan WJB.
Sebanyak 81 isolat yang diduga E. coli telah berhasil diisolasi dari tempe EMP, DRG dan CLR (Tabel 1). Isolat tersebut berwarna hijau metalik pada media EMB (Gambar 2B). Namun, setelah diuji lebih lanjut dengan media SSA hanya 33 isolat yang menunjukkan positif E. coli yang ditandai dengan media berwarna hijau (Gambar 2C).
E. coli tidak selalu ditemukan pada tempe. E. coli hanya ditemukan pada tempe EMP dan CLR dengan jumlah yang bervariasi pada 4 kali pengambilan sampel dari produsen. E. coli pada tempe EMP ditemukan dari pengambilan sampel ke-2 sampai ke-4. E. coli pada tempe CLR hanya ditemukan 1 kali dari 4 kali pengambilan (Tabel 1).
Ciri morfologi koloni yang diduga E. coli pada tempe DRG yaitu sedikit berwarna hijau metalik, berukuran besar dan berlendir (Gambar 3A). Ciri koloni yang diduga E. coli dari tempe EMP dan CLR yaitu jelas terlihat berwarna metalik, berukuran kecil dan tidak berlendir (Gambar 3B dan 3C). Pada tempe WJB tidak ditemukan koloni yang berwarna hijau metalik pada media EMB.
10
Gambar 2 Pertumbuhan bakteri pada media EMB dan SSA. Pertumbuhan Enterobacteriaceae pada media EMB Agar (A). Isolat E. coli pada media EMB Agar (B). Isolat E. coli pada media SSA (C)
Gambar 3 Perbedaan warna hijau metalik yang diduga E. coli pada tempe dalam media EMB Agar. Terduga E. coli dari tempe DRG (A). Terduga E. coli dari tempe EMP (B). Terduga E. coli dari tempe CLR (C)
Gen 16S rRNA 33 isolat E. coli telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer 63f dan 1387r serta menghasilkan pita DNA berukuran sekitar 1.3 kb (Gambar 4). Hasil pensejajaran sekuen pada data base di GenBank NCBI menggunakan program BLASTN menunjukkan bahwa 33 isolat tersebut merupakan E. coli dengan persentase kemiripan 96%-100% dengan E-value 0.0 (Tabel 2).
(B) (C)
(A)
(A) (B)
11 Tabel 1 Frekuensi keberadaan Enterobacteriaceae dan E. coli pada tempe segar
Sampel tempe Sampling ke-
Media EMB
Media SSA (jumlah isolat) Enterobacteriaceae
(Σ koloni (cfu/g)) (jumlah isolat) E. coli EMP 1 2.42x106 - - 2 3.66x105 20 17 3 2.12x105 12 11 4 3.11x105 4 3 DRG 1 2.00x106 23* - 2 1.13x106 - - 3 8.95x105 - - 4 2.03x106 20* - WJB 1 1.57x106 - - 2 3.04x106 - - 3 1.83x105 - - 4 1.48x105 - - CLR 1 1.15x105 - - 2 1.45x105 - - 3 1.38x104 2 2 4 1.09x105 - - Total isolat 81 33
Keterangan: (-) : Tidak berwarna hijau metalik pada media EMB Agar atau tidak menggunakan sitrat pada media SSA
(*) : Warna koloni berwarna hijau metalik sedikit, berlendir dan ukuran koloni besar pada media EMB Agar
Gambar 4 Hasil amplifikasi gen penyandi 16S rRNA isolat E. coli dari tempe. Marker (M), isolat E. coli dari tempe (C3.12a-E4.33a), kontrol negatif (K-), kontrol positif (K+)
12
Tabel 2 Hasil BLASTN sekuen isolat E. coli dari tempe dan isolat medis
Kode isolat Homologi No. akses Ident.maks (%) E2.13b, E2.34b,
E2.44a, E4.13a E. coli str. JCM 1649 NR112558.1 100 C3.12a, C3.23a
E2.14a, E2.53b, E2.63a, E2.73a,
E4.33a, E4.43a E. coli str. JCM 1649 NR112558.1 99 E2.23a E. coli str. NBRC 102203 NR114042.1 99 E3.13b, E3.33a,
E3.63a, E3.53a,
E3.114a E. coli O157:H7 str.Sakai NR074891.1 99 E3.84a E. coli O157:H7 str.Sakai NR074891.1 98 E2.14b, E2.43b,
E2.73b, E2.83b, E2.34a E. coli str. JCM 1649 NR112558.1 98 E3.94a E. coli str. K-12 substr.
MG1655
NR102804.1 98 E2.13a, E2.53a E. coli str. JCM 1649 NR112558.1 97 E3.23b, E3.33b, E3.73a E. coli O157:H7 str.Sakai NR074891.1 97 E3.104a E. coli O157:H7 str.Sakai NR074891.1 96 E2.33a, E2.83a E. coli str. JCM 1649 NR112558.1 96 Medis 3 E. coli str. NBRC 102203 NR114042.1 98 Medis 2 E. coli str. NBRC 102203 NR114042.1 99
Analisis Profil Genetik ERIC-PCR dan Konstruksi Pohon Filogeni
Sekuen ERIC 33 isolat E. coli dari tempe dan 3 isolat medis berhasil diamplifikasi menggunakan primer ERIC 1R dan ERIC 2 (Gambar 5). Visualisasi profil ERIC-PCR menunjukkan bahwa pola pita isolat E. coli dari tempe berbeda dengan isolat medis. Pola pita isolat E. coli dari tempe menghasilkan pola pita yang unik berukuran 0.25 kb dan 1.0 kb. Terlihat bahwa tidak ada satupun isolat E. coli dari tempe yang menunjukkan pola pita identik dengan isolat medis.
13 Profil ERIC-PCR isolat E. coli dari tempe CLR menunjukkan pola yang sama sedangkan isolat E. coli dari tempe EMP memiliki pola yang beragam (Gambar 5). Meskipun profil genetik isolat E. coli dari tempe EMP lebih beragam dari tempe CLR tidak ada profil genetik yang sama ketika isolat E. coli dari tempe tersebut dibandingkan dengan E. coli DH5α.
Gambar 5 Profil ERIC-PCR E. coli dari tempe dan isolat medis. Marker (M), isolat E. coli dari tempe CLR (C3.12a, C3.23a), isolat E. coli dari tempe EMP (E2.13a-E4.33a), kontrol negatif (K-), E. coli DH5α (K+), E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3)
Pohon filogenetik profil ERIC-PCR (Gambar 6) menunjukkan kekerabatan antara isolat E. coli dari tempe dengan isolat medis. Berdasarkan pohon filogenetik ini tampak bahwa isolat E. coli dari tempe secara genetik berbeda dengan isolat medis sehingga berada pada grup terpisah. Isolat E. coli dari tempe membentuk 4 grup (grup I-IV), sedangkan isolat medis membentuk grup VI dan E. coli DH5α membentuk grup V.
14
Gambar 6 Pohon filogenetik ERIC-PCR E. coli menggunakan metode UPGMA melalui program MEGA 5.2 dengan 1000x bootstrap, E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3). Grup (1-VI)
Sebanyak 18 isolat E. coli dari tempe (Gambar 6) dianalisis ulang menggunakan ERIC-PCR untuk lebih lanjut dibandingkan keragaman genetiknya dengan isolat medis. Hasil pengulangan ERIC-PCR menunjukkan bahwa genetik isolat E. coli dari tempe dengan isolat medis konsisten berbeda (Gambar 7A). Isolat E. coli dari tempe membentuk 2 grup yaitu grup pertama (grup III) terdiri atas 4 isolat E. coli dari tempe EMP (isolat E4.13a, E4.33a, E2.43b, E3.33a) dan 2
15 isolat dari tempe CLR (isolat C3.23a dan C3.12a). Grup kedua (grup IV) terdiri atas 12 isolat E. coli dari tempe EMP (isolat E2.14a, E3.84a, E3.23b, E3.114a, E3.94a, E2.63a, E2.73a, E2.34a, E2.53b, E2.13a, E2.33a, E2.33a), sedangkan isolat medis membentuk grup I dan E. coli DH5α membentuk grup II (Gambar 7B).
Gambar 7 Hasil pengulangan profil genetik ERIC-PCR E. coli. Isolat E. coli dari tempe CLR (C3.12a, C3.23a), isolat E. coli dari tempe EMP (E2.13a-E4.33a), E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3). K. pneumoniae (outgroup) (A). Pohon filogenetik E. coli menggunakan metode UPGMA melalui program MEGA 5.2 dengan 1000x bootstrap (B). Grup (I-IV)
Pembahasan
Isolasi E. coli dari tempe dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat dari 10-2 sampai 10-5 pada media EMB. Media EMB digunakan sebagai media selektif dan diferensial untuk membedakan bakteri dari kelompok Enterobacteriaceae. Media ini disebut sebagai media selektif karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif seperti Staphylococcus spp. dan diferensial karena mengandung eosin dan methylene blue serta laktosa yang
16
berfungsi untuk membedakan bakteri yang memfermentasikan laktosa seperti Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugenosa, dan Salmonella. Bakteri yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan bakteri lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Hal ini terjadi karena adanya penurunan pH media yang menyerap indikator sehingga warna koloni menjadi hijau metalik (Madigan dan Martinko 2006). Setelah diuji dengan media SSA hanya 33 isolat yang menunjukkan positif E. coli yang ditandai dengan media berwarna hijau (Gambar 2C). Hasil ini menunjukkan bahwa E. coli tidak menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
Hasil identifikasi koloni yang diduga E. coli dari tempe DRG setelah dilakukan sekuensing dinyatakan sebagai Enterobacter aerogenes (Data tidak ditampilkan). Isolat tersebut setelah diuji konfirmasi menggunakan media SSA menunjukkan perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Hal tersebut mengindikasikan bahwa isolat tersebut negatif E. coli. Selain E. aerogenes ditemukan juga K. pneumoniae dari tempe EMP. Isolat K. pneumoniae tersebut kemudian dijadikan sebagai outgroup dalam analisis pohon filogenetik berdasarkan profil pita ERIC-PCR.
Keberadaan E. coli pada tempe sebelumnya telah dilaporkan oleh Barus et al. (2008). Keberadaan E. coli pada tempe bervariasi pada setiap pengambilan sampel ke-1 sampai ke-4 (Tabel 1). E. coli tidak selalu ditemukan pada keempat tempe (EMP, DRG, WJB, dan CLR) meskipun pada sampel yang sama. E. coli pada tempe kemungkinan berasal dari berbagai sumber, misalnya berasal dari bahan baku, alat yang digunakan, orang yang terlibat dalam pengolahan, dan lingkungan sekitarnya. Penyebaran E. coli dapat tejadi karena adanya kontaminasi silang secara langsung (melalui tangan) dan tidak langsung (melalui air) selama pengolahan. Keberadaan E. coli pada makanan menunjukkan bahwa makanan tersebut tercemar kotoran akibat pengolahan dan kebersihan pengolah makanan yang kurang baik. E. coli merupakan bakteri patogen yang sering dijadikan indikator sanitasi (Githiri et al. 2009).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Barus et al. (2008) kondisi proses pembuatan tempe WJB lebih higienis dibandingkan dengan kondisi proses pembuatan tempe EMP. Perbedaan kondisi tersebut kemungkinan yang menyebabkan tidak ditemukannya E. coli pada tempe WJB. Keberadaan E. coli pada tempe EMP dan CLR juga belum bisa dipastikan berasal dari kontaminasi silang secara langsung atau tidak langsung. Hasil pencawanan pada media EMB Agar yang diambil dari sampel air dan wadah pencampuran kedelai dengan ragi pada tempe EMP tidak ditemukan adanya pertumbuhan E. coli (Data tidak ditampilkan).
Pengambilan tempe segar dilakukan pada industri rumah tangga EMP, DRG, WJB dan CLR. Hanya satu (tempe WJB) diantar empat pengrajin yang melakukan perebusan kedelai 2 kali yaitu sebelum dan sesudah tahap perendaman kedelai. Sedangkan produsen tempe EMP, DRG dan CLR melakukan 1 kali perebusan kedelai yaitu sebelum perendaman kedelai (Lampiran 3). Perebusan kedua kedelai yang diaplikasikan pada proses WJB kemungkinan menurunkan jumlah Enterobacteriaceae termasuk E. coli didalamnya. Oleh sebab itu, kemungkinan adanya E. coli pada tempe EMP dan CLR dikarenakan tidak
17 dilakukan 2 kali perebusan. Barus et al (2008) menyatakan bahwa perbedaan cara pengolahan berpengaruh terhadap kelimpahan bakteri pada tempe.
Pendekatan metode molekuler untuk mendeteksi keberadaan E. coli adalah dengan mengamplifikasi sekuen DNA yang mengkodekan gen 16S rRNA. E. coli diamplifikasi dengan menggunakan primer 63f dan 1387r. Selama proses amplifikasi berlangsung, primer 63f mulai mengamplifikasi cetakan DNA pada posisi basa 43-63, sedangkan primer 1387r mengamplifikasi DNA pada posisi 1387-1370 sehingga produk yang dihasilkan berukuran 1.3 kb (Marchesi et al. 1998). Sekuen gen 16S rRNA digunakan sebagai penanda molekuler karena bersifat ubikuitis dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme dan memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif (Pangastuti 2006).
Analisis sifat virulensi dari suatu bakteri selain secara genetik dapat diketahui dari fenotipenya (Stenutz et al. 2006). Beberapa serotipe pada E. coli diketahui memiliki faktor virulensi diantaranya: serotipe O (somatik), serotipe H (flagella), dan serotipe K (kapsular) (Nataro dan Kaper 1998). Serotipe O157: H7 adalah serotipe yang dapat menginduksi sekresi cairan tubuh secara berlebihan dan terus menerus sehingga terjadi diare dan dapat menyebabkan meningitis. E. coli O157 sebagai pembawa gen VT1 dan VT2 paling banyak ditemukan pada babi (Suardana et al. 2007).
Pada penelitian ini, fragmen multiple DNA semua strain E. coli yang di amplifikasi dengan primer ERIC berkisar antara 4-13 pita diantara ukuran 0.25 kb dan 5.0 kb (Gambar 5). Hasil ini mengindikasikan luasnya keragaman genetik pada E. coli. Menurut Meacham (2003) perbandingan jumlah dan ukuran profil pita menunjukkan keragaman genetik isolat-isolat bakteri. Teknik ERIC-PCR menggunakan primer khusus untuk mengamplifikasi sekuen DNA yang berada diantara urutan ERIC yang berulang pada bakteri enterik Gram negatif (Hulton et al. 1991).
Isolat E. coli dari tempe memiliki ciri morfologi yang sama dengan isolat medis pada media EMB, namun dapat dilihat bahwa sifat genotipik isolat ini berbeda dengan isolat medis (Gambar 5). Pada penelitian ini, isolat medis diperoleh dari rumah sakit yang berasal dari feses pasien yang mengandung E. coli patogen. Oleh sebab itu, secara genetik isolat E. coli yang diperoleh dari tempe tidak sama dengan isolat medis yang berasal dari feses manusia.
Pohon filogenetik berdasarkan profil pita ERIC-PCR yang berasal dari 2 kali pengulangan menunjukkan bahwa isolat E. coli dari tempe konsisten membentuk grup yang terpisah dengan isolat medis (Gambar 7B). Isolat E. coli dari tempe CLR tidak menunjukkan adanya keragaman genetik tetapi isolat tersebut memiliki kekerabatan dengan beberapa isolat E. coli dari tempe EMP sehingga tergabung dalam grup III (Gambar 7B). Berbeda dengan isolat E. coli dari tempe CLR, isolat E. coli dari tempe EMP menunjukkan adanya keragaman genetik. Pola hubungan kekerabatan isolat E. coli dari tempe EMP ada yang berkerabat dekat namun ada pula yang berkerabat jauh. Hal ini menunjukkan bahwa isolat E. coli dari tempe EMP memiliki keragaman yang tinggi. Sampel tempe yang sama dapat membawa genotip yang berbeda dari E. coli. Dilain pihak, genotip yang sama dapat ditemukan didalam sampel tempe yang berbeda.
Analisis ERIC-PCR digunakan untuk melakukan perbandingan dan deteksi spesies atau subspesies E. coli dari tempe. Teknik ini dapat membedakan profil
18
intraspesies bakteri. Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa teknik ERIC-PCR telah berhasil membedakan profil genetik isolat E. coli dari tempe dengan isolat medis dan mampu bersifat diskriminatif dibandingkan dengan analisis gen 16S rRNA. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa ERIC-PCR telah berhasil mengamplifikasi sekuen ERIC Klebsiella spp. yang berasal dari tempe dan memperoleh hasil yang lebih diskriminatif dari sekuen 16S rRNA (Barus et al. 2013). Ayu et al. (2014) melaporkan bahwa ERIC-PCR juga mampu membedakan profil genetik K. pneumoniae dari tempe dengan K. pneumoniae medis. Selain itu, ERIC-PCR juga dapat digunakan untuk membedakan bakteri Gram positif seperti Staphylococcus sp. dan Streptococcus sp. (Versalovic et al. 1991; de Bruijn 1992; Ventura et al. 2003; Szczuka dan Kaznowski 2004). Kelemahan analisis ERIC-PCR adalah penggunaan kondisi PCR dan waktu elektroforesis yang lebih lama dibandingkan dengan PCR dan elektroforesis biasa. Namun demikian, analisis dengan teknik ERIC-PCR ini merupakan metode yang dapat digunakan untuk membandingkan intraspesies isolat E. coli dari tempe dengan isolat medis.
Hasil analisis ERIC-PCR menunjukkan bahwa secara genetik isolat E. coli dari tempe berbeda dengan isolat medis. Belum ada laporan yang menyebutkan bahwa mengkonsumsi tempe yang mengandung E. coli akan menyebabkan sakit. Secara estetika, tempe yang diproduksi dalam kondisi tidak higienis pada umumnya akan mengandung E. coli. Tetapi, itu tidak berarti bahwa tempe mengandung bakteri yang berbahaya.
SIMPULAN
Simpulan
Tidak semua tempe mengandung E. coli dan keberadaan E. coli pada tempe ditingkat produsen tidak selalu konsisten ditemukan pada setiap produksi. Identifikasi berdasarkan gen penyandi 16S rRNA menyatakan bahwa 33 isolat dari tempe EMP dan CLR merupakan E. coli dengan kemiripan sebesar 96%-100%. Hasil analisis profil DNA genetik menggunakan ERIC-PCR menunjukkan bahwa isolat E. coli dari tempe EMP dan CLR berbeda dengan E. coli patogen atau yang berasosiasi dengan isolat medis.