Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron
donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG)
pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG).
Sintesis Senyawa Arilamida-2
Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin (Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme reaksi disajikan pada gambar 2.
8
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil.
Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain). Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c. Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena
9
kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019) sehingga mudah menguap sempurna (volatile).
Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi (Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada Lampiran 2b.
Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk) dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich, 2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan. Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar.
10
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2
Pelarut Senyawa Arilamida-2 Perbandingan Kategori Kelarutan FI V n-heksana sangat sukar larut 1: 1000
Kloroform larut 1:30
Etil asetat larut 1:20
Aseton agak sukar larut 1:60
Etanol agak sukar larut 1:100
Air sangat sukar larut 1:1000
DMSO larut 1:30
Elusidasi Struktur
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti
Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 X
11
Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
Proton Geseran
kimia (ppm)
Integrasi Splitting J Coupling Constant (Hz) HA 1,39 3 triplet 7,7 HB 2,85 dan 2,98 2 triplet of triplet 6,3 dan 6,3 HC 3,71 dan 3,89 2 triplet of triplet 6,3 dan 6,3 HD 4,30 2 quartet 7,7 HE 7,61 2 doublet 7,7 HF 8,02 2 doublet 7 Pelarut (X) 7,26 - singlet -
H2O (Y) 1,60 - singlet -
Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda. Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a.
Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J= 6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm (integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet. Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit
12
terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson, 2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c.
Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d.
Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm. Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f. Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF. Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson, 2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan sinyal H2O (Fulmer et al., 2010).
Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar 4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop 13 karena kelimpahan isotop 13C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004). Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai
13
dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom O ester yang merupakan gugus penarik elektron.
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE
14
lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al., 2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010).
Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Karbon Geseran kimia (ppm)
CA 14,4 CB 26,7 CC 39,6 CD 60,9 CE 118,9 CF 126,4 CG 130,9 CH 141,5 CI 166,1 CJ 167,9 Pelarut (X) 77 Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi struktur dilanjutkan dengan menggunakan instrumen spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal (benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan
15
pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O). C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1 menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464 cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis.
(a)
(b)
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004)
HN-C=O R-O-C=O C=O daerah sidik jari daerah sidik jari
16 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gas-spektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak. Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil sintesis <200oC sehingga dapat diaplikasikan pada kromatografi gas dengan suhu detektor 300oC. Hasil percobaan menunjukan bahwa senyawa hasil sintesis sudah murni secara kromatografi gas ditunjukan dengan munculnya satu puncak pada kromatogram (Rt 37 menit). Hasil kromatografi gas disajikan pada gambar 6(a).
(a)
(b)
Gambar 6.Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 Pada gambar hasil spektrum massa (gambar 6(b)) terjadi perekaman
senyawa utuh hasil sintesis dengan isotop atom Br 79 g/mol yaitu sebesar m/z 299 pada spektrum paling kanan. Pola fragmentasi base peak (pola fragmentasi tertinggi
17
dan stabil) pada spektrum tersebut memiliki massa relatif per ion sebesar m/z 120. Mekanisme fragmentasi tersebut dapat dilihat pada lampiran 5a dan 5b.
Uji Aktivitas In Vitro
Pada uji aktivitas in vitro, MMP-9 direaksikan dengan substrat peptida untuk memutus ikatan peptidanya. Substrat merupakan peptida yang dihubungkan gugus fluorofor (Aminometil kumarin) (Niccoloti, 2012) yang akan diputus ikatan peptidanya oleh MMP-9 sehingga gugus fluorofornya terlepas dan terbaca fluoresensinya sebagai aktivitas enzim. Kontrol positif pada pengujian ini adalah peptida NNGH (Arg-Arg-Gly-His) (Biovision, 2019).
Pengujian in vitro pada arilamida-2 menunjukan persentase penghambatan aktivitas enzim sebesar 36% pada konsentrasi 200 µg/mL. Pada konsentrasi ini, senyawa arilamida-2 termasuk dalam kategori aktivitas rendah-sedang (Aderogba
et al., 2013) sehingga masih dapat dioptimasi konsentrasinya untuk mengetahui
kemungkinan aktivitas yang lebih baik. Namun, akibat keterbatasan sumber daya (bahan baku) hal tersebut tidak dapat dilakukan dan disarankan untuk penelitian selanjutnya. Optimasi konsentrasi dapat dilakukan hingga ≤ 500 µM (batas aktivitas IC50) untuk memberikan aktivitas yang baik (Zu, et al., 2013), jika lebih dari itu maka dapat dilakukan optimasi kembali strukturnya. Aktivitas yang rendah-sedang dari senyawa arilamida-2 dapat disebabkan karena arilamida-2 hanya mengambil satu karakteristik gugus pada posisi para cincin arilamida senyawa 2 Dufour et al. 2011 yaitu EWG (ester etil benzoat). Aktivitas arilamida-2 secara strukturnya dapat ditingkatkan melalui optimasi struktur dengan penambahan gugus berkarakter EDG seperti -NH-R, -NH-Ph, dan -Ph (McMurry, 2016). Tabel hasil uji aktivitas in vitro disajikan pada tabel IV.
18
Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro
Aktivitas enzim = rata-rata/32332 x 100%, Penghambatan enzim = 100 – aktivitas enzim KESIMPULAN
Senyawa turunan arilamida-2 dapat disintesis dari benzokain dan 3-bromopropionil klorida melalui reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) dengan katalisator piridin berupa serbuk putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO, memiliki jarak lebur 116-124oC serta memiliki aktivitas penghambatan kategori rendah-sedang terhadap MMP-9 secara in vitro sebesar 36 % pada konsentrasi 200 µg/mL.
SARAN
Penelitian ini merupakan skrining awal untuk uji aktivitas in vitro sehingga konsentrasi sampel masih dapat dioptimasi lagi untuk mendapatkan nilai persentase penghambatan enzim yang lebih representatif. Optimasi konsentrasi sampel tidak lebih dari 500 µM. Jika lebih dari itu, untuk meningkatkan aktivitasnya struktur senyawa perlu dioptimasi dan didesain ulang dengan mempertimbangkan hubungan struktur dan aktivitas.
Sampel Fluoresensi
Rata-rata Aktivitas enzim (%) Penghambatan enzim (%) ±SD R1 R2 R3 Blanko 9683 9349 9217 9416 0 0 Kontrol negatif 32989 33687 30321 32332 100 0 Turunan arilamida-2 23807 25072 23946 24275 64 36±3,03 Kontrol positif (peptida NNGH) 5946 5946 7898 6597 0 100±4,92
19