Lebah Trigona spp.
Lebah Trigona spp. merupakan serangga sosial yang hidup berkelompok membentuk suatu koloni. Lebah ini mudah dijumpai di daerah tropis dan subtropis di Amerika Selatan, setengah bagian Afrika Selatan, dan Asia Tenggara. Koloninya terdiri dari 300-800.000 ekor lebah (Free 1982). Trigona spp. (gala-gala, lebah lilin), dalam bahasa daerah dinamakan klanceng, lenceng (jawa), atau teuweul (sunda) (Perum Perhutani 1986 diacu dalam Lasmayanty 2007). Jumlah madu yang dihasilkan lebih sedikit dan lebih sulit diekstrak, namun jumlah propolis yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan dengan lebah jenis lain (Singh 1962 diacu dalam Lasmayanty 2007).
Trigona spp. memiliki sengat sisa, namun tidak digunakan sebagai alat pertahanan. Lebah ini akan menggigit musuhnya atau membakar kulit musuhnya dengan larutan basa. Organ vital (mata, hidung, dan telinga) musuh akan dikelilingi oleh lebah lain dalam satu koloninya. Lebah ini juga dilengkapi sistem kekebalan untuk menyerang serangga pengganggu lain (Free 1982). Koloni lebah madu terdiri dari dua golongan, yaitu golongan reproduktif (lebah jantan dan ratu) dan golongan non reproduktif (lebah pekerja). Mereka dapat dibedakan satu dengan lainnya dari bentuk, rupa, warna, dan tingkah laku. Satu koloni lebah memiliki hanya satu ekor ratu, ratusan ekor lebah jantan, dan ribuan ekor lebah pekerja (Sumoprastowo 1980).
Trigona spp. biasanya membuat sarang di dalam lubang pohon, celah dinding atau lubang bambu di dalam rumah. Beberapa koloni menempati bekas sarang semut atau
PENDAHULUAN
Propolis merupakan salah satu produk alami yang dihasilkan lebah madu, dan telah banyak dimanfaatkan sebagai obat atau suplemen, pencuci mulut, anti-peradangan, terapi penyakit, mempercepat penyembuhan luka, dan lain-lain. Selain itu, propolis banyak memiliki manfaat dan potensi khusus, karena memiliki sifat sebagai anti-bakteri, anti-virus, dan dapat menghambat pertumbuhan kanker. Melihat potensi propolis ini, maka perlu dibuktikan secara ilmiah tentang potensi dan pemanfaatan propolis terutama sebagai antibakteri.
Propolis sangat berperan dalam menjaga lingkungan internal sarang yang aseptik. Bukti signifikan tentang sifat antimikrobanya berasal dari kegunaan produk ini di dalam sarang itu sendiri, yaitu untuk membungkus bangkai hewan pengganggu yang sudah mati dengan propolis, karena hewan ini terlalu berat untuk dapat dibuang dari sarangnya (misalnya ular kecil atau tikus). Prosesnya menghasilkan efek serupa pembalseman, karena tubuh mati hewan tersebut mengering tanpa mengalami pembusukan (Salatino et al. 2005). Hal ini tentu sangat penting untuk melindungi sarang lebah dari infeksi bakteri yang dapat menyebar luas. Pengetahuan keefektifan antiseptik propolis sudah diketahui sejak lama. Aristoteles menyarankan penggunaan propolis untuk merawat abses dan luka (Salatino et al. 2005).
Sifat dan karakteristik E. sakazakii telah banyak diteliti dalam hal fisiologi dan ketahanannya terhadap lingkungan (Breeuwer et al. 2003). Penelitian tentang sifat-sifat bakteri ini merupakan langkah penting dalam usaha untuk mengeliminasi bakteri ini dari lingkungan produksi pangan yang penting seperti pada pembuatan susu bubuk formula. Akan tetapi, tentang bahan tambahan alami untuk mencegah terjadinya kontaminasi susu oleh bakteri ini belum banyak diketahui. Salah satu bahan alami yang telah diuji berpotensi sebagai antibakteri adalah propolis Trigona spp. Penelitian ini diharapkan dapat menunjukkan potensi propolis Trigona spp. sebagai antibakteri terhadap E. sakazakii, sehingga propolis ini dapat dimanfaatkan sebagai bahan pengawet alami untuk mencegah atau mengurangi kontaminasi bakteri pada susu formula bayi.
Penelitian bertujuan menentukan aktivitas antibakteri propolis dan menentukan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) propolis terhadap E. sakazakii.
Hipotesis penelitian ini adalah propolis mempunyai aktivitas antibakteri terhadap E. sakazakii. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang propolis sebagai antibakteri E. sakazakii, dan dapat mendukung penelitian-penelitian selanjutnya untuk memperluas aplikasi dan nilai guna propolis.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Laboratorium Mikrobiologi Medik, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Mei-September 2008.
TINJAUAN PUSTAKA
Lebah Trigona spp.
Lebah Trigona spp. merupakan serangga sosial yang hidup berkelompok membentuk suatu koloni. Lebah ini mudah dijumpai di daerah tropis dan subtropis di Amerika Selatan, setengah bagian Afrika Selatan, dan Asia Tenggara. Koloninya terdiri dari 300-800.000 ekor lebah (Free 1982). Trigona spp. (gala-gala, lebah lilin), dalam bahasa daerah dinamakan klanceng, lenceng (jawa), atau teuweul (sunda) (Perum Perhutani 1986 diacu dalam Lasmayanty 2007). Jumlah madu yang dihasilkan lebih sedikit dan lebih sulit diekstrak, namun jumlah propolis yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan dengan lebah jenis lain (Singh 1962 diacu dalam Lasmayanty 2007).
Trigona spp. memiliki sengat sisa, namun tidak digunakan sebagai alat pertahanan. Lebah ini akan menggigit musuhnya atau membakar kulit musuhnya dengan larutan basa. Organ vital (mata, hidung, dan telinga) musuh akan dikelilingi oleh lebah lain dalam satu koloninya. Lebah ini juga dilengkapi sistem kekebalan untuk menyerang serangga pengganggu lain (Free 1982). Koloni lebah madu terdiri dari dua golongan, yaitu golongan reproduktif (lebah jantan dan ratu) dan golongan non reproduktif (lebah pekerja). Mereka dapat dibedakan satu dengan lainnya dari bentuk, rupa, warna, dan tingkah laku. Satu koloni lebah memiliki hanya satu ekor ratu, ratusan ekor lebah jantan, dan ribuan ekor lebah pekerja (Sumoprastowo 1980).
Trigona spp. biasanya membuat sarang di dalam lubang pohon, celah dinding atau lubang bambu di dalam rumah. Beberapa koloni menempati bekas sarang semut atau
2
rayap dan membangun sarangnya di bebatuan di bawah tanah (Free 1982). Sarang lebah dibuat dengan mencampur lilin dan resin propolis dari tanaman. Sarang tersusun atas sel anakan yang dikelilingi dengan pelepah lembut yang disebut involucrum dan sel besar yang terdiri dari madu serta cadangan polen (Free 1982).
Propolis
Propolis merupakan resin lengket yang dikumpulkan oleh lebah pekerja dari kuncup, kulit kayu, dan dari bagian tumbuhan lain (Gojmerac 1983). Kata propolis berasal dari bahasa Yunani, dari akar kata pro yang berarti pertahanan terhadap sesuatu, dan polis yang berarti kota (Salatino et al.2005). Arti kata ini mengimplikasikan suatu produk yang terlibat dalam pertahanan dari suatu komunitas lebah terhadap pengganggu. Propolis merupakan produk alami lebah yang menunjukkan efek antimikroba (Dharmayanti 2000). Lebah madu membuat propolis dengan mengumpulkan getah damar dari tanaman yang dicampur dengan lilin pada sarangnya. Lebah madu memerlukan propolis karena lebah madu rentan terhadap infeksi virus dan bakteri (Chinthapally et al.1993). Selain itu, propolis digunakan untuk mengisi celah dan retakan serta menghaluskan permukaan yang kasar pada sarang lebah madu (Gojmerac 1983).
Komposisi utama propolis adalah lilin, resin, dan senyawa volatil. Lilin merupakan sekresi dari lebah itu sendiri, sedangkan dua senyawa lainnya diperoleh dari tumbuhan. Aktivitas biologis dari propolis dihubungkan dengan sifatnya sebagai substansi turunan dari tumbuhan (Salatino et al. 2005). Kemudian, meskipun propolis merupakan hasil produksi hewan, proporsi komponen penyusunnya, yang terutama sebagian besarnya memiliki aktivitas biologis, merupakan turunan dari tumbuhan. Karena itu secara kimia, propolis sangat kompleks dan kaya akan senyawa terpena, asam benzoat, asam kafeat, asam sinamat, dan asam fenolat. Tabel 1 menunjukkan hasil analisis uji fitokimia propolis Pandeglang.
Propolis juga mengandung flavonoid yang sangat tinggi sehingga banyak peneliti lebih memilih propolis sebagai senyawa flavonoid (Chinthapally et al. 1993). Resinnya mengandung sebagian besar senyawa yang ditemukan dalam ekstrak alkohol yang dikonsumsi oleh masyarakat dari berbagai daerah sebagai tambahan makanan atau obat
alternatif. Propolis juga mengandung penyusun lainnya, seperti polen dan asam amino (Salatino et al.2005).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa propolis dapat berfungsi sebagai antibakteri alami dengan aktivitas yang tinggi. Beberapa penelitian ilmiah menunjukkan bahwa propolis memiliki aktivitas penghambatan terhadap beberapa spesies Streptococcus yang dapat menyebabkan karies gigi (Lasmayanty 2007). Selain itu, propolis juga dapat melawan Staphylococcus aureus, bakteri yang berbahaya karena sering menyebabkan kematian, infeksi, keracunan darah, dan beberapa tipe pneumonia (Miorin et al. 2003). Menurut Chinthapally et al. (1993) ekstrak propolis dengan etanol mempunyai efek sinergis terhadap aktivitas anti-staphylococcus pada antibiotik streptomisin dan siklosiklin, dan memberikan sedikit efek tersebut pada antibiotik lainnya. Propolis lebah memiliki efek antimikroba dan anti-inflamatori, dan secara in vitro telah menunjukkan efektivitas dalam penghambatan Helicobater pylori pada penyakit gastroduodenal (McLoughlin et al. 2004).
Efek sinergis dari berbagai kandungan fitokimia ekstrak propolis masing-masing memiliki mekanisme aktivitas antibakteri yang berbeda-beda. Berdasarkan penelitian Bankova et al.(2006), diperoleh 15 senyawa murni dari golongan flavonoid, triterpenoid, dan minyak atsiri yang merupakan konstituen bioaktif propolis merah dari Brazil yang berperan dalam aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Tabel 1 Hasil analisis fitokimia ekstrak
propolis (Lasmayanti 2007)
Senyawa Ekstrak propolis pandeglang Alkaloid + Flavonoid + Minyak atsiri + Triterpenoid + Saponin + Tanin + Keterangan: (+) = ada Enterobacter sakazakii
E. sakazakii termasuk dalam keluarga Enterobacteriaceae, ciri-cirinya batang Gram negatif, tidak membentuk spora, anaerob fakultatif, dan motil dengan flagela peritrikus (Osaili et al.2007).Bakteri ini pada awalnya digambarkan sebagai bakteri Enterobacter
3
cloacae berpigmen kuning (Gambar 1). Kemudian pada tahun 1980, bakteri ini diperkenalkan sebagai spesies baru, berdasarkan produksi asam dari D-sorbitol dan dinamakan sebagai penghormatan kepada penemunya, seorang ahli mikrobiologi Jepang Riichi Sakazaki. Bakteri ini telah terdeteksi pada berbagai jenis makanan lain, tetapi hanya susu formula bubuk yang sudah diketahui memiliki hubungan dengan timbulnya beberapa penyakit. Adanya kasus nekrosis usus dan radang selaput otak yang disebabkan oleh E. sakazakii telah dilaporkan terjadi di unit perawatan intensif bayi yang baru lahir karena kontaminasi dan ketahanan E. sakazakii dalam susu bubuk formula dan perlengkapan penyajian makanan (Simmons et al.1989; van Acker et al.2001).
E. sakazakii memiliki sifat patogen oportunistik, yaitu organisme yang dapat menyebabkan penyakit hanya pada kondisi tertentu. E. sakazakii merupakan kontaminan pada susu formula bubuk yang dapat menyebabkan penyakit langka bakterimia, necrotizing enterocolitis (NEC), dan radang selaput otak setelah tertelan (Muytjens et al. 1983; Iversen & Forsthye 2003; Estuningsih et al. 2007). Bayi-bayi yang beresiko tinggi terhadap infeksi E. sakazakii adalah bayi prematur, lahir dengan berat badan rendah, dan berusia kurang dari 28 hari. Dosis infektif berkisar dari 103 sampai 108 sel (Osaili et al. 2007). Komisi Internasional Spesifikasi Mikrobiologis dalam Makanan (2002) mengkategorikan bakteri ini sebagai ‘sangat berbahaya untuk populasi terbatas, membahayakan nyawa atau substansi kronis lanjut dalam jangka panjang. Pada akhirnya, bakteri ini menjadi sama berbahayanya dengan patogen dalam makanan lainnya yang lebih dikenal seperti Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Clostridium botulinum, dan Cryptosporidium parvum (Forsythe 2005).
Berdasarkan Forsythe (2003) bakteri ini bisa bertahan pada kondisi kering dalam susu bubuk formula selama 2 tahun. Sifat-sifat bakteri ini yang bisa meningkatkan patogenisitasnya antara lain, sifat termostabil, menghasilkan biofilm dan enterotoksin. Kemudian dari sifat virulensi, telah diteliti bahwa bakteri ini dapat menghasilkan enterotoksin, adhesi pada sel otak, dan pengaruh endotoksin yang dihasilkan meningkatkan translokasi bakteri-bakteri usus dan E. sakazakii pada tikus neonetus (Mange et al. 2006; Pagotto et al. 2003; Townsend et al. 2003).
Gambar 1 Koloni E. sakazakii (Forsythe 2005).
Antimikrob
Antimikrob merupakan senyawa pembasmi mikrob khususnya mikrob yang merugikan manusia, bakteri patogen maupun bakteri pembusuk (Ganiswarna et al. 1995). Bahan antimikrob merupakan salah satu penghambatan mikroorganisme secara kimia yang mengganggu pertumbuhan dan metabolisme mikrob. Antimikrob yang digunakan harus memiliki tingkat toksisitas selektif setinggi mungkin. Toksisitas selektif berarti obat tersebut haruslah bersifat sangat toksik pada mikroba patogen namun relatif aman bagi inang. Berdasarkan toksisitas selektif, terdapat dua jenis antimikrob, yaitu antimikrob bersifat bakterisidal dan bakteriostatik. Jika suatu antibakteri mampu membunuh bakteri patogen maka antibakteri tersebut memiliki aktivitas bakterisidal. Jika antibakteri hanya mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen maka antibakteri tersebut memiliki aktivitas bakteriostatik. Aktivitas antimikrob tertentu dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisidal jika konsentrasi antimikrobnya ditingkatkan. Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi penghambatan mikrob oleh antimikrob. Faktor tersebut adalah konsentrasi zat antimikrob, jumlah mikroorganisme, spesies mikroorganisme, temperatur, dan adanya bahan organik (Pelczar & Chan 1988).
Antimikrob dapat dikelompokkan menjadi lima berdasarkan mekanisme kerjanya. Mekanisme tersebut adalah menghambat pembentukan dinding sel (kerusakan dinding sel), merubah permeabilitas membran sel, merubah protein dan asam nukleat, menghambat sintesis protein dan asam nukleat, dan menghambat kerja enzim (Pelczar & Chan 1988). Salah satu contoh penggunaan antimikrob adalah antibiotik. Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan atau diturunkan oleh organisme hidup termasuk struktur analognya yang dibuat secara sintetik, yang dalam kadar
4
rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono & Soekardjo 1995).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker, rotavapor, crock borrer diameter 5 mm, laminar air flow cabinet, inkubator, pipet mikro, neraca analitik, batang gelas penyebar, vorteks, jangka sorong, mortar, jarum ose, cawan petri, dan beberapa alat gelas lainnya.
Bahan-bahan yang digunakan adalah propolis kasar Trigona spp. dari daerah Pandeglang (Propolis Pandeglang, PrP), propolis komersil (Propolis X), tiga isolat bakteri, E. sakazakii IB-19b (enterotoksin negatif), E. sakazakii IB-29a (enterotoksin positif), dan E. sakazakii ATCC 35217 (E. sakazakii American Type Culture Collection) dari kultur koleksi Fakultas Kedokteran Hewan, media Tryptone Soy Broth (TSB), media Tryptone Soy Agar (TSA), media Müeller-Hinton Agar (MHA), standar McFarland, etanol 70%, propilen glikol teknis, ampisilin 500 mg, dan akuades.
Bakteri yang berasal dari kultur primer diambil sebanyak satu ose bakteri, diinokulasikan ke media TSB yang baru, lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam dalam inkubator. Bakteri dari kultur TSB digores ke cawan TSA sebanyak satu ose, lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam dalam inkubator untuk memperoleh koloni murni. Kultur regenerasi ini akan digunakan sebagai stok kerja yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri. Komposisi media TSA dalam 1 liter akuades adalah tripton 15.0 g, soya pepton 5.0 g, NaCl 5.0 g, dan agar 15.0 g. Komposisi media TSB dalam 1 liter akuades adalah tripton 17.0 g, soya pepton 3.0 g, dekstrosa 2.5 g, NaCl 5.0 g, dan K
Metode Ekstraksi Propolis
Propolis diekstraksi menggunakan metode Matienzo dan Lamorena (2004). Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan pelarut alkohol 70%. Sebanyak 150 g propolis kasar Trigona spp. direndam dengan 500 mL etanol 70%. Suspensi tersebut ditutup dan dikocok dengan shaker di ruang gelap selama satu minggu. Setelah itu, suspensi tersebut disaring, filtratnya diambil dan residunya dimaserasi kembali. Selanjutnya filtrat tersebut diambil setiap hari selama tujuh hari. Setelah tujuh hari, filtrat terakhir yang dihasilkan berwarna jernih dan teknik maserasi diakhiri.
Setelah seluruh filtrat hasil maserasi terkumpul, filtrat tersebut dipekatkan dengan menggunakan rotavapor pada temperatur 40 °C. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang untuk mendapatkan nilai rendemennya, kemudian ekstrak tersebut dilarutkan dengan propilen glikol dengan perbandingan propolis:propilen glikol adalah 1:1, sebagai ekstrak propolis 100%.
Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri diuji menggunakan metode difusi sumur agar yang sudah dimodifikasi (Rojas et al. 2006). Pembanding yang digunakan adalah tablet ampisilin 500 mg dengan konsentrasi 10 mg/mL (kontrol positif), propolis merek X, akuades (kontrol negatif), dan kontrol pelarut propilen glikol.
Pembuatan Stok Kerja Bakteri
2HPO4 2.5 g.
Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur agar. Bakteri dari stok kerja sebanyak satu ose dipindahkan ke dalam 25 mL TSB steril dan diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam dalam inkubator. Kemudian kultur bakteri disentrifus pada kecepatan 5000 g selama 15 menit dan tiga kali pencucian dengan akuades steril. Pelet bakteri disuspensikan dengan akuades steril, lalu disesuaikan dengan standar McFarland 1 (3×108 CFU/mL). Sebanyak 50 µL suspensi bakteri disebar ke agar Müeller-Hinton. Kemudian agar dilubangi dengan diameter ± 5 mm menggunakan crock borrer steril. Ekstrak propolis dan kontrol pembanding sebanyak 25 µL dimasukkan ke dalam lubang tersebut lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam. Zona bening yang terlihat di sekeliling lubang diukur dalam satuan mm, dan menandakan sampel memiliki aktivitas antibakteri.
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM)
Penentuan nilai KHTM dilakukan setelah diketahui bahwa ekstrak propolis memiliki aktivitas antibakteri. Tahap pertama, yaitu
4
rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono & Soekardjo 1995).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker, rotavapor, crock borrer diameter 5 mm, laminar air flow cabinet, inkubator, pipet mikro, neraca analitik, batang gelas penyebar, vorteks, jangka sorong, mortar, jarum ose, cawan petri, dan beberapa alat gelas lainnya.
Bahan-bahan yang digunakan adalah propolis kasar Trigona spp. dari daerah Pandeglang (Propolis Pandeglang, PrP), propolis komersil (Propolis X), tiga isolat bakteri, E. sakazakii IB-19b (enterotoksin negatif), E. sakazakii IB-29a (enterotoksin positif), dan E. sakazakii ATCC 35217 (E. sakazakii American Type Culture Collection) dari kultur koleksi Fakultas Kedokteran Hewan, media Tryptone Soy Broth (TSB), media Tryptone Soy Agar (TSA), media Müeller-Hinton Agar (MHA), standar McFarland, etanol 70%, propilen glikol teknis, ampisilin 500 mg, dan akuades.
Bakteri yang berasal dari kultur primer diambil sebanyak satu ose bakteri, diinokulasikan ke media TSB yang baru, lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam dalam inkubator. Bakteri dari kultur TSB digores ke cawan TSA sebanyak satu ose, lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam dalam inkubator untuk memperoleh koloni murni. Kultur regenerasi ini akan digunakan sebagai stok kerja yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri. Komposisi media TSA dalam 1 liter akuades adalah tripton 15.0 g, soya pepton 5.0 g, NaCl 5.0 g, dan agar 15.0 g. Komposisi media TSB dalam 1 liter akuades adalah tripton 17.0 g, soya pepton 3.0 g, dekstrosa 2.5 g, NaCl 5.0 g, dan K
Metode Ekstraksi Propolis
Propolis diekstraksi menggunakan metode Matienzo dan Lamorena (2004). Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan pelarut alkohol 70%. Sebanyak 150 g propolis kasar Trigona spp. direndam dengan 500 mL etanol 70%. Suspensi tersebut ditutup dan dikocok dengan shaker di ruang gelap selama satu minggu. Setelah itu, suspensi tersebut disaring, filtratnya diambil dan residunya dimaserasi kembali. Selanjutnya filtrat tersebut diambil setiap hari selama tujuh hari. Setelah tujuh hari, filtrat terakhir yang dihasilkan berwarna jernih dan teknik maserasi diakhiri.
Setelah seluruh filtrat hasil maserasi terkumpul, filtrat tersebut dipekatkan dengan menggunakan rotavapor pada temperatur 40 °C. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang untuk mendapatkan nilai rendemennya, kemudian ekstrak tersebut dilarutkan dengan propilen glikol dengan perbandingan propolis:propilen glikol adalah 1:1, sebagai ekstrak propolis 100%.
Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri diuji menggunakan metode difusi sumur agar yang sudah dimodifikasi (Rojas et al. 2006). Pembanding yang digunakan adalah tablet ampisilin 500 mg dengan konsentrasi 10 mg/mL (kontrol positif), propolis merek X, akuades (kontrol negatif), dan kontrol pelarut propilen glikol.
Pembuatan Stok Kerja Bakteri
2HPO4 2.5 g.
Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur agar. Bakteri dari stok kerja sebanyak satu ose dipindahkan ke dalam 25 mL TSB steril dan diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam dalam inkubator. Kemudian kultur bakteri disentrifus pada kecepatan 5000 g selama 15 menit dan tiga kali pencucian dengan akuades steril. Pelet bakteri disuspensikan dengan akuades steril, lalu disesuaikan dengan standar McFarland 1 (3×108 CFU/mL). Sebanyak 50 µL suspensi bakteri disebar ke agar Müeller-Hinton. Kemudian agar dilubangi dengan diameter ± 5 mm menggunakan crock borrer steril. Ekstrak propolis dan kontrol pembanding sebanyak 25 µL dimasukkan ke dalam lubang tersebut lalu diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam. Zona bening yang terlihat di sekeliling lubang diukur dalam satuan mm, dan menandakan sampel memiliki aktivitas antibakteri.
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM)
Penentuan nilai KHTM dilakukan setelah diketahui bahwa ekstrak propolis memiliki aktivitas antibakteri. Tahap pertama, yaitu
5
pengenceran propolis dengan akuades sehingga didapatkan beberapa konsentrasi (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, dan 0,78%). Masing-masing konsentrasi sebanyak 25 µL diuji dengan memasukkan ekstrak propolis ke lubang media agar Müeller-Hinton yang telah diinokulasi dengan bakteri uji, diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam. Aktivitas antibakterinya diperoleh dengan mengukur daerah bening di sekeliling lubang sampel dalam satuan mm.
Analisis Statistik
Analisis statistik yang digunakan dalam pengolahan data adalah rancangan percobaan satu faktor dalam Rancangan Acak Lengkap. Berikut ini merupakan model rancangannya (Mattjik dan Sumertajaya 2002):
Yij = μ + τi + εij
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
μ = Pengaruh rataan umum
τ = Pengaruh perlakuan ke-i
ε = pengaruh acak pada perlakuan ke-i ulangan ke-j
Rancangan percobaan ini digunakan pada penentuan nilai KHTM. Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (Analysis of Variance) pada taraf α 0,05 menggunakan program piranti lunak SPSS 11. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen Ekstrak Propolis
Rendemen ekstrak propolis yang diperoleh (17,76%) pada penelitian ini lebih besar dari yang diperoleh pada penelitian Anggraini (2006) dan Lasmayanti (2007), yaitu sebesar 8,25% dan 8,20% berturut-turut. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini, serta penelitian Anggraini (2006) dan Lasmayanti (2007) adalah etanol 70%. Etanol merupakan pelarut yang memiliki sifat semipolar sehingga komponen aktif dengan kepolaran yang beragam dapat terekstraksi lebih sempurna. Keuntungan etanol sebagai pelarut adalah memiliki titik didih yang rendah, sehingga memudahkan pemisahannya dengan komponen aktif dalam propolis, serta mengurangi jumlahnya dalam ekstrak.
Menurut Harborne (1987), golongan senyawa flavonoid dapat diekstraksi dengan baik menggunakan etanol 70%. Flavonoid merupakan senyawa aktif dan terpenting dalam ekstrak propolis (Chintapally 2003).
Ekstraksi propolis dengan maserasi menggunakan etanol 70% menghasilkan rendemen 20% lebih tinggi daripada menggunakan etanol absolut. Oleh karena itu, penggunaan etanol 70% dapat meningkatkan jumlah senyawa aktif yang terekstrak. Selain itu, karena menggunakan propolis kasar yang merupakan sarang propolis, maka ada komponen-komponen penyusun lain yang dapat terekstrak dari sarang lebah, terutama malam (waxe) atau lilin. Lilin lebah terutama terdiri atas monoester sederhana asam lemak dan alkohol dengan rantai karbon jenuh yang panjang (Hart et al. 2003). Maka, penggunaan etanol 70% juga berdasarkan bahwa lilin tidak terekstrak karena tidak larut