(POLYMERASE CHAIN REACTION) DAN ANALISIS
URUTAN BASA GEN 16S rRNA
ABSTRAK
FAO/WHO (2002) mensyaratkan identifikasi yang akurat pada tingkatan genus, spesies bahkan galur bakteri asam laktat yang diklaim sebagai probiotik. Selain identifikasi secara fenotipik atau biokimiawi, sangat diperlukan identifikasi secara molekuler yang secara akurat mampu menentukan spesies dan galur BAL probiotik. Gen 16S rRNA paling akurat untuk menentukan taksonomi suatu bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan genus, spesies dan galur BAL asal daging sapi lokal melalui identifikasi secara molekuler dengan PCR
(Polymerase Chain Reaction) dan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Primer
yang digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA adalah primer universal 9F (5’-gagtttgatcctggctcag -3’) dan 1541R (5’-aaggaggtgatccagcc -3’), sedangkan untuk analisis urutan basa gen 16S rRNA digunakan 5 primer yaitu 2 primer universal 785F (5’-ggattagataccctggtagtc-3’) dan 802R (5’-taccagggtatctaatcc-3’), dan 3 primer yang didesain sendiri yaitu Primer 1R (5’-gggcatgatgatttgacgtc-3’), primer 2F (5’-gtgagactgccggtgacaaa-3’) dan primer 3R (5’-atcagacttaaaaaaccgcc- 3’). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dapat diisolasi secara spesifik (pita tunggal) dengan PCR menggunakan primer dan kondisi yang dioptimasi. Urutan basa gen 16S rRNA dapat dibaca dengan baik pada daerah V6- V9 (600 pasang basa). Sebelas isolat yaitu 1C3, 1B1, 2D1, 1D1, 1A1, 1C1, 2C12, 1A5, 1C4, 2B1 dan 2B2 merupakan spesies Lactobacillus plantarum. Isolat 2A2 dan 1A6 termasuk dalam spesies Pediococcus pentosaceous. Isolat 2D2 adalah
Enterococcus faecium. Enam isolat BAL lainnya yaitu 1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4
dan 1A32 sangat dekat kekerabatannya dengan Lactobacillus acidophilus.
PENDAHULUAN
Identifikasi bakteri asam laktat (BAL) sangat diperlukan untuk mengetahui genus, spesies bahkan galurnya. Menurut FAO/WHO (2002), untuk dapat dikatakan sebagai probiotik, maka BAL harus diketahui spesies bahkan sampai galur untuk klaim sifat fungsional tertentu. Identifikasi BAL semula didasarkan pada metode fenotipik yaitu morfologi sel, analisis produk fermentasi, aktivitas enzim yang dimiliki serta kemampuan memfermentasi beberapa substrat karbohidrat. Metode tersebut mempunyai kelemahan utama yaitu terkadang salah
atau tidak dapat membedakan spesies dan galur bakteri. Selain itu juga reprodusibilitasnya rendah karena sangat tergantung pada kondisi kultur di laboratorium yang berbeda. Analisis asam nukleat digunakan untuk mengatasi kelemahan metode fenotipik. Pendekatan genotipik mampu memberikan informasi identifikasi BAL yang akurat dengan reprodusibilitas tinggi (Tannock 1999; Salminen et al. 2005; Lee 2009).
Pada tahun 1980-an, standar baru identifikasi bakteri mulai dikembangkan oleh Woose. Hubungan kekerabatan filogenetik diantara bakteri dapat ditentukan oleh kode genetik pada daerah gen yang disebut dengan unit 5S, 16S dan 23S rRNA dan daerah diantaranya. Gen 16S rRNA paling akurat untuk menentukan taksonomi suatu bakteri dibandingkan dengan gen 5S dan 23S. Panjang urutan basa gen 16S rRNA adalah 1500-1550 pasang basa. Adanya mutasi ataupun perbedaan basa pada urutan basa tersebut dijadikan sebagai penentu identifikasi suatu bakteri pada tingkat genus, spesies bahkan sampai galur (Tannock 1999, Klein et al. 1998, Clarridge 2004). Perbandingan urutan basa gen 16S rRNA diantara genus Lactobacillus menunjukkan bahwa urutan basa tersebut mengandung informasi spesifik spesies. Untuk tujuan identifikasi, diperlukan amplifikasi dengan menggunakan PCR dan analisis urutan basa sedikitnya 500 pasang basa (Petrosino et al 2009). Urutan basa antar isolat Lactobacillus
dinyatakan homolog jika nilai kemiripannya (similaritasnya) minimal 94% (Weisburg et al. 1991, Tannock 1999). Gen 16S rRNA terbagi menjadi sembilan bagian yang disebut dengan daerah V1 sampai V9. Disamping daerah V1-V3, daerah V6-V9 merupakan daerah divergen yang yang menentukan heterogenitas atau adanya mutasi gen yang mengarah pada perbedaan spesies suatu bakteri (Cai
et al. 2003; Petrosino et al. 2009).
Identifikasi BAL berdasarkan analisis urutan basa (sequencing) gen 16S rRNA merupakan metode utama untuk menentukan spesies dan galur baru. Balcazar et al (2007) melakukan identifikasi BAL yang diisolasi dari isi pencernaan ikan salmon menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Hasilnya menunjukkan bahwa dengan mengamplifikasi dan melakukan analisis urutan basa terhadap 500 pasang basa yang menyandi gen 16S rRNA dapat diketahui spesies dan galur BAL yang diisolasi dengan tepat. Falsen et al (1999)
menemukan spesies BAL baru yaitu Lactobacillus iners sp.nov. yang diisolasi dari spesimen manusia dengan menggunakan metode analisis urutan basa gen 16S rRNA. Identifikasi Lactobacillus salivarius juga berhasil dilakukan dengan menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA oleh Woo et al. (2002). Diversitas Lactobacillus spp dan genus BAL lainnya yang diisolasi dari usus manusia juga berhasil diketahui dengan amplifikasi gen 16S rRNA oleh Heilig et al. (2002). Spesies baru Lactobacillus tucceti sp. nov berhasil diisolasi dari sosis dan diidentifikasi dengan analisis urutan basa 16S rRNA (Chenoll et al. 2006). Beberapa peneliti lainnya yang menggunakan metode analisis urutan basa gen 16S rRNA untuk mengidentifikasi BAL yang diisolasi dari alam antara lain Matamoros et al (2010), Tamang et al. (2008), Lee et al. (2007), Moreira et al.
(2005), Dickson et al. (2005), serta Anukam et al. (2005).
Isolat indigenus BAL yang diisolasi dari daging sapi lokal (Arief et al. 2007) telah diidentifikasi secara morfologi dan biokimiawi. Karakteristik awal BAL tersebut secara morfologi berbeda diantaranya berbentuk koki (bulat), basil (batang) dalam rantai pendek-pendek, koloni melengkung sebagian tunggal dan ada yang berkelompok, Gram (+), katalase negatif dan non motil. Selain itu sifat biokimiawinya juga telah diketahui di antaranya pertumbuhan pada suhu berbeda, pola homo atau heterofermentatif serta kemampuan fermentasi terhadap 12 jenis gula sederhana. Namun demikian identifikasi tersebut belum cukup untuk menentukan spesies dari isolat-isolat tersebut. Oleh karenanya sangat diperlukan identifikasi secara molekuler terutama analisis urutan basa gen 16S rRNA yang merupakan daerah kunci penentu identifikasi BAL.
Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan genus, spesies dan galur BAL asal daging sapi lokal melalui identifikasi secara molekuler dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dan analisis urutan basa (sequencing) gen 16S rRNA. Selain itu juga disusun pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan kekerabatan diantara isolat tersebut dengan isolat BAL internasional yang terdeposit di GenBank.
BAHAN DAN METODE
Pemilihan Isolat
Isolat BAL yang digunakan pada penelitian ini adalah 20 isolat, dalam kondisi freeze dried selama perjalanan Indonesia – Jepang, karena penelitian ini dilakukan di Laboratory of Applied Microbiology, International Center for
Biotechnology, Osaka University, Jepang. Penyegaran kultur dilakukan dengan
menggunakan media MRS broth (Oxoid). Dua puluh isolat tersebut telah diketahui morfologi dan identifikasi sederhana secara biokimiawi (Tabel 5.1 dan 5.2).
Tabel 5.1 Morfologi 20 isolat BAL asal daging sapi lokal (Arief et al. 2007)
No Kode isolat Bentuk Pertumbuhan di suhu Pertumbuhan di NaCl 6.5% Menghasilkan NH3 dari arginin Menghasilkan gas dari glukosa 10°C 45°C 1 1A2 Batang + + + - - 2 1A5 Batang + + + - - 3 2B1 Batang + + + - - 4 2A2 Coccus + + + - - 5 1A32 Batang + + + - - 6 1B1 Batang + + + - - 7 1A1 Batang + + + - - 8 1A6 Coccus + + + - - 9 2B2 Batang + + + - - 10 2B3 Batang + + + - - 11 2B4 Batang + + + - - 12 1C1 Batang + + + - - 13 1C3 Batang + + + - - 14 1C4 Batang + + + - - 15 1C6 Batang + + + - - 16 2C2 Batang + + + - - 17 2C12 Batang + + + - - 18 1D1 Batang + + + - - 19 2D1 Batang + + + - - 20 2D2 Coccus + + + + -
(+) = dapat tumbuh baik, (-) = tidak dapat tumbuh baik atau tidak menghasilkan NH3 atau gas Pemilihan 20 isolat berdasarkan pertimbangan bahwa 10 isolat terpilih adalah galur BAL mempunyai sifat sebagai kandidat probiotik berdasarkan penelitian sebelumnya (2B4, 1B1, 1A5, 2C2, 2D1, 2B2, 1C4, 2B1, 1A32 dan 2C12). Sepuluh isolat lainnya dipilih sesuai kemiripannya dengan 10 isolat terseleksi awal berdasarkan kemampuan fermentasi terhadap gula sederhana (12
jenis gula). Jika kemampuan fermentasinya sama dengan 10 isolat tersebut, maka tidak terpilih untuk dilakukan identifikasi secara molekuler berdasarkan dugaan bahwa selain isolat tersebut bukan isolat unggul probiotik juga kemungkinan satu spesies dengan 10 isolat terpilih awal (Tabel 5.2).
Tabel 5.2 Pemilihan isolat 20 BAL dari 28 isolat BAL untuk identifikasi molekuler berdasarkan kemampuan fermentasi 12 jenis gula
No Kode Kemampuan memfermentasi gula Pemilihan
Isolat ara gal glu lak mal man raf rham tre sorb suk xyl
1 1B2 + + + + + - + - - - + +
2 2B4 + + + + + - + - - - + + Dipilih 2B4
3 1A2 - + + + + - + - - - + -
4 1A32 + + + + + - + - - - + -
5 1A4 - + + + + - + - - - + -
6 1A5 - + + + + - + - - - + - Dipilih 1A5
7 1A6 + + + + + - + - - - + - Dipilih 1A6
8 2A3 + + + + + - + - - - + - 9 1D2 + + + + + - + - - - + - 10 2A1 + + + + + - + + + - + + 11 2C12 + + + + + - + + + - + + Dipilih 2C12 12 2A2 - + + + + - + - - - + - 13 1B1 + + + + + + d + + d + d 14 1A1 + d + d + - + d + d + d 15 2B1 + + + + + - + - - - + + 16 2B2 - + + + + - + - - - + + Dipilih 2B2 17 1D3 - + + + + - + - - - + + 18 2B3 - + + + + - + - - - + - 19 1C1 - + + + + - + - - - + - 20 1C3 + - + + + - + - - - + + 21 1C4 + + + + + - + - - - + - 22 1C6 - + + + + - + - - - + - 23 2C2 - + + + + - + d d d + d 24 2D1 + + + - + - + - - - + + 25 2D2 - - - - d - - - d 26 1D1 + + + + + - + - - - + - Dipilih 1D1 27 2D41 + + + + + - + - - - + - 28 2D42 + + + + + - + - - - + -
(+) = dapat memfermentasi ; (-) = tidak dapat memfermentasi, (d) = dubius
ara = arabinosa, gal = galaktosa, glu= glukosa, lak = laktosa, mal = maltosa, man = manitol, raf = rafinosa, rham = rhamnosa, tre = trehalosa, sorb = sorbitol, suk = sukrosa, xyl = xilosa
Sumber : Arief et al. (2007)
Metode
Ekstrasi genom
Ekstraksi genom dilakukan dengan menggunakan kit dari Promega yaitu
Wizard ® SV Genomic Purification System no katalog A2360. Prosedur
ekstraksinya dilakukan sesuai protokol perusahaan sebagai berikut : Kultur disegarkan pada media broth (cair) dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 13.000 x g selama 1 menit, selanjutnya supernatan dibuang. Sel sebanyak minimal 1 x 104 sel, maksimal 5 x 106 sel atau sekitar 200 mg diambil untuk sekali purifikasi/ekstraksi. Sel dicuci dengan menggunakan PBS (Phosphat Buffer Saline) 1x, kemudian ditambahkan 150 µ l Wizard ® SV lysis buffer untuk mencuci sel dan dihasilkan lysate. Lalu lysate
dicampur dengan memipet secara perlahan. Jika lysate tidak segera digunakan maka dapat disimpan pada suhu -70°C.
Tahapan ekstraksi genom dilakukan dengan teknik mikrosentrifus. Pada setiap lysat untuk purifikasi, disiapkan seperangkat Wizard ® SV minicoloumn
yang terdiri dari Wizard ® SV minicoloumn dan tabung koleksi (collection tube). Sebelumnya, diberikan label pada collection tube dan seperangkat Wizard ® SV minicolom diletakkan pada rak tabung mikrosentrifuse. Semua sampel lysate
dipindahkan ke Wizard SV minicolom. Lalu Wizard SV minicolom yang berisi sampel disentrifus dengan kecepatan 13.000 x g selama 3 menit. Supernatan yang tertinggal di tabung koleksi dibuang. Jika masih ada lysate yang tertinggal di kolom, disentrifus kembali dengan kecepatan 13.000 x g selama 1 menit. Selanjutnya dipindahkan Wizard SV minicolom dari tabung koleksi dan cairan dalam tabung koleksi dibuang dan ditempatkan lagi Wizard SV minicolom pada tabung koleksi. Setelah itu ditambahkan 650 µ l Wizard SV wash solution (yang sudah ditambah dengan etanol 95%) ke Wizard SV minicolom, dan disentrifus 13.000 x g selama 1 menit. Setelah itu cairan di tabung koleksi dibuang dan ditempatkan lagi Wizard SV minicolom ke dalam tabung koleksi kosong. Tahapan penambahan dengan Wizard SV wash solution dilakukan sebanyak empat kali.
Setelah pencucian terakhir, cairan dalam tabung koleksi dibuang dan disentrifus kembali Wizard SV minicolom 13.000 x g selama 2 menit untuk
mengeringkan matriks yang terikat. Wizard SV minicolom dipindahkan dan ditempatkan ke tabung 1.5 ml mikrosentrifuse steril, dan ditambahkan 250 µ l
Nuclease free water ke dalam Wizard SV minicolom. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit sebelum disentrifus pada kecepatan 13.000 x g selama 1 menit. Tabung mikrosentrifus 1.5 ml diambil, total elusi yang diperoleh adalah sebanyak 250 µ l. Setelah itu dilakukan pengukuran nilai konsentrasi genom dengan menggunakan spektrofotometer DNA (GeneQuant) pada absorbansi 260 dan 280 untuk mengecek kemurnian DNA. Tabung mikrosentrifuse yang berisi elusi atau ekstrak genom disimpan pada suhu -20°C atau -70°C sebelum digunakan untuk proses PCR.
Amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
Prosedur amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan sesuai metode Islam et al. (2008). Reaksi amplifikasi sampel DNA dilakukan dalam 0.2 ml tabung PCR. Pada setiap tabung reaksi PCR, bahan yang digunakan adalah TaKara Eq Taq (5 unit/µ l) sebanyak 0.25 µl, 10 x Ex Taq Buffer (yang mengandung Mg2+ 2.5 mM) sebanyak 5 µ l, dNTP mixture (2.5 mM) sebanyak 4 µ l, Primer universal 9F (5- GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan primer universal 1541R (5’- AAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (Matsuyama et al. 2008; Yamahira et al. 2008) sebanyak masing-masing 2.5 µ l 20 µM, ekstrak genom sebanyak 1 µg dan air destilasi ditambahkan sampai volume menjadi 50 µ l. Primer dibeli dari perusahaan Gene Design, Inc Jepang. Alat PCR yang digunakan adalah PCR merk
Applied Biosystem (Gambar 5.2.a).
Amplifikasi PCR dilakukan sampai mendapatkan pita tunggal yang merupakan amplifikasi gen 16 S rRNA. Pada penelitian ini terdapat 3 kondisi reaksi PCR yaitu sebagai berikut : (1) Sebanyak 15 isolat (1C6, 1D1, 1A6, 2C12, 2B2, 2B4, 1A5, 1A32, 1B1, 2B1, 1C4, 2D1, 2B3, 1C3 dan 1C1) diberi perlakuan dengan kondisi PCR sebagai berikut : denaturasi awal 95°C 5 menit, 30 siklus penempelan primer pada suhu 95°C 1 menit dan perpanjangan pada suhu 50°C 1 menit, 72 °C 2 menit dan tahap akhir 72°C 7 menit. (2) Tiga isolat (2D2, 1A1, 2A2) dengan kondisi PCR denaturasi awal 95°C 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus 95°C 1 menit, 51°C 45 detik, 72°C 2 menit, dan tahap akhir 72°C 7 menit.
(3) Dua isolat (2C2 dan 1A2) dengan kondisi PCR denaturasi awal 95°C 5 menit, 30 siklus 95°C 1 menit, 52°C 45 detik, 72°C 2 menit dan tahap akhir 72°C 7 menit. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4°C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1%.
Elektroforesis agarosa
Konsentrasi agarosa (Wako) yang digunakan adalah 1%. Agarosa sebanyak 1% (b/v) dipanaskan sampai mendidih dengan pelarut buffer TAE (tris asetat) 1x. Setelah mendidih, didinginkan dan diputar dengan magnetik stirer pada kecepatan putar perlahan, lalu setelah hangat dituangkan pada tray
elektroforesis dan ditunggu sampai dingin dan menjadi padat selama 1 jam, lalu sisir diangkat. Setelah itu, pada alat elektroforesis dituangkan buffer TAE 1x lalu
tray yang berisi agarosa yang sudah padat ditempatkan di alat elektroforesis sampai terendam oleh buffer.
Loading dye 1 µl dipersiapkan di atas parafilm kemudian dicampur dengan
produk PCR sebanyak 4 µ l, lalu dituangkan dengan menggunakan mikropipet ke dalam sumur (well) agarosa, dan juga dituang marker sebanyak 3 µ l. Setelah itu alat elektroforesis (Gambar 5.2.b) ditutup dan dijalankan pada voltase 100 Volt selama 30 menit. Agarosa padat hasil elektroforesis direndam pada larutan pewarna etidium bromida selama 10 menit. Setelah itu difoto dengan menggunakan Kamera UV dan hasilnya dicetak pada kertas film polaroid. Kemudian dilakukan pengamatan apakah diperoleh pita yang diinginkan.
Analisis urutan basa gen 16S rRNA
Primer yang digunakan adalah primer universal 785F (5’- GGATTAGATACCCTGGTAGTC-3’) dengan amplikon pada basa ke-800 sampai 1400 dan 802R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’) dengan amplikon basa ke 1-800 (Nakagawa & Kawasaki 2001; Matsuyama et al. 2008), dan ditambah dengan Primer 1R (5’-GGGCATGATGATTTGACGTC-3’) yang mengamplifikasi basa ke 600-1200, primer 2F (5’-GTGAGACTGCCGGTGA CAAA-3’) untuk amplikon basa ke 1150-1500 dan primer 3R (5’-ATCA
GACTTAAAAAACCGCC-3’) untuk mengamplifikasi basa ke 1-600 (Gambar 5.1). Primer 1R, 2F dan 3R didesain pada penelitian ini berdasarkan hasil
alignment dari susunan basa yang diperoleh hasil analisis urutan basa dengan menggunakan primer universal 785F dan 802R. Hasil analisis urutan basa dari primer universal universal 785F dan 802R tidak dapat sejajar (multialignment) atau terdapat gap di antaranya, sehingga disusun primer 1R, 2F dan 3R untuk mendapatkan urutan basa gen 16S rRNA (Penyusunan primer dapat dilihat pada Lampiran 18).
Gambar 5.1 Lokasi amplikon analisis urutan basa
Purifikasi DNA produk PCR dilakukan menggunakan MonoFas DNA Purification Kit I (GL Sciences) dengan protokol sesuai petunjuk perusahaan. Sampel produk PCR dicampur buffer A untuk mengikat DNA dengan volume 10 kali dari volume produk PCR pada kolom spin (yang mempunyai struktur silika monolitik), disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 30 detik. Kemudian dilakukan pencucian dengan buffer B sebanyak 500 µl dan disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 1 menit. Tahap berikutnya adalah elusi dengan menggunakan buffer C sebanyak 50 µl dan disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 1 menit. Hasil sentrifus merupakan fragmen DNA murni.
Proses selanjutnya adalah siklus analisis urutan basa (thermal cycle of
sequencing) yang mirip dengan PCR untuk amplifikasi gen, namun pada siklus
analisis urutan basa hanya 1 primer yang digunakan pada setiap sumur/tabung PCR dengan menggunakan alat PCR. Pereaksi siklus analisis urutan basa adalah
sesuai petunjuk perusahaan. Pereaksinya adalah Big dye 1 µ l, 5 x buffer 3.5 µ l, Primer (785F atau 802R atau Primer 1 atau primer 2 atau primer 3) (3.2 µM) 1 µ l, ekstrak DNA 2 µ l, H2O 14.5 µ l sehingga total volume menjadi 20 µ l. Kondisi
PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 96°C 2 menit, proses denaturasi 96°C 10 detik, annealing pada suhu 50°C 5 detik sebanyak 25 siklus, serta tahap akhir 60°C 1 menit 15 detik, kemudian disimpan pada suhu 4°C.
Setelah tahap purifikasi DNA produk PCR dengan menggunakan PCR selesai, dilakukan analisis urutan basa dengan persiapan sebagai berikut : ditambahkan ke masing-masing tabung produk PCR 1 mg/ml glikogen sebanyak 3 µl, 3 N CH3COONa sebanyak 2.5 µ l dan 100% EtOH sebanyak 60 µ l, lalu
didiamkan selama 10 menit di suhu ruang, kemudian disentrifus 14.000 rpm 25°C selama 10 menit. Cairan campuran pereaksi dibuang, lalu ditambah 70% EtOH 100 µ l dan disentrifus kembali 14.000 rpm 25°C selama 5 menit, didiamkan (dry up) pada suhu 55°C selama 20 menit atau di suhu ruang sampai tidak ada alkohol ataupun cairan lainnya yang masih menempel. H.D. Formamida ditambahkan sebanyak 15 µ l dan dipindahkan ke 96 sumur (dengan terlebih ditulis dahulu kode pada kertas format analisis urutan basa) untuk dioperasikan di mesin sequencer
selama 2 jam. Sequencer yang digunakan adalah ABI Prism 3100 genetic
analyzer (Applied Biosystem) (Gambar 5.2.c). Data yang diperoleh disimpan
dalam file (compact disc) untuk dianalisis lebih lanjut.
(a) (b) (c)
Gambar 5.2 Peralatan utama yang digunakan (a) PCR Applied Biosystem, (b) Elektroforesis agarosa Muphid, (c) SequencerABI Prism 3100
Setelah diperoleh urutan basa maka dilakukan alignment dengan menggunakan program Clustal W dan selanjutnya dibuat pohon filogenetik dengan menggunakan program MEGA (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis) versi 4 dengan dipilih metode Bootstrap Neighbor Joining 1000x
(Tamura et al. 2004).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Genom Isolat BAL
Proses ekstraksi genom menghasilkan produk ekstrak genom yang derajat kemurnian dan konsentrasinya berbeda-beda. Kemurnian ekstrak DNA genom dapat diamati dengan melihat rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm, batas minimal kemurnian DNA adalah 1.8 (Sambrook et al. 1989). Pada panjang gelombang 260 nm, yang terdetaksi adalah material genetik DNA, sedangkan protein terdeteksi pada panjang gelombang 280 nm. Nilai perbandingan absorbansi di bawah 1.8 menunjukkan adanya kontaminan yang masih terbawa dalam ekstrak genom diantaranya asam humat, protein dan fenol (Devereux & Wilkonson 2004). Nilai kemurnian dan konsentrasi ekstrak genom 20 isolat BAL dapat dilihat pada Tabel 5.3.
Semua ekstrak genom isolat BAL pada penelitian ini mempunyai nilai perbandingan absorbansi 260/280 di atas 1.8 sehingga dinyatakan mengandung DNA cukup murni dari kontaminan protein (Tabel 5.3). Hal ini menunjukkan bahwa DNA semua isolat BAL mampu diekstraksi dengan baik menggunakan kit
Wizard ® SV Genomic Purification System no katalog A2360 (Promega). Bahan
ekstraksi DNA sangat mempengaruhi tingkat kemurnian ekstrak genom yang dihasilkan, karena tingkat akurasi dan efektivitas bahan pereaksi yang berbeda. Selain itu juga hal ini menunjukkan bahwa ekstraksi genom dilakukan dengan tepat baik pada tahapan ultrasentrifugasi dan penambahan bahan pereaksi serta terjaganya kondisi steril baik steril dari kontaminan mikroba maupun DNAse yang ada pada tangan pekerja. Pada saat eksperimen ini dilakukan, selalu digunakan sarung tangan steril dan sterilisasi meja kerja dengan menggunakan
alkohol. Selain itu juga dilakukan sterilisasi semua peralatan yang digunakan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.
Tabel 5.3 Nilai konsentrasi dan kemurnian ekstrak genom 20 isolat BAL No Isolat Konsentrasi
(µg/ml)
Nilai 260/280 (Kemurnian DNA)
Banyaknya esktrak yang digunakan untuk proses
PCR per reaksi (µ l) 1. 1A6 270 1.847 3.70 2. 2C12 415 2.089 2.41 3. 1A1 130 2.020 7.69 4. 1C4 555 1.918 1.81 5. 2D1 425 1.851 2.35 6 2B2 85 1.801 11.77 7 1D1 130 2.080 7.69 8. 2B3 420 2.042 2.38 9. 1C3 55 2.316 18.18 10. 2B1 310 2.033 3.23 11. 1A2 570 2.162 1.75 12. 2B4 860 2.205 1.16 13. 1B1 195 2.197 5.13 14. 2D2 485 1.935 2.06 15. 1C1 455 2.187 2.20 16. 2C2 105 2.278 9.52 17. 1A32 255 2.172 3.92 18. 1A5 200 1.951 5.00 19 1C6 639 2.107 1.57 20. 2A2 250 2.138 4.00
Amplifikasi Gen 16S rRNA Isolat BAL dengan Menggunakan PCR
Suhu annealing PCR yang digunakan untuk memperoleh pita tunggal tidak sama untuk semua bakteri. Terdapat tiga suhu annealing yang berbeda yang digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA. Optimasi suhu annealing
dilakukan dengan berpedoman pada suhu didih (melting temperature/ Tm) yang ditentukan berdasarkan primer yang digunakan sesuai petunjuk perusahaan produsen primer GeneDesign. Tm untuk primer 9F adalah 55.2°C, sedangkan Tm pada primer 1510F adalah 49.2°C. Suhu Tm 55°C dan 49°C digunakan untuk
proses annealing PCR yang pertama dan kedua, namun ternyata tidak semua ekstrak genom BAL dapat diamplifikasi sempurna dan didapatkan pita tunggal dengan suhu annealing tersebut. Contoh hasil PCR yang menunjukkan bahwa tidak semua ekstrak genom dari semua isolat dapat diamplifikasi dengan kondisi PCR yang sama dapat dilihat pada Gambar 5.3.
M sampel DNA M sampel DNA
(a) (b)
Gambar 5.3 Hasil pita elektroforesis agarosa gen 16S rRNA pada kondisi (a). PCR dengan suhu annealing 49○C selama 15 detik dan (b). PCR dengan suhu annealing 55○C selama 15 detik. (M= marker λEcoT141)
Kondisi PCR yang tidak tepat akan menyebabkan tidak teramplifikasinya gen 16S rRNA dengan baik sehingga diperoleh pita yang tidak tunggal (Gambar 5.3.a) dan bahkan tidak terdeteksi pada gel elektroforesis (Gambar 5.3.b). Kondisi suhu annealing yang tidak tepat akan menurunkan kepekaan primer dan dapat menyebabkan salah penempelan pada DNA template. Akibatnya, proses amplifikasi DNA menjadi tidak tepat yang ditunjukkan dengan pita yang tidak tunggal ataupun bahkan tidak dapat teramplifikasi dengan baik.
Optimasi suhu annealing terhadap semua ekstrak genom dilakukan dengan jalan mengatur lama dan suhu proses annealing pada proses PCR. Amplifikasi gen melalui PCR dan elektroforesis agarosa 1% berhasil memperoleh pita tunggal yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA secara spesifik berhasil diamplifikasi dengan primer 9F dan 1541R (Gambar 5.3). Gen 16S rRNA mempunyai ukuran 1500-1550 pasang basa (pb). Melalui optimasi kondisi PCR
untuk setiap isolat BAL, maka didapatkan tiga kondisi PCR dengan suhu
annealing berbeda untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA hingga mendapatkan
pita tunggal. Sebanyak 15 isolat (1C6, 1D1, 1A6, 2C12, 2B2, 2B4, 1A5, 1A32, 1B1, 2B1, 1C4, 2D1, 2B3, 1C3 dan 1C1) diberikan suhu annealing 50°C selama 1 menit. Tiga isolat (2D2, 1A1, 2A2) dapat diamplifikasi dengan baik pada suhu
annealing 51°C selama 45 detik. Dua isolat (2C2 dan 1A2) diberikan suhu
annealing 52°C selama 45 detik.
Suhu annealing dapat berbeda untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA hingga mendapatkan pita tunggal pada proses PCR karena kandungan basa nukleotida adenosin (A), timin (T), guanin (G) dan sitosin (C) yang berbeda pada setiap galur bakteri (Tabel 5.4). Pada tahap perpanjangan basa atau annealing, diperlukan suhu didih yang tepat supaya basa dapat melakukan penggandaan dengan menggunakan dNTP yang ditambahkan pada pereaksi dengan tepat. Pada akhirnya susunan basa gen 16S rRNA dapat diamplifikasi dengan sempurna dan diperoleh pita tunggal.
M a b c d M e f g M h i j k l m n o M p q M r s t u
Gambar 5.4 Hasil PCR gen 16S rRNA, produk sebelum dipurifikasi pada elektroforesis agarosa 1% (M = marker λEcoT141, a=1C6, b= 1D1, c= Sa28K, d=1A6, e=2D2, f= 2A2; g =1B1 , h = 2B2, i =2D1, j =1A32 , k=2C12, l=2B4, m =1A1, n=1C4, o = 2C2, p = 2C2, q= 1A2, r=2B1, s=2B3, t=1C3, u=1C1) 1882pb 1489pb 1000pb 1882pb 1489pb 1000pb 1882pb 1489pb 1000pb 1882pb 1489pb 1000pb 1882pb 1489pb 1000pb
Analisis Urutan Basa Gen 16S rRNA Isolat BAL
Pendekatan filogenetik merupakan sistem terbaru taksonomi bakteri. Kekerabatan antar bakteri diketahui dengan membandingkan secara molekuler urutan basa terutama gen 16S rRNA. Hal ini didasarkan pada : (1) gen rRNA merupakan gen yang memiliki ketetapan yang tinggi (highly conserved) karena merupakan jalur utama di ribosom untuk biosintesis protein yang merupakan awal perkembangan evolusi organisme, (2) fenomena transfer gen secara horizontal diantara organisme tidak melibatkan gen rRNA, serta (3) tingkat kemiripan urutan basa diantara individu yang berbeda mewakili variasi genomnya (Weisburg
et al. 1991; Felis & Dellaglio 2008; Klein et al. 1998).
Setelah diperoleh produk PCR yang merupakan amplifikasi gen 16S rRNA dengan ditunjukkan oleh pita tunggal pada ukuran 1500 pasang basa, dilakukan pemurnian produk PCR untuk menghilangkan kelebihan primer dan nukleotida yang masih terdapat pada produk PCR. Pada penelitian ini digunakan kit bahan pereaksi komersial MonoFas DNA Purification Kit I (GL Sciences). Proses selanjutnya disebut dengan siklus analisis urutan basa (thermal cycle of
sequencing) yang mirip dengan PCR namun menggunakan produk PCR awal
yang telah dipurifikasi sebagai DNA template. Pada proses siklus analisis urutan basa, digunakan masing-masing primer untuk satu template, berbeda dengan PCR yang memasukkan kedua primer forward dan reverse dalam satu tabung pereaksi. Pada proses siklus analisis urutan basa ini digunakan basa yang dilabel secara spesifik yang dinamakan Bigdye terminator, yang terinkorporasi pada tahapan