BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
C. Hasil Preparasi Sampel
Preparasi sampel ini dilakukan untuk mendapatkan fraksi air ekstrak metanol buah labu siam yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa antioksidan. Sampel yang digunakan merupakan buah labu siam segar. Digunakan sampel segar karena bertujuan untuk menjaga kestabilan senyawa fenolik di dalam tanaman karena senyawa fenolik cenderung mengalami perubahan susunan dengan adanya pengeringan atau pemanasan. Perubahan yang terjadi dapat menurunkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik (Markam, 1988)
Alasan lain digunakan sampel segar adalah untuk menjaga stabilitas senyawa fenolik pada tanaman. Menurut Handayani (2011) proses pengeringan dapat memicu terjadinya peristiwa browning dan blackening. Peristiwa tersebut terjadi dipicu oleh reaksi oksidasi akibat adanya pemanasan yang dikatalis oleh enzim fenol oksidase atau polifenol oksidase sehingga menyebabkan senyawa fenolik berubah menjadi quinon dan kemudian dipolimerasi menjadi pigmen melaniadin. Senyawa fenolik dalam bentuk polimer tersebut yang tidak memiliki aktivitas antioksidan.
Buah labu siam segar dihilangkan kulitnya terlebih dahulu kemudian dicuci untuk menghilangkan getah-getah yang terdapat pada permukaan buah. Buah labu siam yang telah dikupas harus segera diolah karena untuk menghindari peristiwa browning pada buah. Ketika buah dikupas atau dipotong, enzim yang tersimpan di dalam jaringan buah akan terbebas. Apabila enzim tersebut mengalami kontak dengan oksigen di udara, fenolase akan mengkatalisis konversi biokimia dari senyawa fenolik yang terdapat pada buah sehingga senyawa fenolik akan berubah menjadi bentuk polimer yang tidak memiliki aktivitas antioksidan.
Buah labu siam yang telah bersih dipotong kecil-kecil supaya lebih mudah diblender. Buah labu siam diblender terlebih dahulu untuk memperkecil ukuran pemukaan agar penyari dapat kontak lebih luas dengan simplisia. Lalu dilakukan proses maserasi dengan metanol. Dipilih metode ekstraksi dengan maserasi karena ekstraksi ini tidak melibatkan pemanasan sehingga perubahan-perubahan senyawa dapat dihindari. Selain itu, proses maserasi sangat menguntungkan untuk isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman ekstrak tumbuhan dapat menyebabkan pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada di dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna.
Metanol dipilih sebagai penyari karena metanol merupakan pelarut universal dan penetrasinya ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat dibanding etanol maupun cairan penyari yang lain (Depkes RI b, 2000). Hal tersebut dikarenakan metanol memiliki viskositas yang lebih rendah dibandingkan etanol walaupun
keduanya memiliki polaritas yang hampir sama. Metanol memiliki konsistensi yang lebih encer menyebabkan metanol lebih mudah berdifusi menembus sel-sel tanaman (Pedricilli, 2001). Selain itu, metanol memiliki presentase OH yang lebih besar dibandingkan dengan etanol sehingga proses pembasahan bahan dan ekstraksinya lebih efektif.
Maserasi dilakukan dalam tabung erlenmeyer tertutup agar metanol tidak menguap karena sifat metanol mudah menguap pada suhu kamar. Selain itu, juga untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar. Tabung erlenmeyer dibungkus dengan alumunium foil agar tidak terkena cahaya matahari atau sinar matahari langsung. Hal ini dikarenakan ada beberapa senyawa dapat bereaksi oleh adanya cahaya dan juga dapat mengalami kerusakan oleh sinar ultraviolet matahari.
Maserasi dilakukan selama 2x24 jam dan dibantu dengan shaker agar proses maserasi lebih efektif karena penyari lebih banyak kontak langsung dengan sel-sel dalam buah labu siam dibandingkan jika hanya didiamkan saja. Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum karena jumlah bahan banyak sehingga membutuhkan waktu yang lama jika disaring secara biasa. Ampas yang diperoleh dari hasil penyaringan diremaserasi dengan metanol selama 1x24 jam kemudian dilakukan penyaringan dengan pompa vakum, filtrat disimpan dan ampas kembali diremaserasi selama 1x24 jam dengan penyari metanol. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan proses penyarian agar diperoleh lebih banyak senyawa fenolik.
Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan tersebut diupkan pelarutnya menggunakan vaccum rotary evaporator (rotavapor) pada suhu 400C-500C.
Tujuan digunakannya rotavapor agar filtrat metanol yang akan diuapkan pelarutnya tidak mengalami kontak dengan panas yang berlebihan dengan demikian, kerusakan senyawa-senyawa kimia yang terkadung dalam filtrat metanol dapat dihindari.
Rotavapor menggunakan prinsip penguapan dengan pengurangan tekanan. Suatu cairan akan mendidih jika tekanan uap cairan sama dengan tekanan atmosfir di sekelilignya. Oleh karena itu, adanya pengurangan tekanan pada alat di bawah tekanan atmosfir dapat menyebabkan metanol mendidih dibawah titik didih normalnya (Depkes RI, 1986). Pada penguapan tersebut hampir semua metanol teruapkan. Sisa metanol dan air yang tertinggal dalam ekstrak kemudian diuapkan dengan waterbath dan dibantu dengan kipas angin untuk mempercepat penguapan. Hasil penguapan ini selanjutya disebut ekstrak metanolik buah labu siam. Hasil ektsrak metanolik buah labu siam yang diperoleh dari proses maserasi adalah sebesar 64,6 g sehingga diperoleh rendemen ekstrak metanolik sebesar 6,5%.
Setelah didapatkan ekstrak kental metanolik buah labu siam, kemudian ekstrak dilarutkan dengan air hangat sebanyak 300 mL. Digunakan air hangat agar lebih mudah melarutkan ekstrak. Ekstrak dipartisi dengan wash bensin di dalam corong pisah dengan perbandingan air dan wash bensin 1 : 1. Fraksi air berada dibagin bawah sedangkan fraksi wash bensin berada pada bagian atas. Hal ini dikarenakan berat jenis wash bensin lebih kecil dibandingkan berat jenis air. Berat jenis wash bensin adalah 0,730 sedangkan berat jenis air adalah 0,996.
Partisi dengan wash bensin ini bertujuan untuk menghilangkan zat-zat kimia yang bersifat nonpolar seperti lipid dan klorofil yang dapat mengganggu proses analisis, sedangkan dalam fraksi air terlarut senyawa-senyawa fenolik akan dianalisis selanjutnya.
Proses eksrtaksi dilakukan berulang sebanyak 3 kali agar ekstraksi lebih efektif dan senyawa fenolik terlarut seluruhnya dalam fraksi air. Penggojogan lemah pada proses ekstraksi dimaksudkan agar tidak terbentuk emulsi yang dapat menyebabkan proses pemisahan menjadi lebih lama (Matsuda,2001).
Setelah didapatkan fraksi air pertama kemudian fraksi tersebut diekstraksi cai-cair dengan etil asetat. Hal ini bertujuan untuk memurnikan senyawa fenolik yang didapatkan. Fraksi etil asetat akan berada di atas sedangkan fraksi air berada di bawah. Hal ini dikarenakan berat jenis etil asetat (0,898) lebih kecil dibandingkan berat jenis air (0,996). Fraksi etil esetat dibuang sedangkan fraksi air akan dianalisis.
Senyawa fenolik dapat berbentuk glikosida maupun aglikonnya. Dalam bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan dalam bentuk aglikonnya senyawa fenolik bersifat lebih nonpolar. Karena itu, tidak menutup kemungkinan adanya senyawa fenolik yang terlarut dalam air maupun etil asetat yang bersifat semi polar. Peneliti tertarik untuk menguji aktivitas antioksidan fraksi air dibandingkan fraksi etil asetat karena kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada buah labu siam yang mempunyai kelarutan yang baik pada pelarut polar seperti air, sehingga diharapkan aktivitas antioksidan pada fraksi air ini cukup baik. Lima dan Maciel (2006) melaporkan bahwa ekstrak metanol labu
siam mengandung fenolat, flavonoid, tanin terkondensasi, dan asam askorbat. Selain itu peneliti telah melakukan uji pendahuluan terhadap fraksi etil asetat dan memberikan hasil bahwa fraksi etil asetat tidak menunjukkan adanya senyawa fenolik dan aktivitas antioksidan (lampiran 15). Fraksi air yang didapatkan diuapkan pelarutnya dengan pemanasan menggunakan waterbath dengan bantuan kipas angin sehingga diperoleh ekstrak kental air buah labu siam.
Berat fraksi air yang didapatkan sebesar 26,1 g dengan rendemen. 2,6 % Fraksi tersebut disimpan dalam cawan poselin ditutup dengan plastik dan alumunium foil lalu disimpan dalam eksikator. Hal ini dilakukan untuk menghindari adanya kerusakan senyawa fenolik dalam fraksi air tersebut dari pengaruh cahaya, udara maupun kelembaban.
D. Hasil Uji Pendahuluan