HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Hasil Pengujian EEABA terhadap Aktivitas Siklus Sel 4T1
Pengujian siklus sel menggunakan metode flowcytometry dilakukan dengan konsentrasi 10 µg/mL untuk EEABA dan 0,16 µg/mL untuk doksorubisin.
Metode ini bertujuan untuk melihat distribusi sel pada masing-masing fase dalam siklus sel, yaitu pada sub G1, S, G2-M setelah perlakuan, sehingga dapat diperkirakan jalur penghambatan EEABA dan doksorubisin dalam menghambat siklus sel. Pengujian flowcytometry dilakukan pada pancaran cahaya 488 nm dengan kecepatan medium (500 sel/detik).
Akumulasi sel pada siklus sel merupakan salah satu target utama agen antikanker. Fase-fase dalam siklus sel normal memiliki perbedaan pada jumlah set kromosom, yaitu fase G1 jumlah set kromosomnya adalah 2n. Berlanjut pada fase S jumlah set kromosomnya antara 2n dan 4n, karena terjadi proses replikasi. Pada fase G2 dan M, replikasi telah sempurna membentuk set kromosom 4n.
Berdasarkan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA, seperti propidium iodida, maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom, maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Alat yang digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel pada penelitian ini adalah FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) atau flowcytometer (Givan, 2001).
Pengujian siklus sel dilakukan terhadap sel 4T1. Hasil pengujian flowcytometry pada kontrol sel atau tanpa perlakuan ditunjukkan pada Gambar 4.2, EEABA konsentrasi 10 µg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.3, dan doksorubisin konsentrasi 0,16 µg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.4. Profil siklus sel 4T1 setelah perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4.2 dan gambar dibawah ini:
Tabel 4.2 Pengaruh pemberian EEABA dan doksorubisin terhadap siklus sel 4T1 Jenis perlakuan Kadar Fase sel (%)
G0-G1 S G2–M
Kontrol sel - 60,20 21,50 17,70
EEABA 10 µg/mL 36,30 24,90 38,90
Doksorubisin 0,16 µg/mL 2,60 17,10 76,20
Gambar 4.2 Profil siklus sel 4T1 Gambar 4.3 Profil siklus sel 4T1 kelompok kontrol sel EEABA 10 µg/mL
Gambar 4.4 Profil siklus sel 4T1 Doksorubisin 0,16 µg/mL
Berdasarkan hasil data yang diperoleh pada Tabel 4.2 menunjukkan bahwa akumulasi sel terbesar pada perlakuan EEABA terjadi pada fase S, yaitu sebesar 24,90% dan pada fase G2-M sebesar 38,90%. Apabila dibandingkan dengan kontrol sel, akumulasi sel yang diperoleh pada fase S sebesar 21,50% dan pada fase G2-M sebesar 17,10%. Persentase akumulasi sel EEABA yang lebih tinggi dibanding kontrol, menunjukkan bahwa sel mengalami penghambatan pada proses sintesis dan replikasi DNA (Rabinovitch, 1990), sehingga penghentian siklus sel pada fase S dan G2-M memberi kesempatan sel untuk memperbaiki DNA yang rusak. Pada doksorubisin yang digunakan sebagai kontrol positif menunjukkan
bahwa akumulasi sel yang lebih tinggi dibanding kontrol terjadi pada fase G2-M, yaitu sebesar 76,20%. Hal ini menunjukkan sel mengalami penghambatan siklus sel dengan cara melakukan perbaikan DNA yang telah rusak dan mencegah terjadinya proses lanjut pembelahan sel kanker (Rabinovitch, 1990). Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh beberapa checkpoint.
Kontrol checkpoint berfungsi untuk memastikan bahwa kromosom utuh dan tahap-tahap kritis siklus sel telah sempurna sebelum memasuki tahap selanjutnya.
Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan aktivasi dan degradasi cyclin, aktivasi CDKs, dan CDKIs. Interaksi diantara ketiga kelas aktivasi tersebut berperan mengontrol berbagai tahap siklus sel, dan mencegah sel ke tahap selanjutnya jika terjadi kerusakan DNA dan deregulasi proses ini juga berperan dalam kejadian kanker (Sudarmawan, 2009) .
Salah satu agen kemoterapi yang digunakan dalam terapi kanker payudara dan menjadi salah satu pilihan lini pertama dalam terapi kanker metastasis adalah doksorubisin (O’brien, dkk., 2004). Mekanisme aktivitas antikanker doksorubisin diketahui melalui modulasi siklus sel. Doksorubisin memicu kerusakan DNA sel kanker melalui pengikatan DNA dan pengeblokan topoisomerase II, sehingga DNA menjadi kusut dan sel kanker tidak mampu membelah (Gewirtz, 1999).
Doksorubisin menghambat enzim DNA Topoisomerase II dengan membentuk kompleks yang stabil dengan DNA, sehingga mencegah pemotongan dan penyambungan untai DNA yang dikatalisis oleh DNA Topoisomerase II (Gewirtz, 1999). Kegagalan dalam penyambungan untai DNA menyebabkan siklus sel terhenti pada fase G0/G1 dan G2 (Gewirtz, 1999; Minotti, dkk., 2004), serta memacu terjadinya apoptosis melalui mediator p53 (Wang, dkk., 2004).
Doksorubisin mempunyai efek yang bagus sebagai antitumor. Namun, doksorubisin relatif memiliki indeks terapi yang sempit dan penggunaannya secara klinis sangat terbatas, karena mengakibatkan toksisitas akut maupun kronis, seperti myelosupresi, imunosupresi dan kardiotoksisitas. Penggunaan doksorubisin dalam waktu lama dan dosis besar juga berpotensi menimbulkan efek samping dan resistensi (Smith, dkk., 2010), sehingga penggunaan doksorubisin tunggal tidak lagi efektif.
Hambatan regulasi daur sel pada fase S dan G2-M oleh EEABA terjadi akibat penghambatan pada enzim yang berperan dalam replikasi DNA, seperti ribonucleotide reductase atau terjadi karena adanya peningkatan ekspresi tumor supressor gen p53, dan adanya penurunan ekspresi regulator positif G1/S seperti cyclin D, cyclin A, dan cyclin E yang bertanggung jawab untuk memasuki fase S (Sudarmawan, 2009).
Pada penelitian ini diketahui sel 4T1 memiliki karakter mutasi pada gen p53 yang berperan dalam regulasi proliferasi sel (Yerlikaya, dkk., 2012). Ekspresi p53 merupakan gen yang bertugas untuk mendeteksi adanya kerusakan DNA, membantu perbaikan DNA melalui penghentian fase G1 dari siklus sel dan memicu gen yang memperbaiki DNA (Yenita, 2012). Pada sel normal, ekspresi p53 dihasilkan cukup rendah (Sudarmawan, 2009). Namun, ketika terjadi kerusakan DNA, maka p53 akan teraktivasi dan mengaktifkan p21 serta p27 (Ismiyati, 2016). p21 dan p27 akan menurunkan level kompleks CDK yang diperlukan selama daur sel dengan cara mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK-4, CDK-6, dan CDK-2 pada fase G1/S (Ismiyati, 2016; Sudiana, 2011;
Foster, dkk., 2001) dan CDK-1 pada fase M (Sudiana, 2011). Terjadinya peningkatan ekspresi p53 akan meningkatkan level p21 dan p27 yang merupakan
suatu inhibitor Cdk, sehingga menyebabkan fosforilasi Rb menjadi terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F menjadi terhenti (Sudarmawan, 2009). Hal ini menyebabkan siklus sel menjadi terhenti pada tahap G1-S dan G2 ke M. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya (Sudarmawan, 2009). Terjadinya penghambatan kompleks CDKIs ini tidak lepas dari peran senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam EEABA, yaitu adanya senyawa flavonoid, alkaloid, tanin, dan saponin yang bersifat sebagai antikanker. Flavonoid, Alkaloid, dan saponin dapat meningkatkan ekspresi p53 (Nirwana, 2015). Terjadinya peningkatan ekspresi tersebut menyebabkan kompleks CDK-cyclin menjadi terhambat, sehingga sel tidak dapat menyelesaikan daur selnya (pertumbuhannya menjadi terhenti) (King, 2000).
Tanin merupakan senyawa polifenol yang berperan sebagai antiproliferatif sel kanker, bekerja dengan cara meningkatkan ekspresi gen p27 yang akan mengikat cyclin E/Cdk2 selama transisi fase G1 ke fase S dan Cyclin A/Cdk2 selama di fase S. Hal ini menyebabkan terhambatnya siklus sel pada fase S (Nirwana, 2015; Pucci, dkk., 2000). Flavonoid dapat menghambat kinerja dari semua CDK yang merupakan regulator daur sel. Titik kerja dari flavonoid diperkirakan terletak pada penghambatan kerja enzim CDK-Activating Kinase/CAK sehingga menghambat terbentuknya kompleks CDK-Cyclin yang aktif, sehingga hal ini menyebabkan checkpoint pada fase G1/S dan G2/M terganggu oleh adanya flavonoid (Meiyanto, 2005).
BAB V