Hasil dan Pembahasan 1 Seleksi Primer - solanacearum ) PADA TOMAT

solanacearum ) PADA TOMAT

5.3 Hasil dan Pembahasan 1 Seleksi Primer

Identifikasi ketahanan tomat terhadap penyakit layu bakteri berdasarkan marka SSR dimulai dengan melakukan seleksi primer. Sepuluh primer SSR yang dipilih berdasarkan Parmar et al. (2013) dan Areshchenkova (2000) diuji dengan

menggunakan enam genotipe terpilih yang mewakili tetua tahan, tetua rentan, dan generasi F1 masing-masing dua genotipe.

Produk PCR dielektroforesis dengan menggunakan agarose dan PAGE. Hasil elektroforesis menggunakan agarose ditunjukkan pada Gambar 14. Produk PCR teramplifikasi dengan bagus dan menunjukkan pita yang jelas, namun tidak mampu menunjukkan perbedaan di tiap genotipenya. Setelah memastikan produk PCR bagus, maka selanjutnya dilakukan analisis dengan menggunakan PAGE.

Gambar 15 dan 16 merupakan hasil PAGE kesepuluh primer yang digunakan. TMS 1 memiliki letak pita target pada ukuran 134 bp (Tabel 9). Keempat genotipe yang digunakan menunjukkan tidak adanya perbedaan antara genotipe tahan dan genotipe rentan. Ini menandakan bahwa primer TMS 1 tidak dapat menjadi penanda ketahanan penyakit layu bakteri pada tomat. Hal serupa juga terjadi pada primer TMS 2, TMS 8, TMS 17, dan SSR 67. Pada primer TMS 4 semua genotipe tidak memberikan hasil amplifikasi. Primer TMS 6 menunjukkan bahwa genotipe Situbondo Gelombang tidak memberikan hasil pita amplifikasi pada ukuran 335 bp, namun Kudamati 1, Meranti 2, dan Lombok 4 memberikan hasil pita amplifikasi. Primer TMS 7 dan TMS 9 pada ketiga genotipe (Kudamati 1, Situbondo Gelombang, dan Meranti 2) memberikan hasil pita target pada ukuran 170 bp dan 360 (Tabel 9), namun Lombok 4 tidak memberikan hasil pita amplifikasi (primer TMS 7) dan ukuran pita yang berbeda dari ketiga genotipe lainnya (primer TMS 9). Diduga primer TMS 7 dan TMS 9 merupakan penanda karakter lain.

Menurut Parmer et al. (2013) primer SSR 67 dan TOM 144 terkait

ketahanan terhadap penyakit layu Fusarium pada tomat. Primer SSR 67 yang memberikan hasil pita amplifikasi pada ukuran 900 bp (Tabel 9) menunjukkan tidak ada perbedaan antara genotipe tahan dan rentan. Berbeda dengan primer TOM 144, hasil pita amplifikasi menunjukkan perbedaan yang jelas antara genotipe tahan dan rentan.

Gambar 14 Hasil elektroforesis 10 primer dengan menggunakan agarose. L=ladder,

1=Kudamati 1, 2=Situbondo Gelombang, 3=Lombok 4, 4=Meranti 2, 5= F1

Gambar 15 Hasil elektroforesis 5 primer dengan menggunakan PAGE. L=ladder,

1=Kudamati 1, 2=Situbondo Gelombang, 3=Lombok 4, 4=Meranti 2, 5= F1

(Kudamati 1 x Lombok 4), 6=F1 (Situbondo Gelombang x Meranti 2)

Gambar 16 Hasil elektroforesis 5 primer dengan menggunakan PAGE. L=ladder,

1=Kudamati 1, 2=Situbondo Gelombang, 3=Lombok 4, 4=Meranti 2, 5= F1

(Kudamati 1 x Lombok 4), 6=F1 (Situbondo Gelombang x Meranti 2)

5.3.2 Bulk Segregant Analysis (BSA)

Kegiatan BSA dilakukan untuk mengkonfirmasi hasil dari seleksi primer. BSA dilakukan dengan menggunakan sepuluh primer dan dua sampel bulk

populasi bersegregasi F2.

Gambar 17 Hasil elektroforesis 10 primer dengan menggunakan agarose. L=ladder,

T=bulk tahan, R=bulk rentan

Gambar 18 Hasil elektroforesis 10 primer dengan menggunakan PAGE. L=ladder,

Gambar 17 dan 18 menunjukkan hasil amplifikasi pada agarose dan PAGE.

Produk hasil amplifikasi memiliki kualitas yang bagus berdasarkan hasil elektroforesis pada agarose yang ditampilkan pada Gambar 17. Analisis

selanjutnya dilakukan dengan menggunakan PAGE yang mana hasilnya ditampilkan pada Gambar 18.

Gambar 18. menunjukkan hasil PAGE pada dua bulk dengan menggunakan 10

primer terpilih. Dari hasil elektroforesis dapat dilihat bahwa primer TMS 1 tidak memberikan perbedaan antara bulk tahan rentan, begitu juga dengan ke delapan

primer lainnya. Dari 10 primer tersebut, primer TOM 144 memberikan perbedaan antara bulk tahan dan bulk rentan. Hal ini menunjukkan bahwa primer ini dapat

membedakan individu yang tahan dan rentan.

5.3.3 Aplikasi Marka SSR Pada Genotipe Tomat Lokal Koleksi

Identifikasi ketahanan tomat terhadap penyakit layu bakteri dilakukan dengan menggunakan primer TOM-144. Hasil elektroforesis produk PCR pada agarose dan PAGE ditampilkan pada Gambar 11 dan 12.

Gambar 190 Hasil elektroforesis 5 primer dengan menggunakan agarose. L=ladder,

1=Aceh 1, 2=Aceh 2, 3=Aceh 3, 4=Aceh 5, 5=Bajawa, 6=Cherry NTT, 7=Gondol Lonjong, 8=Kali Acai, 9=Kefamenanu 3, 10=Kefamenanu 6, 11=Kefamenanu7, 12=Kefamenanu 9, 13=Kefamenanu 12, 14=Kefamenanu 14, 15=Khemir, 16=Kudamati 1, 17=Kudamati 3, 18=Lombok 1, 19=Lombok 2, 20=Lombok 3, 21=Lombok 4, 22=Makasar 1, 23=Makasar 2, 24=Makasar 3, 25=Makasar 4, 26=Meranti 1, 27=Meranti 2, 28=Situbondo Bulat Kecil, 29=Situbondo Gelombang, 30=Tanah Datar

Gambar 19 menunjukkan bahwa produk PCR teramplifikasi dengan bagus dan jelas, namun masih belum mampu untuk memperlihatkan perbedaan. Elektroforesis dengan menggunakan PAGE memberikan tampilan visualisasi pita amplifikasi yang berbeda antara genotipe tahan dan rentan (Gambar 20). Terlihat bahwa pita antara genotipe tahan dan rentan berbeda hanya beberapa pasang basa saja.

Gambar 200 Hasil elektroforesis 5 primer dengan menggunakan agarose. L=ladder,

5.3.4 Pembahasan

Beberapa faktor yang mempengaruhi rendahnya produktifitas tomat adalah teknik agronomi yang belum optimal, penanaman tanpa rotasi, penggunaan bibit yang tidak bersertifikat, dan adanya cekaman biotik dan abiotik, yang termasuk di dalamnya serangan nematoda, jamur, virus, bakteri, dan lain sebagainya (Chaudhry & Rashid 2011). Salah satu bakteri yang sering menyerang pertanaman tomat di daerah tropis dan subtropis adalah R. solanacearum yang menyebabkan

penyakit layu bakteri. Menurut Mansfield et al. (2012), R. solanacearum

merupakan patogen nomor dua paling merugikan setelah Pseudomonas syringae

di dunia. Patogen ini sangat merugikan secara ekonomi terutama karena kisaran inangnya yang luas, sehingga penanaman varietas tahan menjadi langkah awal dalam pengendaliannya. Selain itu menurut Keller et al. (2000), budidaya varietas

tahan adalah salah satu prasyarat dari kegiatan pertanian berkelanjutan.

Beberapa varietas komersial yang belum mampu konsisten tahan terhadap penyakit layu bakteri mendorong dilakukannya introduksi plasma nutfah, terutama karena Indonesia merupakan negara kepulauan yang memiliki banyak plasma nutfah. Plasma nutfah memiliki beberapa sifat penting yang dapat dimanfaatkan, seperti karakter ketahanannya terhadap serangan organisme pengganggu tanaman.

Kegiatan pemuliaan tanaman dalam menyeleksi genotipe yang tahan terhadap suatu penyakit semakin dipermudah dengan adanya penanda molekuler.

Penggunaan penanda molekuler untuk mengidentifikasi alel ketahanan memberikan kontribusi penting dalam kegiatan pemuliaan (Da Silva et al. 2003).

Salah satu penanda molekuler yang sering digunakan dalam deteksi penyakit adalah Simple Sequence Repeat (SSR), yang telah dilaporkan dapat digunakan

sebagai penanda karakter ketahanan terhadap penyakit layu Fusarium pada tomat (Parmar & Subaramanian 2011).

Identifikasi ketahanan terhadap layu bakteri dengan marka SSR dilakukan dengan menggunakan 10 primer yang dinyatakan bersifat polimorfik pada tomat (Parmar et al. 2013; Areshchenkova 2000). Gambar 14, 17, dan 19 menunjukkan

tampilan produk PCR yang dielektroforesis dengan menggunakan agarose 1.5%, dan Gambar 15, 16, 18, dan 20 elektroforesis dengan menggunakan PAGE. Dari kedua media elektroforesis tersebut terlihat bahwa terdapat perbedaan hasil elektroforesis.

Agarose sebagai media elektroforesis memang lebih banyak digunakan

karena bersifat murah, mudah didapat, dan sederhana dalam pelaksanaannya. Hingga saat ini agarose masih dipakai untuk kepentingan analisis RAPD, ISSR,

dan SNP. Namun, agarose juga memiliki beberapa kelemahan, di antaranya:

tingkat resolusi dan separasi yang rendah bila dibandingkan dengan PAGE. Di sisi lain penggunaan PAGE memiliki beberapa keterbatasan, yaitu: membutuhkan keahlian khusus dan waktu yang lebih lama dalam proses separasi serta pewarnaannya. Namun penggunaan PAGE memungkinkan untuk didapatnya hasil separasi yang bagus dengan tingkat resolusi dalam memisahkan DNA yang tinggi. Terutama dalam analisis SSR yang menuntut ketelitian per basa nya, penggunaan PAGE sangat direkomendasikan. Penggunaan PAGE memungkinkan untuk melihat perbedaan alel yang hanya beberapa basa yang tidak dapat ditampilkan penggunaan agarose.

Perbedaan hasil elektroforesis antara penggunaan agarose dan PAGE secara

nyata terlihat pada primer TOM-144, dimana hasil agarose tidak mampu

menunjukkan perbedaan antara genotipe tahan dan rentan, sedangkan PAGE mampu. Hasil elektroforesis menggunakan agarose juga tidak mampu

membedakan genotipe homozigot dan heterozigot (tetua dan F1). Genotipe F1 dan

bulk tahan memberikan tampilan adanya dua pita yang terseparasi (Gambar 16 dan

18), sedangkan bulk rentan hanya menghasilkan satu pita (Gambar 18). Berdasarkan

hasil elektroforesis PAGE dapat dilihat bahwa SSR sebagai penanda molekuler yang memanfaatkan sekuen berulang pada genom individu dapat membedakan individu homozigot atau heterozigot (bersifat kodominan).

Tanaman dari populasi bersegregasi dapat dikelompokkan menurut ekspresi fenotipik sifat dan diuji untuk perbedaan frekuensi alel dengan menggunakan metode bulk segregant analysis (BSA) (Quarrie et al. 1999). Menurut Michelmore et al. (1991) BSA adalah suatu prosedur cepat yang dikembangkan untuk

mengidentifikasi penanda di daerah tertentu dari genom. Metode ini melibatkan perbandingan antara dua sampel DNA yang dikumpulkan dari beberapa individu dari suatu populasi. Setiap bulk dibuat berdasarkan sifat tertentu yang identik.

Bulk yang digunakan merupakan kumpulan stok DNA yang mencirikan

resistensi terhadap penyakit layu bakteri di lapang, yaitu bulk tahan dan rentan. BSA memungkinkan pengerjaan molekuler menjadi lebih efektif dan efisien.

Hasil seleksi primer pada tetua dan bulk populasi F2 menunjukkan bahwa TOM-144 dapat membedakan ketahanan tomat terhadap penyakit layu bakteri. Primer ini menunjukkan genotipe tahan memiliki ukuran 1 0 bp sedangkan genotipe rentan di bawah 1 0 bp dan untuk genotipe yang bersifat heterozigot

maka hasil elektroforesis menunjukkan ada dua alel yang terlihat.

Gambar 20 menunjukkan hasil elektroforesis dengan menggunakan primer TOM-144 mampu mengelompokkan genotipe berdasarkan resistensinya terhadap penyakit layu bakteri. Ada sembilan genotipe yang diduga tahan berdasarkan marka SSR, yaitu genotipe Gondol Lonjong, Khemir, Kudamati 1, Kudamati 3, Lombok 1, Makasar 2, Situbondo Bulat Kecil, Situbondo Gelombang, dan Tanah Datar. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa genotipe yang tahan dan rentan hanya berbeda beberapa pasang basa. Hal inilah yang mendorong SSR dielektroforesis dengan menggunakan vertikal gel dibandingkan dengan menggunakan agarose, dimana pada Gambar 18 hasil elektroforesis dengan agarose tidak mampu membedakan genotipe tahan dan rentan.

Percobaan ini dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu seleksi primer, konfirmasi BSA populasi F2, dan identifikasi genotipe koleksi dengan menggunakan primer terpilih. Identifikasi genotipe koleksi menggunakan primer TOM-144 dibandingkan pula dengan data lapangan, dimana tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kedua hasil percobaan. TOM-144 dengan tegas mampu memberikan perbedaan antara genotipe tahan dan rentan. Dengan didapatnya primer TOM-144 sebagai penanda karakter ketahanan terhadap penyakit layu bakteri pada tomat, diharapkan kegiatan pemuliaan tomat dapat lebih mudah dilakukan. Pemulia dapat memanfaatkan primer tersebut untuk menyeleksi genotipe atau varietas baru dengan efektif dan efisien.

5.4 Kesimpulan

Identifikasi marka SSR memperoleh primer TOM-144 yang diduga bersifat polimorfik terhadap ketahanan penyakit layu bakteri. Hasil elektroforesis pada vertikal gel menunjukkan bahwa skreening primer dan BSA pada populasi F2 mengindikasikan primer TOM 144 merupakan penanda yang diduga spesifik terhadap karakter ketahanan tomat terhadap penyakit layu bakteri. Berdasarkan penanda SSR, diketahui bahwa ada sembilan genotipe tomat lokal yang diduga tahan terhadap penyakit layu bakteri, yaitu genotipe Gondol Lonjong, Khemir, Kudamati 1, Kudamati 3, Lombok 1, Makasar 2, Situbondo Bulat Kecil, Situbondo Gelombang, dan Tanah Datar.

5.5 Daftar Pustaka

Areshchenkova T. 2000. Isolation, characterization and mapping of microsatellites from the tomato genome and their application in molecular analysis of centromeric regions [disertasi]. Halle (DE): Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research.

Ashkani S, Rafii MY, Sariah M, Akmar ASN, Rusli I, Rahim A, Latif MA. 2011. Analysis of simple sequence repeat markers linked with blast disease resistance genes in a segregating population of rice (Oryza sativa). Genetics and Molecular Research. 10(3):1345-1355.

Bi-hao C, Jian-ju L, Yong W, Guo-jo C. 2009. Inheritance and identification of SCAR marker linked to bacterial wilt-resistance in eggplant. African Journal of Biotechnology. 8(20):5201-5207.

Boluarte T. 1999. Bulk segregant analysis for anther culture response and leptine content in backcross families of diploid potato [disertasi]. Blacksburg (US): Virginia Polytechnic Institute and State University.

Chaudhry Z, Rashid H. 2011. Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum from infected tomato plants of soan skesar valley of Punjab. Pak. J. Bot. 43(6):2979-2985.

Da Silva GF, Dos Santos JB, Ramalho MAP. 2003. Identification of SSR and RAPD markers linked to a resistance allele for angular leaf spot in the common bean (Phaseolus vulgaris) line ESAL 550. Genetica and Molecular Biology. 26(4):459-463.

Haquarsum EJV, Sutjahjo SH, Herison C, Rustikawati, Yudiansyah, Marwiyah Siti.

2015. CTAB’s modification: high-quality plant DNA extraction of tomato for PCR with heat shock treatment. Makalah telah diseminarkan di Seminar Internasional SABRAO ketigabelas. 14-16 September 2015.

Keller B, Feuillet C, Messmer M. 2000. Mechanisms of resistance to plant disease. Kluwer Academic Publisher. pp. 101-160.

Kumar P, Gupta VK, Misra AK, Modi DR, Pandey BK. 2009. Potential of molecular markers in plant biotechnology. Plant Omics Journal. 2(4):141-

162.

Langridge P, Chalmers K. 2004. The principle: Identification and application of molecular markers. Biotechnology in Agriculture and Forestry. pp. 55.

Mansfield J, Genin S, Magori S, Citovsky V, Sriariyanum M, Ronald P, Dow M, Verdier V, Beer SV, Machado MA, Toth I, Salmond G, Foster GD. 2012. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13(6):614-629.

Michelmore RW, Paran I, Kesseli RV. 1991. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in spesific genomic regions by using segregating population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9828-9832.

Mohan M, Nair S, Bhagwat A, Krishna TG, Yano M, Bhatia CR, Sasaki T. 1997. Genome mapping, molecular markers, and marker-assisted selection in crop plants. Mol. Breed. 3:87-103.

Ovesná J Poláková K Leišová L. 2002. DNA analysis and their applications in plant breeding. Czech J. Genet. Pl. Breed. 38(1):29-40.

Panthee DR, Chen F. 2010. Genomics of fungal disease resistance in tomato.

Current Genomics. 11(1):30-39.

Parmar P, Subramanian RB. 2011. PCR based method for testing Fusarium wilt resistance of tomato. African Journal of Basic & Applied Science. 3

(5):219-222.

Parmar P, Sudhir A, Preethi R, Dave B, Panchal K, Subramanian RB, Patel A, Kathiria KB. 2013. Identification of a SSR marker (TOM-144) linked to Fusarium wilt resistance in Solanum lycopersicum. American Journal of Molecular Biology. 3:241-247.

Quarrie SA Lazić-Jančić V Kovačević D Steed A Pecić S. 1 . Bulk segregant

analysis with molecular markers and its use for improving drought resistance in maize. Journal of Experimental Botany. 50(337):1299-1306.

Tommasini L, Batley J, Arnold GM, Cooke RJ, Donini P, Lee D, Law JR, Lowe C, Moule C, Trick M, dan Edwards KJ. 2003. The development of multiplex simple sequence repear (SSR) markers to complement distinctness, uniformity and stability testing of rape (Brassica napus L.)

Yang CY. 1979. Bacterial and fungal disease of tomatoes. Di dalam: First Intl. Symp. On Tropical Tomato. AVRDC, Shanhua, Taiwan. pp. 111-123.

Dalam dokumen Seleksi Dan Studi Pewarisan Serta Pengembangan Marka Ssr Penanda Ketahanan Terhadap Penyakit Layu Bakteri (Ralstonia Solanacearum) Pada Tomat (Halaman 58-68)