Pada penelitian ini padi varietas diferensial dan galur-galur uji memberikan respon ketahanan yang berbeda-beda terhadap penyakit Hawar Daun Bakteri (HDB). Hal ini ditunjukkan pada Gambar 4
Gambar 4 Galur padi yang tahan terhadap penyakit HDB (IS≤20%) (1), galur padi yang agak tahan terhadap penyakit HDB (20%<IS≤40%) (2), dan galur padi yang peka terhadap penyakit HDB (IS>40%) (3)
a. Respon ketahanan varietas diferensial (IRBB)
Varietas diferensial menunjukkan respon yang berbeda terhadap ras III, ras IV dan ras VIII (Tabel 6). Untuk varietas-varietas diferensial yang memiliki satu gen ketahanan (monogenik), respon paling tahan ditunjukkan oleh varietas padi IRBB7 yang mengandung gen ketahanan Xa7, dimana varietas IRBB7 ini mampu bertahan terhadap serangan patogen ras III, ras IV dan ras VIII dengan panjang serangan 0%. Selanjutnya respon ketahanan ditunjukkan pada varietas diferensial IRBB5 yang mengandung gen ketahanan Xa5 dan IRBB21 yang mengandung gen
1 2 3
ketahanan Xa21. Pada padi IRBB5, memperlihatkan respon tahan terhadap serangan patogen ras III dan ras IV, serta respon agak tahan terhadap ras VIII, dengan intensitas serangan berturut-turut 7.60%, 12.08% dan 23.57%.
Padi IRBB21, memperlihatkan respon tahan terhadap patogen ras III dan ras VIII, serta respon agak tahan terhadap patogen ras IV, dengan intensitas serangan berturut-turut 5.60%, 15.88% dan 21.28% (Tabel 6).
Tabel 6 Respon ketahanan padi varietas diferensial terhadap HDB
No Varietas Gen
Respon ketahanan terhadap HDB
Ras III Ras IV Ras VIII
IS (%) Respon IS (%) Respon IS (%) Respon
1 IRBB1 Xa1 10.20 T 36.00 AT 51.53 P 2 IRBB2 Xa2 10.10 T 37.08 AT 50.43 P 3 IRBB3 Xa3 9.70 T 49.75 P 56.35 P 4 IRBB4 Xa4 9.70 T 47.90 P 49.33 P 5 IRBB5 Xa5 7.60 T 12.08 T 23.57 AT 6 IRBB7 Xa7 0.00 T 0.00 T 0.00 T 7 IRBB8 Xa8 11.10 T 46.83 P 32.05 AT 8 IRBB10 Xa10 11.20 T 53.00 P 46.67 P 9 IRBB11 Xa11 10.80 T 52.38 P 50.22 P 10 IRBB13 Xa13 9.00 T 44.32 P 46.22 P 11 IRBB14 Xa14 12.20 T 53.25 P 43.22 P 12 IRBB21 Xa21 5.60 T 21.28 AT 15.88 T 13 IRBB50 Xa4+Xa5 5.40 T 5.05 T 11.82 T 14 IRBB51 Xa4+Xa13 10.10 T 46.08 P 46.22 P 15 IRBB52 Xa4+Xa21 4.20 T 12.92 T 9.45 T 16 IRBB53 Xa5+Xa13 3.40 T 4.70 T 6.25 T 17 IRBB54 Xa5+Xa21 3.80 T 5.47 T 5.62 T 18 IRBB56 Xa4+Xa5+Xa13 5.80 T 5.63 T 11.37 T 19 IRBB57 Xa4+Xa5+Xa21 10.00 T 40.00 AT 30.35 AT 20 IRBB58 Xa4+Xa13+Xa21 8.10 T 8.82 T 17.50 T 21 IRBB64 Xa4+Xa5+Xa7+Xa21 1.10 T 0.22 T 3.03 T 22 IRBB66 Xa4+Xa5+Xa7+Xa13 +Xa21 1.20 T 1.48 T 3.22 T 23 TN1 43.70 P 79.93 P 63.65 P
Keterangan: T: Tahan, AT: Agak Tahan, P: Peka.
Varietas diferensial IRBB1 yang mengandung gen Xa1, relatif memiliki kesamaan dengan varietas IRBB2 yang mengandung gen Xa2. Keduanya memiliki respon yang sama terhadap patogen. Varietas IRBB1 dan IRBB2 tahan terhadap patogen ras III, agak tahan terhadap ras IV dan peka terhadap ras VIII. Respon lain ditunjukkan oleh varietas IRBB8 yang mengandung gen ketahanan Xa8. Varietas IRBB8 ini tahan terhadap patogen ras III, agak tahan pada ras VIII, tetapi peka terhadap patogen ras IV. Varietas diferensial yang lain menunjukkan respon tahan terhadap patogen ras III tetapi peka terhadap patogen ras IV dan VIII.
Tabel 6 memperlihatkan beberapa gen ketahanan HDB yang berbeda memiliki respon yang sama terhadap gen virulen pathogen ras tertentu. Misalnya gen Xa1 dan Xa2 yang memiliki respon sama terhadap ras III, ras IV dan ras VIII. Hal ini mungkin dipengaruhi oleh interaksi gene to gene antara gen ketahanan HDB pada tanaman inang dan gen virulen (avr) pada patogen HDB. Pada tanaman inang umumnya gen yang memberikan respon tahan bersifat dominan 13
(R), sedangkan gen yang memberikan respon rentan bersifat resesif (r). Pada patogen, gen avirulen (tidak memiliki kemampuan untuk menginfeksi) bersifat dominan (Avr), sedangkan gen virulen (mampu menginfeksi) bersifat resesif (avr). Pada interaksi Avr-R bersifat incompatible, artinya tanaman inang memiliki gen ketahanan (R) yang mampu mengenali gen avirulen (Avr) dari patogen sehingga tanaman bersifat tahan. Interaksi Avr-r bersifat compatible, tanaman tidak memiliki gen ketahanan R untuk mengenali gen avirulen dari patogen sehingga patogen dapat menyerang dengan gen virulen yang lain.interaksi avr-R menyebabkan respon rentan karena meskipun tanaman mempunyai gen ketahanan R , patogen tidak memiliki gen avirulen yang dikenali oleh gen ketahanan R sehingga mekanisme pertahanan tidak diaktifkan. Interaksi avr-r menimbulkan reaksi rentan karena tanaman tidak memiliki ketahanan dan patogen bersifat virulen sehingga patogen menyerang tanaman (Agrios 2005). Dengan demikian diduga bahwa gen-gen ketahanan yang memiliki respon sama tersebut sama-sama bersifat dominan pada ras tertentu sehingga bersifat incompatible pada satu ras atau beberapa ras tertentu.
Varietas diferensial yang memiliki dua gen ketahanan (digenik) dan varietas diferensial yang memiliki lebih dari dua gen ketahanan (multigenik) ternyata memiliki respon yang berbeda dengan varietas yang monogenik. Hal ini biasa disebut dengan pyramiding gene effect. Efek ini dapat menimbulkan respon positif (tahan). Varietas yang menunjukkan pyramiding gene effect pada penelitian ini salah satunya adalah varietas IRBB50 (Xa4+Xa5). Gen Xa4 yang berada dalam keadaan tunggal (single gene) menunjukkan respon tahan terhadap patogen ras III, tetapi peka terhadap patogen ras IV dan ras VIII, sedangkan Xa5 dalam keadaan gen tunggal menghasilkan respon tahan terhadap patogen ras III dan ras IV, serta agak tahan terhadap patogen ras VIII. Jika kedua gen tersebut terdapat dalam satu varietas seperti pada varietas diferensial IRBB50, maka akan menghasilkan respon positif yang tahan terhadap semua serangan patogen ras III, ras IV dan ras VIII. Respon positif yaitu tahan terhadap serangan patogen untuk semua ras, hal ini juga ditunjukkan oleh varietas IRBB52 yang mengandung gen Xa4 dan Xa21, IRBB53 yang mengandung gen Xa5 dan Xa13, IRBB54 yang mengandung gen Xa5 dan Xa21, IRBB56 yang mengandung gen Xa4, Xa5 dan Xa13, IRBB57 yang mengandung gen Xa4, Xa5 dan Xa21, IRBB58 yang mengandung gen Xa4, Xa13 dan Xa21, IRBB64 yang mengandung gen Xa4, Xa5, Xa7 dan Xa21, dan IRBB66 yang mengandung gen Xa4, Xa5, Xa7, Xa13 dan Xa21. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gene pyramiding mampu membentuk varietas yang memiliki sifat ketahanan yang lebih luas (Huang et al. 1997) dan menjadi cara yang paling efektif untuk menanggulangi patogen yang kemungkinan berubah sifat patogenitasnya dari waktu ke waktu (Jeung et al. 2006).
Varietas differensial yang memiliki gen digenik tetapi respon ketahanan terhadap patogen ras tertentu menunjukkan hasil yang sama dengan varietas diferensial yang monogenik ditunjukkan oleh varietas IRBB51 yang mengandung gen Xa4 dan Xa13, dimana kedua gen tersebut secara bersama-sama menunjukkan respon ketahanan yang sama dengan monogenik Xa4 dan Xa13 terhadap patogen ras IV dan ras VIII. Varietas IRBB4 yang mengandung gen Xa4 dan IRBB13 yang mengandung gen Xa13 memiliki respon tahan terhadap ras III, tetapi peka terhadap ras IV dan ras VIII. Ketika kedua gen Xa4 dan Xa13 terdapat dalam satu varietas yaitu IRBB 51, ternyata respon yang dihasilkan tetap sama seperti ketika 14
gen-gen tersebut belum digabungkan, yaitu tahan terhadap ras III dan peka terhadap ras IV dan ras VIII. Dalam hal ini respon menunjukkan bahwa kedua gen ketahanan tersebut hanya mampu mengenali gen virulen dari ras III. Hasil yang berbeda ditunjukkan pada respon tanaman IRBB53 yang mengandung gen ketahanan Xa5 dan Xa13, Xa5 memberikan efek positif (bersifat dominan) sehingga ketika digabungkan dengan gen Xa13 maka akan tetap memberikan respon yang tahan terhadap semua ras yang diujikan.
Gambar 5 Ketahanan padi varietas diferensial terhadap ras III, ras IV, dan ras VIII Semua varietas diferensial yang digunakan pada penelitian ini menghasilkan respon tahan terhadap patogen ras III, 10 varietas diantaranya juga tahan terhadap patogen ras IV atau ras VIII (Gambar 5). Varietas yang tahan terhadap ras IV adalah IRBB5, IRBB7, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56, IRBB58, IRBB64, dan IRBB66, sedangkan yang tahan terhadap Ras VIII adalah IRBB7, IRBB21, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56, IRBB58, IRBB64, dan IRBB66. Di antara 22 varietas differensial yang digunakan, terdapat 9 varietas yang tahan terhadap ras III, ras IV dan ras VIII. Varietas yang tahan terhadap ketiga ras patogen adalah IRBB7, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56, IRBB58, IRBB64, dan IRBB66 (Tabel 6).
b. Respon ketahanan pada galur-galur uji
Penelitian ini menggunakan galur-galur uji sebanyak 37 galur, 1 tanaman kontrol tahan (IRBB7) dan 1 tanaman kontrol peka (TN1). Pemilihan tanaman kontrol tahan didasarkan pada hasil uji lapang pada penelitian Utami et al. (2007) bahwa padi IRBB7 mampu bertahan dari serangan penyakit HDB ras III, IV dan VIII.
Galur uji yang digunakan dalam penelitian ini memberikan respon ketahanan yang bervariasi terhadap setiap ras patogen yang diinokulasikan. Sebagian besar tahan atau agak tahan terhadap 2 ras. Hanya 4 galur yang tahan terhadap ketiga ras patogen, yaitu IR 3822-512-3-2-2, IR 82571-581-1-2-3, IR 82571-602-3-2-2, dan Beras Merah D1 (Tabel 7).
Pada Gambar 6 dapat diketahui bahwa pada ras III, terdapat 7 galur uji yang tahan, 16 galur uji bersifat agak tahan dan 14 galur uji bersifat peka. Respon ketahanan terhadap ras IV menunjukkan 13 galur bersifat tahan, 13 galur uji bersifat agak tahan dan 11 galur uji bersifat peka. Sedangkan respon ketahanan terhadap ras VIII menunjukkan 5 galur uji bersifat tahan, 10 galur uji bersifat agak tahan dan 22 galur uji bersifat peka.
Respon ketahanan terhadap ras III dan ras VIII lebih banyak yang bersifat peka, secara berturut-turut hanya 7 dan 5 galur uji yang bersifat tahan terhadap ras III dan ras VIII. Dengan demikian, ras III dan ras VIII dapat memberikan efek seleksi yang lebih besar dibandingkan dengan ras IV. Berdasarkan virulensi patogenesis (Utami et al. 2011) diketahui bahwa ras IV dan ras VIII adalah ras yang virulen aktif membentuk protein virulence effector (PVE) dan bersifat intraseluler dengan tipe signal yang berturut-turut bertipe Leucine-Rich Repeat (LRR) dan Leucine-Rich Repeat Proteins (LRRP) pada bagian Nuclear Localization Signal (NLS). Oleh karena itu, pada ras VIII memperlihatkan hasil seleksi yang tinggi sehingga hanya 5 galur uji yang bersifat tahan. Uji ketahanan terhadap ras IV menunjukkan hasil yang berbeda, dimana galur uji banyak yang bersifat tahan dibanding dengan galur yang bersifat peka. Hal ini diduga karena galur uji memiliki gen resistensi (R) yang kompatibel terhadap ras IV sehingga gen virulensi (Avr) yang dari bakteri mampu diblok oleh gen resistensi yang dimiliki oleh tanaman. Oleh karena itu sifat virulensi aktif yang dimiliki oleh ras IV tidak mampu mematahkan sifat ketahanan pada galur uji. Ras III bersifat dependent elicitor dan intraseluler sehingga berpotensi terinduksi oleh PVE ras HDB yang lain untuk membentuk ras yang lebih virulen (Utami et al. 2011). Pada penelitian ini menunjukkan bahwa ras III mampu bersifat lebih virulen dibandingkan dengan ras IV, dimana hasil inokulasi menggunakan ras III hanya terdapat 7 galur uji yang bersifat tahan. Hal ini diduga karena ras III terinduksi oleh PVE dari ras lain sehingga menghasilkan ras III yang lebih virulen.
Gambar 6 Ketahanan padi galur uji terhadap ras III, ras IV,dan ras VIII 16
Tabel 7 Respon ketahanan padi galur uji terhadap HDB
No Galur/Varietas
Respon ketahanan terhadap HDB
Ras III Ras IV Ras VIII
IS (%) Respon IS (%) Respon IS (%) Respon
1 IR 83821-95-3-2-3 50.26 P 61.32 P 65.52 P 2 IR 83860-503-1-1-2 37.88 AT 58.96 P 66.60 P 3 IR 83860-513-3-3-2 73.69 P 43.36 P 58.33 P 4 IR 84047-24-3-3-3 11.09 T 20.68 AT 16.71 T 5 IR84941-12-1-2 39.79 AT 59.41 P 52.82 P 6 IR83650-59-2-5-2-2 8.47 T 3.21 T 20.21 AT 7 IR 3822-512-3-2-2 8.47 T 2.95 T 15.08 T 8 IR83689 -14-1-2-1-3 25.97 AT 17.93 T 42.49 P 9 IR 84744-94-3-3-2 83.71 P 22.80 AT 58.75 P 10 IR 84790-73-2-2-2 41.84 P 20.67 AT 62.39 P 11 IR85627-46-1-2-3 45.77 P 23.20 AT 52.06 P 12 IR 82571-581-1-2-3 8.70 T 10.04 T 11.80 T 13 IR 82571-602-3-2-2 8.89 T 7.20 T 13.94 T 14 IR 82480-104-2-2-3-2 66.13 P 44.33 P 50.43 P 15 IR 10L 369 40.54 P 21.08 AT 52.45 P 16 IR 10L 440 54.38 P 71.87 P 64.49 P 17 IR74371-70-1-1 51.15 P 64.32 P 71.09 P 18 IR74371-54-1-1 52.98 P 73.25 P 75.99 P 19 IR 80311-10-B-B-2-B 79.36 P 65.21 P 53.92 P 20 IR 77408-40-3-2-1-B 49.88 P 36.00 AT 59.77 P 21 IR54741-1-244-15-2-3-B 31.13 AT 7.60 T 51.05 P 22 Beras Merah D1 5.56 T 6.04 T 12.26 T 23 BM1P-46-4-1 23.50 AT 7.65 T 29.92 AT 24 IPBM-32-1-3-3 27.31 AT 7.37 T 32.11 AT 25 BMIP-18-4-4-1 30.58 AT 7.74 T 37.39 AT 26 BMIP-18-4-4-2 40.00 AT 38.90 AT 45.90 P 27 BMIP-24-4-3-1 33.96 AT 38.34 AT 45.22 P 28 BMIP-204-3-2 30.79 AT 30.82 AT 43.18 P 29 BMIP-24-1-2-1 30.20 AT 31.21 AT 35.67 AT 30 BMIP-44-4-3-1 25.65 AT 22.87 AT 28.68 AT 31 BMIP-44-4-3-2 24.02 AT 21.63 AT 32.05 AT 32 BMIP-20-2-1-1 26.99 AT 27.96 AT 37.36 AT 33 IRHS-12-4-1 47.38 P 56.86 P 67.79 P 34 Ciherang 25.71 AT 13.78 T 54.00 P 35 Inpari 13 21.53 AT 6.03 T 36.61 AT 36 Code 15.89 T 1.71 T 28.53 AT 37 IR64 63.79 P 64.92 P 54.10 P 38 IRBB7 14.46 T 1.57 T 11.48 T 39 TN1 55.33 P 73.04 P 75.07 P
Keterangan: T: Tahan, AT: Agak Tahan, P: Peka.
Penamaan pada galur introduksi memiliki makna sebagai berikut. Padi berkode IR menunjukkan padi introduksi, 5 angka setelahnya merupakan kode benih hasil penyerbukan sendiri, tanda hubung menunjukkan tingkat generasi F dan seterusnya hingga angka terakhir merupakan tingkat generasi F dari haril penyerbukan sendiri. Penamaan pada galur haploid ganda memiliki makna sebagai berikut. Empat huruf pada bagian pertama menunjukkan simbol varietas yang digunakan sebagai tetua betina dan tetua jantan. BMIP memiliki arti F1 dari persilangan Bio110/Markuti merupakan tetua betina, sedangkan F1 dari persilangan IR54/Parekaligolara merupakan tetua jantan. Sebaliknya, IPBM memiliki arti F1 dari persilangan IR54/Parekaligolara merupakan tetua betina, 17
sedangkan F1 dari persilangan Bio110/Markuti merupakan tetua jantan. Tanda hubung menunjukkan tingkat generasi F dari hasil penyerbukan sendiri (selfing). Nomor kode setelah tanda hubung pertama menunjukkan nomor kalus, nomor kode setelah tanda hubung kedua menunjukkan nomor seleksi pada tanaman hijau, dan nomor kode setelah tanda hubung ketiga dan seterusnya merupakan tahap seleksi tanaman yang sudah dilakukan berdasarkan penampilan agronomi.
c. Pendugaan gen ketahanan pada galur-galur uji
Dari 37 galur uji diperoleh 10 galur yang bersifat agak tahan dan tahan terhadap ras uji. Galur uji yang bersifat tahan tersebut terdiri atas 5 galur hasil introduksi IRRI dan 5 galur hasil persilangan. Pendugaan gen ketahanan galur uji tersebut berdasarkan pada respon ketahanan yang sama dengan varietas diferensial. Pada penelitian ini, galur uji IR84047-24-3-3-3 memiliki respon ketahanan terhadap patogen ras III dan ras VIII, tetapi memiliki respon agak tahan terhadap patogen ras IV. Dengan demikian, secara fenotipe padi tersebut memiliki kasamaan dengan padi varietas diferensial, sehingga diduga padi galur uji tersebut membawa gen Xa21 sebagai gen ketahanan. Respon yang lain juga terjadi pada galur uji IR8365059-2-5-2-2 dan Code, dimana respon ketahanan menunjukkan hal yang sama dengan varietas diferensial IRBB5 yang memiliki gen Xa5, sehingga diduga galur uji tersebut juga membawa gen Xa5. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Triny et al. 2009 yang menunjukkan bahwa varietas Code memiliki gen ketahanan Xa5. Sedangkan pada galur uji IR3822-512-3-2-2, IR82571-851-1-2-3, IR82571-602-3-2-2, Beras Merah D1, memiliki respon tahan terhadap semua ras, dimana respon tersebut sama dengan varietas diferensial IRBB7 yang membawa gen Xa7, sehingga diduga galur uji tersebut membawa gen ketahanan Xa7. Selain itu, pada galur uji BMIP-46-4-1 memiliki respon ketahanan terhadap ras III, dan agak tahan terhadap ras IV dan ras VIII. Respon tersebut sama dengan respon pada varietas diferensial IRBB57 yang mengandung gen ketahanan Xa4, Xa5 dan Xa21, sehingga diduga galur uji BMIP-46-4-1 juga memiliki gen Xa4, Xa5 dan Xa21. Pada galur uji IPBM-32-1-3-3 dan BMIP-18-4-4-1 memiliki respon ketahanan yang berbeda dari galur varietas diferensial, pada kedua galur uji tersebut menunjukkan sifat tahan terhadap ras IV dan respon agak tahan terhadap ras III dan ras VIII. Pendugaan gen galur uji berdasarkan respon ketahanan penyakit HDB secara fenotipe varietas differensial monogenik tersebut ditunjukkan pada Tabel 8.
Tabel 8 Pendugaan gen galur uji
No Varietas diferensial Ras III Ras IV Ras VIII Galur Uji 1 IRBB7 (Xa7) T T T IR 3822-512-3-2-2
IR 82571-581-1-2-3 IR 82571-602-3-2-2 Beras Merah D1 2 IRBB5 (Xa5) T T AT IR83650-59-2-5-2-2 3 IRBB21 (Xa21) T AT T IR 84047-24-3-3-3 18
Uji Genotipe a. Survei polimorfisme
Uji genotipe pada penelitian ini diawali dengan survei polimorfisme menggunakan 208 primer. Tujuan dari analisis ini adalah menyeleksi 208 primer untuk mendapatkan marka terkait gen ketahanan HDB (Xa) tertentu yang bersifat polimorfis pada tanaman kontrol peka TN1 dan tanaman kontrol tahan IRBB7. Varietas diferensial IRBB7 dipakai sebagai tanaman kontrol tahan karena berdasarkan hasil monitoring di lapangan, IRBB yang mengandung gen Xa7 masih mampu bertahan di daerah-daerah endemis HDB di Indonesia (Triny et al. 2009). Jika pada survei polimorfisme ini dihasilkan pita DNA yang berbeda ukuran (polimorfis) antara padi kontrol peka dan padi kontrol tahan, maka primer yang menghasilkan marka polimorfis tersebut dapat digunakan dalam seleksi populasi tanaman padi yang diuji dalam penelitian ini. Di antara hasil survei polimorfisme tersebut (Gambar 7) memperlihatkan bahwa primer Xa1-OP5 menghasilkan pita yang polimorfis. Sedangkan hasil PCR menggunakan primer Xa1-OP6 menunjukkan pita yang monomorfis.
.
Gambar 7 Hasil amplifikasi DNA tanaman kontrol peka TN1 dan kontrol tahan IRBB7 menggunakan primer Xa1-OP5 dan Xa1-OP6. M: DNA Ladder 100 bp, 1: kontrol peka dengan primer Xa1-OP5, 2: kontrol tahan dengan primer OP5, 3: kontrol peka dengan primer Xa1-OP6, 4: kontrol tahan dengan primer Xa1-OP6
Populasi padi yang dianalisis dikelompokkan ke dalam dua set percobaan. Set pertama meliputi varietas diferensial yaitu varietas-varietas yang memiliki gen ketahanan HDB (gen Xa) tertentu dan merupakan varietas yang digunakan sebagai genotipe pembanding populasi uji. Set kedua melibatkan populasi uji yang terdiri atas galur-galur introduksi dan galur haploid ganda.
b. Uji genotipe pada varietas diferensial (IRBB)
Berdasarkan hasil uji polimorfisme, diperoleh 19 primer yang menghasilkan pita polimorfis dan primer ini selanjunya digunakan untuk analisis genotipe populasi uji terkait dengan sifat ketahanan penyakit HDB. Salah satu hasil uji genotipe untuk padi varietas diferensial, ditunjukkan pada Gambar 8 .
19
M 1 2 3 4
1000bp
Gambar 8 Hasil PCR menggunakan primer Xa1-OP5 pada varietas diferensial.
M: DNA Ladder 100 bp; 1:IRBB1; 2:IRBB2; 3:IRBB3; 4:IRBB4; 5:IRBB5; 6:IRBB7; 7:IRBB8; 8:IRBB10; 9:IRBB11; 10:IRBB13; 11:IRBB14; 12:IRBB21; 13:IRBB50; 14:IRBB51; 15:IRBB52; 16:IRBB53; 17:IRBB54; 18:IRBB56; 19:IRBB57; 20:IRBB58; 21:IRBB64; 22:IRBB66 dan 23:TN1
Gambar 8 menunjukkan bahwa hasil amplifikasi DNA menggunakan primer Xa1-OP5 menghasilkan pita DNA yang dapat membedakan antara varietas tahan dan varietas peka terhadap ras HDB. Pita hasil amplifikasi tersebut kurang diskriminan untuk populasi varietas diferensial. Dalam hal ini, pita DNA yang berukuran sama terdapat pada beberapa varietas diferensial yang memiliki gen Xa yang berbeda.
c. Uji genotipe pada galur-galur uji
Pada Gambar 8 terlihat bahwa keberadaan gen Xa1 pada IRBB1 ditunjukkan oleh adanya pita marka berukuran 700 bp, karena amplifikasi menggunakan primer Xa1-OP5 hanya menghasilkan sebagian kecil dari gen Xa1 secara keseluruhan. Ukuran marka Xa1-OP yang merupakan marka penentu gen Xa1 terletak pada kromosom nomor 1 dan memiliki ukuran gen 6.696 bp. Ukuran pita hasil amplifikasi DNA IRBB1 pada uji genotipe varietas diferensial merupakan pembanding ada atau tidaknya gen Xa1 pada galur uji, serta pembanding untuk menentukan ukuran DNA yang teramplifikasi mengandung Xa1. Amplifikasi DNA galur uji menggunakan primer Xa1-OP5 menghasilkan pita berukuran 700 bp dan 1000 bp (Gambar 9). Pita 700 bp merupakan bagian gen Xa1, sedangkan pita 1000 bp bukan bagian dari gen Xa1 tapi memiliki kemiripan sequence dengan bagian dari gen Xa1.
Sedangkan hasil uji genotipe untuk padi galur uji, salah satunya dapat ditunjukkan pada Gambar 9. Hasil PCR menunjukkan bahwa pada galur uji yang tidak menghasilkan pita (misalnya IR83821-95-3-2-3) merupakan tanaman padi yang peka terhadap ras III, ras IV dan ras VIII, hal ini diduga tidak ada sequence ketahanan yang dimiliki oleh galur tersebut sehingga tidak teramplifikasi pada proses PCR. Hasil PCR yang menghasilkan pita menunjukkan bahwa galur tersebut tahan terhadap semua ras yang diujikan atau tahan terhadap satu ras yang diujikan (misalnya Beras Merah D1 dan IR83860-503-1-1-2). Namun marka ini belum dapat digunakan sebagai marka yang spesifik menyeleksi galur uji karena masih ada pita yang muncul pada galur uji yang menunjukkan respon peka pada uji fenotipe dengan ukuran yang sama dengan galur uji yang tahan. Hal ini diduga primer Xa1-OP5 mengamplifikasi sequence yang sama tetapi bukan merupakan 20
1000bp 500bp
bagian yang secara fungsional aktif menghasilkan produk protein ketahanan terhadap ras III, ras IV dan ras VIII.
Gambar 9 Salah satu hasil PCR DNA galur uji menggunakan primer Xa1-OP5.
M: DNA Ladder 100 bp; 1: IR 83821-95-3-2-3; 2: IR 83860-503-1-1-2; 3: IR 83860-513-3-3-83860-503-1-1-2; 4: IR 84047-24-3-3-3; 5: IR84941-12-1-83860-503-1-1-2; 6: IR83650-59-2-5-2-2; 7: IR 3822-512-3-2-2; 8: IR83689 -14-1-2-1-3; 9: IR 84744-94-3-3-2; 10: IR 84790-73-2-2-2; 11: IR85627-46-1-2-3; 12: IR 82571-581-1-2-IR85627-46-1-2-3; 13: IR 82571-602-3-2-2; 14: IR 82480-104-2-2-3-2; 15: IR 10L 369; 16: IR440; 17: IR74371-70-1-1; 18: IR74371-54-1-1; 19: IR 80311-10-B-B-2-B; 20: IR 77408-40-3-2-1-B; 21: IR54741-1-244-15-2-3-77408-40-3-2-1-B; 22: Beras Merah D1; 23: BM1P-46-4-1; 24: IPBM-32-1-3-3; 25: BMIP-18-4-BM1P-46-4-1; 26: BMIP-18-4-4-2;
27:BMIP-24-4-3-1; 28: BMIP-204-3-2; 29: BMIP-24-1-2-1; 30:
BMIP-44-4-3-1; 31: BMIP-44-4-3-2; 32: BMIP-20-2-1-1; 33: IRHS-12-4-1; 34: Ciherang; 35: Inpari 1; 36: Code; 37:IRBB7; 38:TN1;dan
39:IR64.
d. Hasil analisis asosiasi fenotipe dan genotipe pada galur uji
Hasil uji genotipe menunjukkan adanya variasi ukuran pita (Lampiran 1) sehingga dilakukan skoring berdasarkan ukuran pita yang dihasilkan. Hasil skoring ukuran pita DNA kemudian digunakan untuk analisis UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) menggunakan program Tassel 3.0. Hasil analisis yang diperoleh sebagai berikut:
21 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16
M 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 M 33 34 35 36 37 38 39 1000b p 1000b p 1000b p 500b p 500b p 500b pGambar 10 Hasil analisis UPGMA menggunakan Tassel 3.0
Diagram hasil analisis UPGMA (Gambar 10) menunjukkan bahwa varietas diferensial dan galur-galur uji cenderung mengelompok dengan varietas maupun galur yang memiliki kesamaan background tetua. Pengelompokan pada simililarity level 0,8 atau level kemiripan pada 80%. Pada kelompok pertama hanya terdapat galur TN1 yang merupakan tanaman kontrol peka terhadap penyakit HDB. Kelompok kedua merupakan kelompok yang didominasi oleh varietas differensial. Varietas differensial merupakan varietas pembanding yang telah diketahui memiliki gen ketahanan (gen Xa). Kelompok ketiga merupakan kelompok padi galur uji hasil persilangan dari IRRI (padi introduksi) dan padi galur uji hasil persilangan antara IR54/parekaligolara//Bio110/markuti.
22 I II III TN1 IR85627-46-1-2-3 IR82480-104-2-2-3-2 IR64 IR83821-95-3-2-3 IR54751-1-2-44-15-2-3-B IRBB8 IRBB66 IRBB5 IRBB57 IRBB14 IRBB2 IRBB7 IRBB13 IRBB53 IRBB3 IRBB4 IRBB10 IRBB11 IRBB58 IRBB21 IRBB54 IRBB64 IRBB1 IRBB51 IRBB56 IRBB50 IRBB52 IR83650-59-2-5-2-2 IR83860-503-1-1-2 IR84941-12-1-2 IR84047-24-3-3-3 IR83860-513-3-3-2 IR74371-70-1-1 IR74371-54-1-1 IR10L440 IR77408-40-3-2-1-B Beras Merah D1 IR80311-10-B-B-2-B BMIP-46-4-1 IR82571-602-3-2-2 IR83689-14-1-2-1-3 IR84744-94-3-3-2 IR84790-73-2-2-2 IR10L369 BMIP-20-2-1-1-1 IRHS-12-14-1 Ciherang Inpari 13 Code IPBM-32-1-3-3 BMIP-18-4-4-1 BMIP-18-4-4-2 BMIP-24-4-3-1 BMIP-44-4-3-1 BMIP-20-4-3-2 BMIP-44-4-3-2 BMIP-24-1-2-1 IR82571-581-1-2-3 IR83822-512-3-2-2 1 0,75 0,50 0,25 0 Similarity level
Semua varietas diferensial menunjukkan respon tahan terhadap ras III. Hanya 2 di antara varietas diferensial yaitu IRBB5 (pembawa gen Xa5) dan IRBB7 (pembawa gen Xa7) yang menunjukkan respon tahan terhadap ras IV.