BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Hasil Uji Kualitatif Senyawa
Setelah ekstrak etanol kental biji petai diperoleh, dilakukan uji identifikasi senyawa untuk melihat kandungan senyawa aktif yang terdapat pada ekstrak tersebut. Uji identifikasi senyawa yang dilakukan pada penelitian ini hanya untuk membuktikan apakah di dalam ekstrak etanol kental biji petai terdapat senyawa aktif flavonoid dan β-sitosterol atau tidak. Uji identifikasi senyawa dilakukan dengan 2 cara yaitu menggunakan uji tabung untuk membuktikan senyawa flavonoid dan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk membuktikan senyawa β-sitosterol.
4.3.1 Uji Identifikasi Senyawa Flavonoid
Uji identifikasi senyawa flavonoid secara kualitatif dapat ditentukan menggunakan uji tabung. Uji identifikasi menggunakan uji tabung ini digunakan untuk membuktikan bahwa di dalam ekstrak etanol biji petai terdapat senyawa flavonoid. Pada penelitian ini, uji tabung dilakukan dengan menggunakan pereaksi Wilstater dan Bate Smite-Metcalfe. Alasan penggunaan pereaksi Wilstater dan Bate Smite-Metcalfe dikarenakan pereaksi tersebut dapat menyebabkan perubahan warna yang spesifik yang menandakan terdapatnya senyawa flavonoid di dalam ekstrak.
1. Uji pereaksi Wilstater
Gambar 4.2 Hasil Uji Flavonoid dengan Pereaksi Wilstater
Keterangan :
a. Larutan ekstrak etanol biji petai sebelum direaksikan
b. Larutan ekstrak etanol biji petai setelah penambahan HCl pekat dan Mg namun tanpa pemanasan
c. Larutan ekstrak etanol biji petai setelah pemanasan dan penambahan HCl pekat dan Mg
Berdasarkan hasil uji flavonoid menggunakan pereaksi Wilstater, pada gambar 4.2 larutan ekstrak etanol biji petai mengalami perubahan setelah ditetetesi HCl pekat dan serbuk Mg. Menurut literatur, disebutkan bahwa hasil uji flavonoid menggunakan pereaksi Wilstater dikatakan positif apabila larutan setelah dipanaskan dan direaksikan dengan HCl pekat dan serbuk Mg menunjukkan perubahan warna menjadi merah, kuning atau jingga (Illing et al., 2017). Berdasarkan hal tersebut, dapat dikatakan larutan ekstrak etanol biji petai positif mengandung senyawa flavonoid dikarenakan terjadi perubahan warna dari semula warna orange kecoklatan menjadi warna kuning. Jenis senyawa flavonoid yang dapat teridentifikasi menggunakan pereaksi Wilstater yaitu senyawa flavonoid yang mengandung gula (glikosida).
Gambar 4.3 Reaksi Uji Wilstater (Marliana and Suryanti, 2005)
Prinsip uji flavonoid dengan pereaksi Wilstater yaitu menghidrolisis flavonoid menjadi bentuk aglikonnya dengan cara menghidrolisis O-glikosil. Glikosil akan tergantikan oleh H+ dari asam dikarenakan sifatnya yang elektrofilik (Ikalinus et
al., 2015). Selain itu, pemberian HCl pekat dan serbuk Mg juga berfungsi untuk mereduksi inti benzopiron yang terdapat pada struktur flavonoid sehingga terbentuk senyawa kompleks yang berwarna merah, kuning atau jingga (Illing et al., 2017).
2. Uji Pereaksi Bate Smite-Metcalfe
Gambar 4.4 Hasil Uji Flavonoid dengan Pereaksi Bate Smite-Metcalfe
Keterangan :
a. Larutan ekstrak etanol biji petai sebelum direaksikan
b. Larutan ekstrak etanol biji petai setelah penambahan dan pemanasan HCl pekat
Berdasarkan hasil uji flavonoid menggunakan pereaksi Bate Smite-Metcalfe, pada gambar 4.4 larutan ekstrak etanol biji petai mengalami perubahan setelah pemberian dan pemanasan HCl pekat. Menurut literatur, disebutkan bahwa hasil uji flavonoid menggunakan pereaksi Bate Smite-Metcalfe dikatakan positif apabila larutan setelah pemberian dan pemanasan HCl pekat menunjukkan perubahan warna menjadi merah (Ikalinus et al., 2015). Hasil positif pada pereaksi Bate Smite-Metcalfe menunjukkan adanya senyawa aktif leukoantosianin (Widyowati and Rahman, 2010). Hasil warna merah sampai jingga menunjukkan senyawa flavon, hasil warna merah tua menunjukkan senyawa flavonol atau flavonon (Pratiwi et al., 2013). Berdasarkan hal tersebut, dapat dikatakan larutan ekstrak etanol biji petai positif mengandung senyawa flavonoid dikarenakan terjadi perubahan warna dari semula warna orange kecoklatan menjadi warna merah. Jenis senyawa flavonoid yang dapat teridentifikasi menggunakan pereaksi ini yaitu senyawa flavonoid yang mengandung keton seperti flavonoid jenis flavon, flavonol.
Prinsip uji flavonoid dengan pereaksi Bate Smith-Metcalfe ini yaitu HCl mereduksi gugus keton sehingga terbentuknya karbokation yang bersifat tidak stabil yang dapat menyebabkan terjadinya resonansi yang pada akhirnya terbentuk garam flavilium. Reaksi uji Bate Smith-Metcalfe dapat dilihat pada gambar 4.5
Gambar 4.5 Reaksi Uji Bate Smite-Metcalfe (Rahayu et al., 2015)
4.3.1 Uji Kualitatif β-sitosterol Menggunakan KLT
Visibel UV 254 nm UV 365 nm
(a) (b) (c)
Gambar 4.6 Hasil Uji Kualitatif Β-sitosterol Menggunakan KLT
Keterangan :
Spot kiri : Pembanding β-sitosterol Spot kanan : Ekstrak etanol biji petai
(a) Plat KLT setelah disemprot dengan pereaksi LB
(b) Plat KLT diamati di bawah sinar UV 254 nm setelah disemprot dengan pereaksi LB (c) Plat KLT diamati di bawah sinar UV 365 nm setelah disemprot dengan pereaksi LB
Uji kualitatif menggunakan KLT pada penelitian ini menggunakan fase gerak toluena : etil asetat (8:2). Penggunaan fase gerak ini menyesuaikan prinsip dari “like dissolve like” dimana senyawa yang bersifat polar akan berikatan dalam pelarut polar dan senyawa yang non polar akan berikatan dalam pelarut non polar. β-sitosterol merupakan senyawa yang tidak larut dalam air, sehingga bersifat non polar. Penggunaan jumlah toluene yang lebih banyak dibandingkan dengan etil asetat dikarenakan toluena lebih cenderung non polar dibandingkan etil asetat
yang bersifat semi polar sehingga hal ini sesuai dengan senyawa β-sitosterol. Berdasarkan hasil elusi yang diperoleh, fase gerak ini mampu memberikan hasil yang bagus sehingga pada penelitian ini menggunakan perbandingan fase gerak tersebut.
Pada penelitian ini menggunakan pereaksi Lieberman burchard (LB) untuk membuktikan bercak dari senyawa β-sitosterol. Hasil plat KLT yang telah disemprot dengan pereaksi LB diamati secara visibel dan juga di bawah UV 254 dan 365 nm terlihat bercak sampel dan nilai Rf yang sama dengan pembanding β-sitosterol. Pada pengamatan secara visibel diperoleh bercak yang berwarna coklat merah keunguan. Berdasarkan literatur, pereaksi LB akan memberikan hasil yang positif jika terbentuk warna merah, hijau, ungu, dan biru (Handayani et al., 2017). Prinsip uji kualitatid β-sitosterol dengan pereaksi LB yaitu terjadinya proses pelepasan H2O dan penggabungan dengan karbokation yang mengakibatkan terjadinya resonansi serta perpanjangan konjugasi yang memperlihatkan munculnya warna merah-ungu (Siadi, 2012)
Berdasarkan hasil, diperoleh spot yang sejajar antara sampel ekstrak etanol biji petai terhadap spot senyawa pembanding β-sitosterol dengan nilai Rf yang sama yaitu 0,56. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak etanol biji petai positif terdapat kandungan senyawa β-sitosterol.
Gambar 4.7 Reaksi Steroid dengan Pereaksi Lieberman Burchard (Nafisah et al., 2014)