BAB III BAHAN DAN METODE
III.3 Metode Penelitian
III.3.4 Identifikasi Bakteri Gram Negatif
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram didapatkan kelompok bakteri Gram positif dan negatif yang telah murni biakannya, kemudian dilanjutkan dengan tahapan identifikasi setiap isolat bakteri untuk menentukan genus melalui uji biokimia pada beberapa media. Uji yang dilakukan untuk kelompok bakteri Gram negatif adalah uji hidrogen sulfida di media TSIA, uji motilitas dan indol di media semisolid indol, uji sitrat di media Simmon’s citrate agar, uji fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol di media cair MR-VP, dan uji fermentasi karbohidrat di media kaldu gula bertabung Durham. Secara singkat identifikasi bakteri Gram negatif ditampilkan pada Gambar 7.
20
Gambar 7 Diagram alir identifikasi bakteri Gram negatif (Lay 1994).
III.3.4.1 Uji Motilitas dan Indol
Uji motilitas dan indol dilakukan pada media semisolid untuk mengetahui pergerakan atau motilitas bakteri dan kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim pengurai asam amino triptofan. Hasil penguraian asam amino triptofan akan digunakan sebagai sumber karbon dalam metabolisme sel bakteri. Tahapan pengujian motilitas dan indol diawali dengan tabung yang berisi media semisolid ditandai dengan nomor isolat yang digunakan untuk uji. Biakan bakteri diambil dengan menggunakan needle (ose ujung jarum) sebanyak 1 needle, lalu ditusukkan ke dalam media semisolid sampai kedalaman kurang lebih 3/4 bagian dari permukaan media. Media semisolid yang telah diinokulasikan isolat bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam.
Reagen Ehrlich-Bohme diteteskan sebanyak 10-12 tetes ke dalam media semisolid yang telah diinkubasi selama 48 jam dan ditunggu beberapa menit untuk melihat perubahan yang terjadi. Penumpukan indol pada permukaan media yang merupakan produk buangan dari hasil penguraian asam amino triptofan
Fermentasi karbohidrat: Glukosa Sukrosa Laktosa Maltosa Manitol TSIA Indol Sitrat MRVP Kokoid Batang
ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. Pergerakan atau motilitas bakteri dapat dilihat melalui pertumbuhan bakteri di sekitar tusukan dan juga di permukaan media (Lay 1994).
III.3.4.2 Uji Hidrogen Sulfida (TSIA)
Uji hidrogen sulfida digunakan untuk mengidentifikasi bakteri penghasil enzim desulfurase yang dapat menghidrolisis asam amino yang mengandung gugus sulfur seperti sistein dan methionin sehingga dihasilkan asam sulfida (H2S). Media yang digunakan untuk uji ini adalah agar miring TSIA. Pada media ini pembentukan H2S ditandai dengan adanya warna hitam pada media. Media TSIA juga mengandung tiga macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa, sehingga media ini dapat juga digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan ketiga jenis gula tersebut (Lay 1994).
Tahapan pertama untuk menginokulasikan isolat bakteri di media TSIA adalah tabung media TSIA yang digunakan ditandai dengan nama isolat yang akan diinokulasikan. Tahap kedua isolat yang diinokulasikan diambil menggunakan needle steril sebanyak 1 needle lalu ditusukkan ke bagian butt (bagian dasar) dan digoreskan pada bagian slant (bagian miring). Media TSIA yang telah diinokulasikan isolat bakteri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam dan diamati perubahan warna yang terjadi pada media. Hasil fermentasi gula yang bersifat asam ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi kuning sedangkan perubahan warna media menjadi merah menunjukkan sifat basa akibat tidak terjadinya fermentasi gula. Pembentukan gas seperti H2 dan CO2 hasil fermentasi gula ditunjukkan dengan adanya retakan media di daerah butt (bagian dasar) (Lay 1994).
III.3.4.3 Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon akan mampu mengubah warna media Simmon’s citrate agar dari hijau menjadi biru. Tahapan untuk melakukan uji ini adalah tabung yang berisi media Simmon’s citrate agar ditandai dengan nama isolat yang akan diinokulasikan lalu isolat tersebut diambil sebanyak 1 mata ose dengan ose yang
22
steril dan digoreskan pada permukaan miring media. Media yang telah diinokulasikan isolat bakteri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam dan diamati perubahan warna yang terjadi pada media (Lay 1994).
III.3.4.4 Uji Fermentasi Asam Campuran atau Butanadiol (MR-VP)
Uji Methyl Red (MR) digunakan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri yang menghasilkan fermentasi glukosa yang bersifat asam campuran. Uji Voges-Proskauer (VP) digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang memfermentasikan 2,3 butanadiol.
Tabung kaldu MR-VP ditandai dengan nama isolat bakteri yang akan diinokulasikan. Isolat bakteri yang akan diinokulasikan diambil 1-2 mata ose dengan ose steril dan diinokulasikan di media kaldu MR-VP. Tabung kaldu MR-VP yang telah diinokulasikan isolat lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Setelah 24 jam masa inkubasi, kaldu MR-VP dibagi menjadi 2 bagian pada tabung reaksi yang terpisah. Tabung pertama diberi tanda MR dan tabung kedua diberi tanda VP beserta nama isolatnya. Pada tabung kedua (VP) ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan alpha naphtol lalu dikocok hingga berbuih. Hasil reaksi dapat terlihat setelah 30 menit penambahan reagen. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna kaldu menjadi merah dan hasil negatif bila tidak terjadi perubahan warna.
Tabung pertama (MR) diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama 4 x 24 jam. Setelah masa inkubasi 4 x 24 jam ditambahkan reagen methyl red ke dalam tabung dan didiamkan selama beberapa menit untuk melihat hasilnya. Hasil uji positif ditunjukkan dengan perubahan warna kaldu menjadi merah seperti pada uji VP dan hasil negatif ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi kuning atau jingga (Lay 1994).
III.3.4.5 Uji Fermentasi Karbohidrat
Uji fermentasi karbohidrat ini digunakan untuk menentukan jenis karbohidarat yang mampu difermentasi oleh bakteri. Indikator yang digunakan untuk menentukan hasil dari fermentasi karbohidrat adalah terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna media menjadi kuning dan pembentukan gas yang ditandai dengan adanya gelembung udara pada tabung Durham. Jenis
karbohidrat yang digunakan dalam uji ini adalah glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol.
Tabung kaldu karbohidrat ditandai dengan jenis karbohidrat dan nama isolat bakteri yang akan diinokulasikan. Isolat bakteri diambil 1-2 mata ose dengan ose steril dan diinokulasikan ke dalam kaldu karbohidrat dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Hasil fermentasi karbohidrat setelah diinkubasi diamati untuk melihat adanya pembentukan asam dan gas dari isolat yang diinokulasikan (Lay 1994).