HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Hasil Pengujian EEABA terhadap Aktivitas Proliferasi Sel 4T1
Uji aktivitas proliferasi dalam penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan EEABA dalam menghambat proliferasi sel kanker 4T1. Metode yang digunakan dalam uji ini adalah metode MTT. Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida] adalah salah satu uji untuk menilai aktivitas sitotoksisitas dan antiproliferasi suatu senyawa uji yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna (Wati, 2015).
Sel hidup dapat diketahui jumlahnya berdasarkan hasil reaksi reduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal formazan berwarna ungu. Intensitas warna ungu dan besarnya absorbansi diukur dengan alat ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Intensitas warna ungu yang terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme atau dengan kata lain sebanding dengan jumlah sel yang hidup. Semakin kuat intensitas warna ungu
yang diperoleh absorbansi akan semakin besar. Hal ini menandakan bahwa banyak sel yang hidup dan bereaksi dengan garam tetrazolium, sehingga formazan yang terbentuk akan semakin banyak, sedangkan sel yang mati tidak dapat mereduksi MTT, karena enzim di dalam sel tidak berfungsi lagi (Dona, dkk., 2016), sehingga sel yang telah mati akan tetap berwarna kuning seperti medium, dan tidak membentuk warna ungu, seperti pada sel hidup.
Pada uji penghambatan proliferasi sel ini, konsentrasi doksorubisin dan EEABA yang digunakan mengacu pada nilai IC50 yang diperoleh dari penelitian sebelumnya (Harahap, dkk., 2017), yaitu EEABA memiliki nilai IC50 sebesar 48,06 µg/mL, dan doksorubisin sebesar 0,8 µg/mL. Nilai lC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel sebesar 50% dari populasi sel hidup. Nilai lC50 dapat menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai sitotoksik (Sitorus, 2013). Ekstrak dinyatakan aktif apabila memberikan nilai IC50
10-100 μg/mL, dan cukup aktif apabila memberikan nilai IC50 100-500 μg/mL (Weerapreeyakul, dkk., 2012). Semakin besar nilai lC50, maka senyawa tersebut semakin tidak toksik (Sitorus, 2013), dan sebaliknya semakin kecil nilai IC50, maka semakin tinggi potensi senyawa uji sebagai agen sitotoksik (Wati, 2015).
Maka, dapat dikatakan bahwa EEABA mempunyai aktivitas sitotoksik yang.poten terhadap sel kanker 4T1. Berdasarkan penelitian tersebut peneliti tertarik untuk melihat aktivitas penghambatan proliferasi sel terhadap EEABA pada sel 4T1, oleh karena itu pemilihan konsentrasi EEABA yang digunakan untuk uji ini, yaitu sebesar 50 µg/mL, dan 10 µg/mL, sedangkan doksorubisin, yaitu sebesar 0,8 µg/mL, dan 0,16 µg/mL. Pemilihan konsentrasi ini dikarenakan agar sel dapat diamati pertumbuhan serta morfologinya, dan pada kadar tersebut diperkirakan sel tidak terlalu banyak yang mati. Apabila digunakan kadar jauh di atas nilai IC50
dikhawatirkan sel terlalu banyak yang mati sebelum 72 jam inkubasi, sehingga pengamatan proliferasi sel tidak dapat dilakukan dan profil pertumbuhannya tidak terlihat (Dona, dkk., 2016).
Hasil uji penghambatan proliferasi dengan metode MTT ini, dilihat berdasarkan % (persentase) kehidupan (viabilitas) sel dan standar error untuk masing-masing seri konsentrasi yang diperoleh dari nilai absorbansi perlakuan pada setiap waktu inkubasi, yang kemudian dibuat ke dalam bentuk grafik.
Adapun hasil uji penghambatan proliferasi sel ini dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil uji pengamatan aktivitas proliferasi sel 4T1 terhadap EEABA dan doksorubisin dengan metode MTT pada persentase jumlah sel yang diperoleh dengan perlakuan senyawa uji, yaitu EEABA dengan konsentrasi 50 µg/mL dan doksorubisin sebagai pembanding kontrol positif dengan konsentrasi 0,16 µg/mL dan 0,8 µg/mL tampak bahwa sampai akhir waktu percobaan tidak terjadi peningkatan pertumbuhan sel. Hal ini kemungkinan disebabkan karena sel mengalami kematian. Kematian ini diperkirakan terjadi melalui mekanisme cell cycle arrest sehingga menyebabkan kemampuan proliferasi sel menurun (Meiyanto, dkk., 2003).
Gambar 4.1 Grafik hubungan antara persen viabilitas sel versus waktu pengamatan pada pemberian EEABA dan doksorubisin terhadap sel 4T1
Pada sel dengan perlakuan EEABA dengan konsentrasi 10 µg/mL terdapat perbedaan grafik batang yang ditunjukkan pada Gambar 4.1 dengan konsentrasi EEABA tersebut dari waktu 24 jam ke waktu 48 jam, terlihat jumlah sel mulai meningkat dan terus bertambah pada jam ke-72, yaitu secara berturut-turut menghasilkan persentase viabilitas sel sebesar 54,076% ± 0,665%; 59,877% ± 0,138%; dan 62,258% ± 0,163%. Hal tersebut menunjukkan bahwa EEABA dengan kadar 10 µg/mL ini siklus sel masih berjalan. Peristiwa ini mungkin terjadi karena pengaruh dari senyawa aktif EEABA yang berkurang. Senyawa aktif di dalam ekstrak tersebut termetabolisme oleh sel, sehingga lama kelamaan konsentrasinya menurun. Efek reversibel ini lebih tepat dikatakan sebagai cell cycle delay (tertundanya penghambatan daur sel), sehingga untuk tetap mempertahankan keadaan arrest penambahan larutan uji perlu dilakukan (dose dependent) (Meiyanto, dkk., 2005). Namun, pada Gambar 4.1 dapat dilihat juga bahwa kecepatan proliferasi sel dapat diperlambat dengan pemberian EEABA.
0
EEABA dengan konsentrasi 50 µg/mL menunjukkan penghambatan terhadap proliferasi sel kanker payudara 4T1 yang lebih besar daripada doksorubisin dengan konsentrasi 0,16 µg/mL pada waktu jam ke 24, 48 dan 72 jam, sehingga dapat dikatakan bahwa EEABA dengan konsentrasi 50 µg/mL dapat menghambat proliferasi sel kanker 4T1.
Kemampuan penghambatan proliferasi sel dapat dikaitkan dengan mekanisme cell cycle arrest, yaitu adanya kerusakan DNA atau RNA yang akan memicu aktivasi gen p53 sehingga siklus sel akan terhenti sementara untuk proses perbaikan DNA atau RNA tersebut. Apabila kerusakannya cukup parah dan tidak bisa diperbaiki, maka sel akan mengalami apoptosis atau mekanisme kematian sel secara alami dan terprogram (Wati, 2015). Terjadinya penghambatan proliferasi sel kanker 4T1 ini diperkirakan karena adanya kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam EEABA, yaitu senyawa flavonoid, tanin, saponin, dan alkaloid yang bersifat sebagai antikanker.
Mekanisme kerja flavonoid, alkaloid dan saponin meningkatkan ekspresi p53 (Nirwana, 2015). Flavonoid sebagai antikanker diduga bekerja dengan cara memodulasi penahanan siklus sel pada fase G1 menuju fase S (Zakaria, dkk., 2011), sehingga pada tahap ini sel tidak dapat melakukan proses sintesis RNA dan protein (Sitorus, 2013; Rabinovitch, 1990). Senyawa alkaloid dapat menyebabkan kerusakan dan pengkerutan pada membran sel, sehingga komponen penyusun membran akan berubah dan proses fisiologi membran akan terganggu (Anggraeni, 2014), dan pada senyawa tanin memiliki aktivitas sebagai antiproliferatif pada sel kanker yang bekerja pada tingkat sel dengan menghambat fase S dari siklus sel (Nirwana, 2015), sehingga sel tidak dapat melakukan sintesis dan replikasi DNA (Rabinovitch, 1990).