Penelitian ini dilakukan Laboratorium Hewan Coba UNS, Surakarta, selama periode bulan Januari 2015 – Maret 2015. Sejumlah 27 ekor tikus wistar di adaptasi selama 7 hari sebelum dibagi dalam tiga kelompok yang masing-masing terdiri dari 9 ekor tikus yang ditentukan secara acak. Untuk kelompok satu (K1) yang merupakan kelompok kontrol, tidak dilakukan induksi cecal inoculum maupun pemberian Vitamin C. Untuk kelompok dua (K2) diberikan injeksi cecal inoculum40mg/kali/hari selama 3 hari berturut turut. Untuk kelompok perlakukan tiga (K3) perlakuan sama dengan kelompok dua ditambah dengan Vitamin C 5,1 mg/kg/kali/hari secara intravena selama 3 hari berturut-turut. Observasi dilakukan setelah 72 jam perlakuan. Setelah 72 jam perlakuan maka dilakukan pengambilan sampel darah intravena sebanyak 0,5 ml menggunakan spuit 1 ml yang akan ditampung di tabung khusus untuk pemeriksaan neutrophil. Setelah itu tikus wistar akan di euthanasia dengan cara dekapitasi. Duodenum tikus kemudian diambil untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi.
1. Hasil Pemeriksaan Neutrophil
a. Gambaran Hasil Pemeriksaan Neutrophil
Hasil pemeriksaan neutrophil pada ke tiga kelompok perlakuan sebagai berikut :
Tabel 2.
Deskripsi Hasil Pemeriksaan Neutrophil
No K1 K2 K3 1 43.5 56.5 80.2 2 35.7 82.0 83.2 3 35.9 48.8 70.5 4 15.6 54.7 78.1 5 16.0 42.0 43.2 6 23.2 59.7 79.4 7 23.3 39.5 75.8 8 35.4 88.7 79.6 9 43.7 54.4 57.6 Rata -Rata 30.3 58.5 72.0 SD 10,96 16,69 13,21 45 commit to user
59
Berdasarkan hasil pemeriksaan neutrophil diketahui bahwa rata-rata kadar neutrophil pada kelompok 1 yang tidak diberi cecal inoculum40mg adalah 30,3 + 10,96 mg/dl, sedangkan pada kelompok 2 yang diberikan cecal inoculum40mg/kali/hari adalah 58,5 + 16,69 mg/dl dan juga kelompok 3 yang diberi cecal inoculum40mg/kali/hari didapatkan nilai rata-rata neutrophil sebesar 72,0 + 13,21 mg/dl.
Gambar 9.
Diagram Batang Rerata Kadar Neutrophil
Berdasarkan gambar 4.1 diatas diketahui bahwa kelompok 1 yang tidak diberikan cecal inoculum40mg/kali/hari rata-rata neutrophil lebih rendah dibandingkan dengan kelompok 2 dan kelompok 3 yang diberikan cecal inoculum40mg/kali/hari. Untuk mengetahui tingkat perbedaan dari ketiga kelompok perlakuan tersebut maka dilakukan uji lanjut.
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 K1 K2 K3 30.3 58.5 72.0 K1 K2 K3 commit to user
60 b. Uji Normalitas Neutrophil
Tabel 3.
Uji Normalitas Data Neutrophil
Neutrophil N P Keterangan Kelompok 1 9 0,178 Normal Kelompok 2 9 0,159 Normal Kelompok 3 9 0,012 Tidak Normal
Berdasarkan tabel 4.2 diketahui bahwa kelompok 1 varian data berdistribusi normal (p= 0,178 ; p >0,05), Untuk kelompok 2 data juga berdistribusi normal (p=0,159; p >0,05), dan kelompok 3 varian data berdistribusi tidak normal (p=0,012; p>0,05). Dikarenakan ada salah satu kelompok tidak lulus uji normalitas maka pengujian statistik di uji alternative dengan Kruskal-Wallis test dan dilanjutkan dengan Mann Whitney Test
c. Uji Beda Rata-Rata Kadar Neutrophil
Uji beda kadar neutrophil dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan bermakna antara kadar neutrophil pada ketiga kelompok penelitian. Uji beda ini dilakukan dengan menggunakan uji statistik Kruskal-Wallis.
Tabel 4.
Uji Beda Rata-Rata Kadar Neutrophil
Neutrophil N Rata-rata Kruskal-Wallis p Kelompok 1 9 30,3 16,008 <0.01 Kelompok 2 9 58,5
Kelompok 3 9 72,0
Berdasarkan tabel 4.3 diketahui bahwa nilai p < 0.01 (p<0,05), yang artinya bahwa ada perbedaan yang nyata kadar neutrophil antara kelompok 1 (tanpa perlakuan), kelompok 2 dan kelompok 3 (diberi cecal inoculum). Untuk mengetahui adanya perbedaan kadar neutrophil antar masing-masing kelompok perlakuan maka dilakukan uji lanjut (Mann Whitney).
61 Tabel 5.
Perbedaan Kadar Neutrophil Antara Masing –Masing Kelompok Perlakuan Neutrophil N Rata-rata Z- Score p
Kelompok 1 9 30,3 -3.223 0,001 Kelompok 2 9 58,5 Kelompok 1 9 30,3 -3.400 0,001 Kelompok 3 9 72,0 Kelompok 2 9 58,5 -1,545 0,122 Kelompok 3 9 72,0
Berdasarkan tabel 4.4 diketahui bahwa nilai uji beda antara kelompok 1 dan kelompok 2 mendapatkan nilai p=0,001 p<0,05, jadi ada perbedaan yang signifikan antara kelompok 1 dengan dengan kelompok 2. Demikian juga antara kelompok 1 dan kelompok 3.berdasarkan hasil uji tersebut dapat diketahui bahwa ada berbedaan kadar neutrophil pada tikus yang diberikan cecal inoculum40mg/kali/hari dan yang tidak diberikan cecal inoculum40mg.
Sedangkan uji beda antara kelompok 2 dan kelompok 3 mendapatkan nilai p=0,122 p>0,05, jadi tidak anda perbedaan kadar neutrophil antara kelompok 2 dan kelompok 3. Hal ini berarti pemberian cecal inoculum40mg/kali/hari pada kedua kelompok tersebut telah berhasil dan memiliki kadar neutrophil yang sama (tikus dalam keadaan sepsis)
Berdasarkan hasil uji beda kadar neutrophil yang telah dilakukan maka dapat diketahui bahwa perlakuan dengan pemberian cecal inoculum40mg/kali/hari telah berhasil dimana tikus wistar pada kelompok 1 dalam keadaan sehat dan tikus wistar pada kelompok 2 dan kelompok 3 dalam keadaan sepsis.
2. Hasil Pengukuran Diameter Arteriol Dari Organ Usus Halus a. Gambaran Hasil Pengukuran Diameter Arteriol
Diameter diukur dengan mikrooskop cahaya dengan pembesaran 400 kali. Diameter dihitung dengan satuan micrometer ( . Dari tiap sampel (preparat) dipilih 5 arteriol secara acak per lapang pandang dan dihitung nilai rata-rata diameternya
62 Tabel 6.
Deskripsi Hasil Pengukuran Diameter Arteriol
No Tikus K1 ( ( K2 ( K3 1 A1 329.1 195.1 561.6 2 A2 216.6 135.2 311.0 3 A3 367.9 168.5 334.1 4 A4 208.9 133.5 570.0 5 A5 255.6 170.5 684.9 6 B1 208.5 137.4 585.8 7 B2 229.7 107.4 510.4 8 B3 184.6 136.7 459.0 9 B4 189.9 122.6 525.9 10 B5 247.5 139.6 402.6 11 C1 267.6 102.4 406.2 12 C2 232.2 107.9 424.8 13 C3 179.1 134.4 516.5 14 C4 150.4 129.5 411.3 15 C5 165.8 125.5 495.8 16 D1 330.3 136.1 400.7 17 D2 374.8 151.3 394.7 18 D3 231.8 166.6 394.9 19 D4 274.5 155 469.6 20 D5 170.3 137.3 445.6 21 E1 129.3 137.3 423.8 22 E2 165.6 108.2 550.0 23 E3 147.8 124.1 517.2 24 E4 134.1 124.1 695.9 25 E5 167.3 121.3 616.1 26 F1 173.1 134.9 455.9 27 F2 165.6 140.3 484.3 28 F3 173.8 120.1 433.5 29 F4 144.8 123.1 538.8 30 F5 177 146.1 511.3 31 G1 141.6 160.7 209.4 32 G2 89.2 151.9 309.1 33 G3 139.1 136.2 240.6 34 G4 142.2 144.9 205.7 35 G5 78.1 165.6 391.0 36 H1 97.7 151.8 192.4 37 H2 145.5 156.8 235.6 38 H3 127.8 157.2 255.2 39 H4 116.2 131.5 182.9 40 H5 91.4 154.5 227.7 41 I1 118.5 167.6 180.6 commit to user
63 No Tikus K1 ( ( K2 ( K3 42 I2 133.3 144.2 178.0 43 I3 130.4 128.3 180.6 44 I4 144.9 135.8 182.3 45 I5 110.5 111.4 188.7 Rata-rata 182.2 139.3 397.6 SD 71.48 19.49 148.64
Berdasarkan hasil pengukuran diameter arteriol diketahui bahwa setelah 72 jam rata-rata diameter arteriol pada kelompok 1 yang tidak diberi perlakuan apapun adalah 182,2 + 71,48 , sedangkan rata-rata diameter arteriol pada kelompok 2 (diberi cecal inoculum40mg/kali/hari) adalah 139,3 + 19,49 dan kelompok 3 (Diberi cecal inoculum40mg/kali/hari dan Vitamin C 5,1 mg/kg/kali/hari) didapatkan nilai rata-rata diameter arteriol sebesar 397 + 149,64 .
Gambar 10.
Diagram Batang Rerata Diameter Arteriol
Berdasarkan gambar 4.2 diatas diketahui bahwa kelompok 1 (tanpa perlakuan)rata-rata diameter arteriol lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok 2 (Diberi cecal inoculum). Sedangkan kelompok 3 (Diberi cecal inoculum dan Vitamin C) nilainya lebih tinggi dari pada kelompok 1 dan kelompok 2. Untuk mengetahui tingkat perbedaan dari ketiga kelompok perlakuan tersebut maka dilakukan uji lanjut.
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 K1 K2 K3 182.2 139.3 397.6 K1 K2 K3 commit to user
64 b. Uji Normalitas Data Diameter Arteriol
Tabel 7.
Uji Normalitas Data Diameter Arteriol Diameter
Arteriol N P Keterangan Kelompok 1 45 0,001 Tidak Normal Kelompok 2 45 0,447 Normal Kelompok 3 45 0,020 Tidak Normal
Berdasarkan tabel 4.6 diketahui bahwa kelompok 1 varian data berdistribusi tidak normal (p= 0,001 ; p <0,05), Untuk kelompok 2 data juga berdistribusi normal (p=0,159; p >0,05), dan kelompok 3 varian data berdistribusi tidak normal (p=0,020; p>0,05). Dikarenakan ada kelompok tidak lulus uji normalitas maka pengujian statistik di uji alternatif dengan Kruskal-Wallis test dan dilanjutkan dengan Mann Whitney Test.
c. Uji Beda Rata-rata Diameter Arteriol
Uji beda rata-rata diameter arteriol dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan bermakna antara diameter arteriol pada ketiga kelompok penelitian. Uji beda ini dilakukan dengan menggunakan uji statistik Kruskal-Wallis.
Tabel 8.
Uji Beda Rata-Rata Diameter Arteriol Diameter Arteriol N Rata-rata ( Kruskal-Wallis p Kelompok 1 45 182,2 80,505 <0.01 Kelompok 2 45 139,3 Kelompok 3 45 397,6
Berdasarkan tabel 8. diketahui bahwa nilai p<0.01(p<0,05), yang artinya bahwa ada perbedaan yang nyata diameter arteriol antara kelompok 1 (tanpa perlakuan), kelompok 2 (diberi cecal inoculum) dan kelompok 3 (diberi cecal inoculum dan Vitamin C). Untuk mengetahui adanya perbedaan diameter arteriol antar masing-masing kelompok perlakuan maka dilakukan uji lanjut (Mann Whitney).
65 Tabel 9.
Perbedaan Diameter Arteriol Antara Masing –Masing Kelompok Perlakuan Diameter Arteriol N Rata-rata ( Z-Score p Kelompok 1 45 182,2 -3.326 0,001 Kelompok 2 45 139,3 Kelompok 1 45 182,2 -6,718 <0.01 Kelompok 3 45 397,6 Kelompok 2 45 139,3 -8,114 <0.01 Kelompok 3 45 397,6
Berdasarkan tabel 9. diketahui bahwa diketahui bahwa nilai uji beda antara kelompok 1 dan kelompok 2 mendapatkan nilai p=0,001 p<0,05, jadi ada perbedaan yang signifikan diameter arteriol antara kelompok 1 (tanpa perlakuan) dengan dengan kelompok 2 (diberi cecal inoculum) dimana rata-rata diameter arteriol tikus kelompok 1 (tanpa perlakuan) 30,8% lebih lebar dibandingkan dengan tikus kelompok 2 (diberi cecal inoculum).
Demikian juga antara kelompok 1 (tanpa perlakuan) dan kelompok 3 (diberi cecal inoculum dan Vitamin C) mendapatkan hasil nilai p=0,001 p<0,05. Jadi ada perbedaan yang signifikan diameter arteriol antara kelompok 1 dan kelompok 3. Dimana kelompok 3 menghasilkan diameter arteriol 118,2% lebih lebar daripada kelompok 1.
Uji beda antara kelompok 2 (diberi cecal inoculum) dan kelompok 3 (diberi cecal inoculum dan Vitamin C) mendapatkan hasil nilai p=0,000 p<0,05. Jadi ada perbedaan yang signifikan diameter arteriol antara kelompok 2 dan kelompok 3. Dimana kelompok 3 menghasilkan diameter arteriol 185,3% lebih lebar daripada kelompok 2.
Berdasarkan hasil uji tersebut dapat diketahui bahwa pemberian Vitamin C pada tikus sepsis mampu meningkatkan diameter arteriol lebih lebar dibandingkan dengan tikus sehat (normal) dan tikus sepsis.
B. Pembahasan
Sepsis dapat mengaktivasi berbagai macam sel seperti makrofag, netrofil, sel endotel maupun epithelial yang akan melepaskan sejumlah mediator, termasuk diantaranya cytokines, chemokines, PAF, interferon- , komplemen prostanoid, leukotriene dan protease. Kejadian ini akan menyebabkan aktivasi dari sel imun yang
66
disertai pelepasan ROS. Mediator inflamasi ini memiliki peran yang penting dalam membunuh organisme patoogen, namun jika respon yang terjadi terlalu eksesif, makan dapat menyebabkan infeksi sistemik pada orgam dibangian distal dan dapat menyebabkan kematian.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa pemberian Vitamin C 5,1 mg/kgBB/hari/i.v pada tikus sepsis mampu meningkatkan diameter arteriol lebih besar dibandingkan dengan tikus sepsis dan tikus yang sehat. Nilai diameter arteriol pada kelompok 1 (tanpa perlakuan) berbeda signifikan dengan kelompok 2 (diberi cecal inoculum) dengan nilai p=0,001 p<0,05, dimana rata-rata diameter arteriol tikus kelompok 1 (tanpa perlakuan) 30,8% lebih lebar dibandingkan dengan tikus kelompok 2 (diberi cecal inoculum). Demikian juga nilai diameter arteriol kelompok 1 (tanpa perlakuan) berbeda signifikan dengan kelompok 3 (diberi cecal inoculum dan Vitamin C) dengan nilai p=0,001 p<0,05. Dimana kelompok 3 menghasilkan diameter arteriol 118,2% lebih lebar dibandingkan dengan kelompok 1. Nilai dimater arteriol kelompok 2 (diberi cecal inoculum) juga berbeda signifikan dengan kelompok 3 (diberi cecal inoculum dan Vitamin C) dengan nilai p=0,000 p<0,05. Dimana kelompok 3 menghasilkan diameter arteriol 185,3% lebih lebar daripada kelompok 2.
Vitamin C merupakan golongan antioksidan larut dalam air yang dapat meredam dampak negatif oksidan, termasuk enzim-enzim dan protein-protein pengikat logam. Fungsi antioksidan adalah mencegah terbentuknya radikal hidroksil, memutus rantai reaksi oksidan, mereduksi oksidan menjadi zat lain yang kurang reaktif misalnya H2O dan O2, menghambat peroksidase lipid dan scavenger langsung dari ROS. Oleh sebab itu pemberian Vitamin C pada tikus wistar mampu meningkatkan nilai diameter arteriol.
Anti oksidan merupakan senyawa-senyawa yang dapat meredam dampak negatif oksidan, termasuk enzim-enzim dan protein-protein pengikat logam. Fungsi antioksidan adalah mencegah terbentuknya radikal hidroksil, memutus rantai reaksi oksidan, mereduksi oksidan menjadi zat lain yang kurang reaktif misalnya H2O dan O2, menghambat peroksidase lipid dan scavenger langsung dari ROS. Pada sepsis terjadi inflamasi, inflamasi ditandai oleh pelepasan sitokin pro inflamasi seperti TNF-, 1L-1 , dan IL-6 dan mediator inflamasi termasuk NO, PGE2, iNOS dan COX.
Asam askorbat adalah reducing agent dan dapat mengurangi dan menetralkan, reaktif oksigen spesies seperti hidrogen peroksida. Oksidan seperti hidroksil radikal mengandung elektron tidak berpasangan dan sangat reaktif dan merusak pada tingkat commit to user
67
molekuler. Hal ini disebabkan oleh interaksi ROS dengan asam nukleat, protein, dan lipid. Reaktif oksigen spesies mengoksidasi askorbat menjadi monodehydroascorbate dan kemudian menjadi dehydroascorbate. Reaktif Oksigen Spesies (ROS) direduksi menjadi air sementara bentuk askorbat teroksidasi relatif stabil, tidak reaktif dan tidak menyebabkan kerusakan sel.
Hasil penelitian ini juga didukung oleh hasil penelitian Victor VM et al, (2000)dimana Vitamin C (Asam Ascorbat/AA) merupakan donor elektron yang kuat, bereaksi baik dengan O2- maupun dengan OH-.AA memainkan peran penting dalam mekanisme pertahanan terhadap kerusakan oksidatif terutama yang disebabkan oleh lekosit.Pengaturan utama dari AA pada organisme berhubungan dengan fungsinya sebagai reduktor, namun AA juga ikut berperan dalam memodulasi jalur kompleks biokimia dimana hal ini merupakan bagian penting dalam metabolisme normal dari sel imun. Antioksidan ini menghambat aktivasi dari faktor transkripsi nuclear NF-κB yang dicetuskan oleh adanya endotoksin, dimana hal ini dapat menurunkan produksi TNFα. Penelitian Ex vivo telah menunjukkan pengaruh pemberian Vitamin C terhadap regulasi aktivitas seluler, seperti peningkatan adhesi dan produksi O2- yang dihasilkan oleh makrofag pada mencit dengan syok endotoksin yang akan berkurang dengan adanya AA. AA juga memperlihatkan kemampuan untuk memodulasi fungsi limfosit pada model yang sama.
Wu et al (2003) memperlihatkan dimana AA dapat menghambat ekspresi iNOS dan menurunkan kadar oksidan pada masa otot selama periode sepsis. Hasil ini menimbulkan dugaan dimana pemberian AA pada early sepsis dapat menjadi terapi tambahan yang berharga.
Dengan demikian pemberian Vitamin C 5,1 mg/kgBB/hari/i.v pada tikus sepsis akan berdampak pada hasil pengukuran diameter arteriol, dimana pada tikus sepsis yang diberi Vitamin C nilai dimater arteriol 118,2% lebih lebar dari tikus normal. Dan nilai dimater arteriol pada pada tikus sepsis yang diberi Vitamin C 185,3% lebih besar dari tikus sepsis tanpa diberi Vitamin C.
68 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN