BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
C. Hasil Preparasi Sampel
Preparasi sampel ini dilakukan untuk mendapatkan fraksi etil asetat ekstrak etanol buah anggur yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa antioksidan. Sampel yang digunakan merupakan buah anggur segar. Digunakan sampel segar bertujuan untuk menjaga kestabilan senyawa fenolik di dalam tanaman karena senyawa fenolik cenderung mengalami perubahan susunan dengan adanya pengeringan atau pemanasan. Perubahan yang terjadi dapat menurunkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik (Markham, 1988). Selain itu, digunakan sampel segar bertujuan menjaga stabilitas senyawa fenolik pada tanaman. Menurut Handayani (2011) proses pengeringan dapat memicu terjadinya peristiwa browning dan blackening. Peristiwa tersebut terjadi karena reaksi oksidasi akibat adanya pemanasan yang dikatalis oleh enzim fenol oksidase atau polifenol oksidase sehingga menyebabkan senyawa fenolik berubah menjadi quinon dan kemudian dipolimerasi menjadi pigmen melaniadin. Senyawa fenolik dalam bentuk polimer tersebut tidak memiliki aktivitas antioksidan.
Buah anggur segar dicuci terlebih dahulu untuk menghilangkan pengotor yang terdapat pada permukaan buah. Buah anggur yang sudah dipetik dari tangkainya harus segera diolah untuk menghindari peristiwa pembusukan pada buah. Buah anggur yang telah bersih tidak perlu dipotong kecil-kecil maupun dikupas kulitnya karena digunakan seluruh bagian dari buah, yaitu kulit buah dan biji, Seluruh bagian
dari buah anggur dihaluskan terlebih dahulu untuk memperkecil ukuran pemukaan agar penyari dapat kontak lebih luas dengan simplisia. Lalu dilakukan proses maserasi 150 g buah anggur dengan etanol 96% maserasi ini dilakukan dengan tiga replikasi.
Dipilih metode ekstraksi dengan maserasi karena ekstraksi ini tidak melibatkan pemanasan sehingga perubahan-perubahan senyawa dapat dihindari. Selain itu, proses maserasi sangat menguntungkan untuk isolasi senyawa bahan alam karena selain dengan perendaman ekstrak tumbuhan digunakan juga shaker sebagai alat untuk membantu penggojogan yang dapat meningkatkan kontak antara cairan penyari yang digunakan dengan sampel, sehingga terjadi pemecahan dinding sel dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel yang mengakibatkan metabolit sekunder yang ada di dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna.
Maserasi dilakukan selama tiga kali 24 jam dalam tabung erlenmeyer 500 mL dengan di beri penutup agar etanol tidak menguap karena sifat etanol mudah menguap pada suhu kamar. Selain itu, juga untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar. Tabung erlenmeyer dibungkus dengan alumunium foil agar tidak terkena cahaya matahari atau sinar matahari langsung. Hal ini dikarenakan ada beberapa senyawa dapat bereaksi oleh adanya cahaya dan juga dapat mengalami kerusakan oleh sinar ultraviolet matahari.
Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum karena jumlah bahan banyak, sehingga membutuhkan waktu yang lama jika disaring secara biasa. Ampas
yang diperoleh dari hasil penyaringan diremaserasi dengan etanol selama 1 kali 24 jam kemudian dilakukan penyaringan dengan pompa vakum, filtrat disimpan dan ampas kembali diremaserasi selama satu kali 24 jam dengan penyari etanol. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan proses penyarian agar diperoleh lebih banyak senyawa fenolik. Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan tersebut diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum rotary evaporator (rotavapor) pada suhu 65°C.
Tujuan digunakannya rotavapor agar filtrat etanol yang akan diuapkan pelarutnya tidak mengalami kontak dengan panas yang berlebihan dengan demikian, kerusakan senyawa-senyawa kimia yang terkadung dalam filtrat etanol dapat dihindari. Rotavapor menggunakan prinsip penguapan dengan pengurangan tekanan. Suatu cairan akan mendidih jika tekanan uap cairan sama dengan tekanan atmosfir di sekelilingnya. Oleh karena itu, adanya pengurangan tekanan pada alat di bawah tekanan atmosfir dapat menyebabkan etanol mendidih di bawah titik didih normalnya (Depkes RI, 1986). Pada penguapan tersebut hampir semua etanol teruapkan. Sisa etanol dan air yang tertinggal dalam ekstrak kemudian diuapkan dengan waterbath untuk mempercepat penguapan. Hasil penguapan ini selanjutnya disebut ekstrak etanol buah anggur. Hasil ektsrak etanol buah anggur yang diperoleh dari proses maserasi adalah sebesar 45,10 g sehingga diperoleh rendemen ekstrak etanol sebesar 10,022%.
Etanol merupakan salah satu pelarut universal yang dapat menyari banyak senyawa kimia seperti klorofil, minyak, vitamin dan mineral. Oleh sebab itu, dalam
penelitian ini dilakukan fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa didalam ekstrak sehingga yang didapat adalah senyawa-senyawa-senyawa-senyawa yang dituju yaitu senyawa fenolik. Dalam melakukan fraksinasi, pada penelitian ini digunakan prinsip ektraksi cair-cair di mana merupakan teknik ekstraksi yang menggunakan dua pelarut yang tidak tercampurkan yang menimbulkan perpindahan senyawa terlarut dari satu pelarut ke pelarut kedua. Setelah didapatkan ekstrak kental etanol buah anggur, ekstrak dilarutkan dengan air hangat sebanyak 150 mL. Digunakan air hangat agar lebih mudah melarutkan ekstrak. Ekstrak dipartisi dengan etil asetat di dalam corong pisah dengan perbandingan air dan etil asetat 1 : 3. Fraksi etil asetat akan berada di atas sedangkan fraksi air berada di bawah. Hal ini dikarenakan berat jenis etil asetat (0,898) lebih kecil dibandingkan berat jenis air (0,996).
Fraksi air dibuang sedangkan fraksi etil asetat akan dianalisis. Fraksinasi juga dilakukan secara berulang sebanyak tiga kali karena menurut Gandjar dan Rohman (2007) ekstraksi berulang dengan volume yang sama akan lebih efektif dibanding melakukan ekstraksi tunggal dengan volume yang besar. Oleh karena itu, fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali dengan 150 mL etil asetat. Bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan bentuk aglikonnya bersifat cenderung non polar, sehingga tidak menutup kemungkinan adanya senyawa tersebut larut dalam air maupun etil asetat (Bruneton, 1999).
Fraksi kemudian diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator untuk meminimalkan pemaparan pemanasan supaya stabilitas senyawa fenolik tetap terjaga. Sisa fraksi etil asetat kemudian dimasukkan kedalam oven dengan suhu 40 oC selama
24 jam untuk menguapkan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kental. Fraksi kental etil asetat dalam cawan petri kemudian dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terkena udara dan tidak terpapar sinar UV yang dapat mendegradasi senyawa fenolik yang ada didalam fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukan kedalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,7299g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,162 %.
D. Hasil Uji Pendahuluan