METODE PENELITIAN
E. Langkah Kerja 1. Pengambilan Sampel 1.Pengambilan Sampel
4. Identifikasi Bactrocera sp secara molekuler
Identifikasi molekuler ketiga spesies Bactrocera dilakukan di Laboratorium Virologi Unniversitas Gadjah Mada. Analisis ini dilakukan melalui beberapa langkah yaitu Isolasi DNA, elektoforesis DNA, reaksi berantai PCR, kemudian dielektoforesis kembali, dan yang terakhir metode sekuensing. Berikut ini dijelaskan langkah-langkah analisis molekuler Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae sebagai berikut.
a. Isolasi DNA
Isolasi DNA lalat buah menggunakan sampel yang berupa imago dan larva. Masing-masing jaringan sampel dilakukan isolasi DNA genom Bactrocera sp
berdasarkan protokol genomic DNA mini kit (tissue) yang tetera pada langkah sebagai berikut:
1) Sampel imago Bactrocera sp diambil jaringan toraknya menggunakan pinset. Jika menggunakan sampel larva, maka diambil larvanya.
2) Sampel ditimbang 30 mg dan dimasukan dalam tube 3) Sampel dihaluskan menggunakan micropestle
4) Pada proses penghalusan 200 µl GT Buffer ditambahkan pada sampel kemudian dihaluskan kembali.
5) Sampel yang telah diahaluskan ditambahkan 20 µl Proteinase K dan dihomogenkan menggunakan vortex.
6) Sampel diinkubasikan pada suhu 60°C selama 30 menit, selama inkubasi tube di bolak-balik setiap 5 menit
7) Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 200 µl GBT Buffer dan dihomogenkan menggunakan vortex selama 5 detik.
8) Sampel diinkubasikan kembali pada suhu 60°C selama 20 menit, selama diinkubasi tube di bolak-balik setiap 5 menit, pada proses ini Elution Buffer dipanaskan (100 µl per sampel) pada 60°C.
9) Sampel disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit
10) Sampel yang telah disentrifugasi diambil supernatannya sebanyak 1,5 ml dan dipindahkan pada tube baru.
11) Supernatan ditambahkan ethanol absolute sebanyak 200 µl dan di shaker selama 10 detik
12) GD kolom ditempatkan pada tube 2 ml
13) Cairan yang ada pada tube 1,5 ml dipindakan ke GD kolom, setelah itu disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit
14) GD kolom yang telah disentrifugasi dipindahakn pada tube 2 ml yang baru 15) W1 Buffer sebanyak 400 ul ditambahkan pada GD kolom
16) GD kolom disentrifugasi 14.000-16.000 selama 30 detik, kemudian dipindahkan tube 2 ml yang baru
17) 600 µl Wash Buffer ditambahkan pada GD kolom dan disentrifuse kembali pada 14.000-16.000 selama 30 detik
18) GD kolom dipindahkan pada tube 2 ml yang baru dan disentrifuse 14.000-16.000 selama 3 menit
19) GD kolom dipindahkan pada tube 1,5 ml
20) 100 µl Elution Buffer ditambahkan pada bagian tengah tube
21) GD kolom diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi 14.000-16.000 selama 30 detik
22) GD kolom yang telah disentrifugasi dibuang, sedangkan tube pada suhu -20°C/-40°C.
Keberhasilan isolasi DNA ketiga sampel Bactrocera.sp, B. cucurbitae dan
B. papayae dapat dilihat berdasarkan fragmen DNA yang bermigrasi pada gel agarose.
b. Elektroforesis Gel agarose
Visualisasi DNA dilakukan dengan elektroforesis pada bak elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5% gel agarosa. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam bufer 1X TBE dan dipanaskan sampai tercampur homogen dan larutan menjadi jernih. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam bak elektroforesis yang sebelumnya telah dipasang sisir cetakan dan ditunggu sampai menjadi keras (15-20 menit). Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 50 volt (lama waktu running tergantung pada konsentrasi gel dan voltase). Setelah elektroforesis, gel agarosa direndam dalam larutan Etbr selama 5 detik kemudian direndam dalam aquades selama 15 menit untuk mencuci atau meminimalkan kontaminan Etbr. Setelah itu DNA divisualisasi menggunakan UV transiluminator. Hasil visualisasi DNA genom dilihat berdasarkan keberadaan pita DNA genom sampel. Hasil isolasi yang baik dapat dilanjutkan pada metode selanjutnya yaitu amplifikasi PCR.
c. Amplifikasi PCR
Fragmen Cox I yang panjangnya 500 bp diamplifikasi dengan primer
forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Sekuen primer oligonukleotida dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi PCR Nama Primer Sekuen
(CO1-F) MtD7 5’ATT AGG AGC HCC HGA YAT AGC ATT 3’
Amplifikasi PCR menggunakan master mix kappa dengan total cocktail 12,5 ul dalam setengah kali reaksi yang dijelaskan pada Tabel 4.
Tabel 4. Cocktail yang digunakan untuk amplifikasi PCR
No Bahan vol x reaksi
1 5x Kappa ekstrak buffer 2,5 ul
2 Mgcl2 0,875 ul 3 ddH20 6,375 ul 4 dNtp 0,375 ul 5 DNA Polimerase 0,125 ul 6 Primer Forward 0,625 ul 7 Primer Revers 0,625 ul Total 12,5 ul
Tabung PCR yang sudah berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam mesin Termal cycle yang sudah diprogram untuk 35 siklus pada kondisi yang disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Rangkaian amplifikasi daerah sitokrom oksidase I DNA mitokondria
Tahapan Proses Suhu Waktu
I Denaturasi 94 3 menit
Denaturasi 94 15 detik
II Annealing 53 15 detik
III Extension 70 1 menit
Extention 72 1 menit
Tiga mikroliter sampel dari produk PCR dan dua mikroliter loading dye
dirunning pada gel agarosa 1,5% untuk menentukan keberadaan dan ukuran DNA yang diamplifikasi.
d. Elektroforesis Gel Agarose
Metode elektroforesis gel agarose digunakan untuk melihat keberhasilan amplifikasi PCR gen sitokrom oksidase I menggunakan primer forward dan
reverse berdasarkan laju migrasi fragmen DNA dalam gel agarose. DNA divisualisasi menggunakan elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5% gel agarosa. Setelah elektroforesis, DNA divisualisasi di dalam UV transiluminator. Hasil yang baik pada amplifikasi PCR dapat dilanjutkan pada langkah selanjutnya yaitu sekuensing untuk melihat runutan nukleotida gen sitokrom oksidase I pada Bactrocerasp, B. cucurbitae dan B. papayae.
e. Sekuensing
Produk PCR yang baik dilanjutkan dengan tahap sekuensing. Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida pada daerah cox1. Sekuensing dilakukan pada Lembaga Genetica science diSingapura.
f. Analisis Data
Data hasil sekuensing berupa ABI file dari Bactrocera sp, Bactrocera papayae dan Bactrocera cucurbitae dilakukan pengeditan secara manual menggunakan program BioEdit Versi 7.0.9. Hasil pengeditan sekuen dimasukkan dalam BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI untuk melihat homologi dengan spesies terdekat. Pohon filogeni diperoleh dengan menggunakan metode neighbor-joining, dimana kalkulasi matrik jarak genetik dengan model Kimura-2 parameter yang diimplementasikan pada pairwise distance calculation dengan Bootstrap 1000 ulangan dalam program MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) software Versi 6.0 (Tamura et al.
2013). Sekuen sampel yang dibandingkan dengan beberapa koleksi GenBank
Bactrocera sp yang dianalisis oleh Zhang et al. 2010. Bactrocera sp yang digunakan dalam analisis ini berasal dari daerah yang berbeda-beda yang disajikan pada Tabel 6 di bawah ini.
Tabel 6. Daftar spesies yang dianalisis.
Nama spesies Cox I Daerah asal
1 Anastrapha ludens AB192462 Amerika
2 B.caudata GQ458048 Asia 3 B.diaphora GQ458043 Asia 4 B. papaya DQ917578 Asia 5 B.philippinensis DQ995281 Asia 6 B.scutellata GQ458046 Asia 7 Bactrocerasp* Sampel 8 B. cucurbitae* Sampel 9 B. papayae* Sampel 10 B. cucurbitae_Prancis JX162208 Prancis
11 Bactrocera calumniate GQ154808 Asia
12 B. cucurbitae DQ116244 Asia
13 B.cucurbitae DQ006875.1 Swiss
Ket:* merupakan sampel dalam penelitian ini.
30 BAB IV