3. METODE PENELITIAN
3.3. Pelaksanaan Penelitian
3.3.1. Identifikasi Bakteri Pereduksi Merkuri
Tahapan penelitian yang dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan ICBB Bogor terdiri atas: (1) isolasi, (2) seleksi, (3) identifikasi bakteri pereduksi merkuri. Analisis merkuri menggunakan AAS. Identifikasi dan karakteristik yang dilaksanakan meliputi morfologi dan fisiologi berpedoman pada Analisis Mikroba di Laboratorium (Bibiana, 1994) dan Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium (Tedja, 2007). Uji morfologi meliputi: bentuk sel, pewarnaan gram dan spora, serta koloni (bentuk, diameter, warna, elevasi, tepian, permukaan, dan motilitas). Uji fisiologis meliputi fermentasi karbohidrat (uji gula: glukosa, fruktosa, mannitol, xylose, sukrosa, laktosa, inositol, sorbitol, arabinosa, galaktosa, maltosa, dan dulsitol), respirasi karbohidrat (uji oksidase, uji katalase, reduksi nitrat), uji sitrat, uji lisin, uji urease, uji indol, uji metil red, uji voges proskauer, dan uji hidrogen sulfida. Identifikasi dikerjakan hingga tingkat genus dengan berpedoman pada buku Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). 3.3.1.1. Isolasi
Isolasi bakteri pereduksi merkuri dilakukan dengan metode sebar. Sampel tanah diencerkan dengan larutan fisiologis (8.5 gr NaCl/ liter) sampai dengan pengenceran 10-4. Cara pembuatan pengenceran 10-1 yaitu memasukkan 0.5 g tanah ke dalam tabung reaksi yang berisi 4.5 ml larutan garam fisiologis, kemudian dikocok dan dibiarkan beberapa saat supaya bagian yang kasar mengendap. Untuk memperoleh pengenceran 10-2, maka suspensi tanah tersebut sebanyak 0.5 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 4.5 ml larutan garam fisiologis, kemudian dikocok. Hal yang sama dilakukan untuk pengenceran 10-3 dan 10-4. Dari pengenceran 10-4 diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan ke atas cawan petri yang
berisi media agar Luria Bertani (LB) dengan komposisi 10 g tryptone, 5 g yeast ekstrak, 5 g NaCl, 15 g agar per liter, dan mengandung 10 ppm dan 25 ppm HgCl2. Kemudian diinkubasi pada suhu 27oC selama 3 hari.
Bakteri yang telah diperoleh kemudian dimurnikan sehingga diperoleh koloni bakteri yang murni. Pemurnian isolat bakteri dilakukan dengan mengambil koloni yang terpisah dan tampak jelas berbeda dengan jarum ose dan digoreskan pada cawan petri berisi media agar LB, kemudian diinkubasi pada suhu 27oC selama 3 hari. 3.3.1.2. Seleksi Bakteri Pereduksi Merkuri
Seleksi bakteri didasarkan pada kemampuan isolat tumbuh dalam media dengan berbagai konsentrasi HgCl2. Isolat bakteri ditumbuhkan dengan metode gores pada media agar LB yang ditambahkan dengan 25 ppm HgCl2. Jika isolat tumbuh, maka isolat bakteri tersebut ditumbuhkan dengan metode gores pada media agar LB yang telah ditambahkan HgCl2 dengan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 50 ppm, 100 ppm, 250 ppm, 400 ppm, 500 ppm sehingga diperoleh isolat unggul yang mampu hidup pada konsentrasi HgCl2 yang tertinggi. Isolat hasil pemurnian disimpan dalam gliserol 20% dan kompos pada suhu -20oC serta agar miring berisi media Luria Bertani (per liter medium): 1.0 g tripton, 0.5 g ekstrak khamir, 0.5 g NaCl, 1.5 g bacto agar, pH 7.2 pada suhu 8-10oC.
3.3.1.3. Karakteristik Bakteri Pereduksi Merkuri
Isolat yang dipilih untuk uji morfologis dan fisiologis adalah isolat yang tumbuh pada medium LB yang disuplementasi dengan HgCl2 500 ppm. Identifikasi morfologi meliputi pewarnaan gram, pewarnaan spora, morfologis koloni dan sel. Pengamatan koloni dilakukan secara visual terhadap bentuk koloni, diameter koloni, warna koloni, elevasi koloni, tepian koloni, permukaan koloni, dan motilitas sedangkan pengamatan morfologi sel dilakukan dengan menggunakan mikroskop meliputi bentuk sel dan bentuk spora. Identifikasi fisiologis yang diuji yaitu Fermentasi Karbohidrat (uji gula: Glukosa, Fruktosa, Mannitol, Xylose, Sukrosa, Laktosa, Inositol, Sorbitol, Arabinosa, Galaktosa, Maltosa, Dulsitol), Respirasi Karbohidrat (uji Oksidase, uji Katalase, Reduksi Nitrat), uji Sitrat, uji Lisin, uji Urease, uji Indol, uji Metil Red, uji Voges Proskauer, dan uji Hidrogen sulfida. Ke-
14 uji morfologi dan uji fisiologi yang dilakukan mengikuti petunjuk buku Analisis Mikroba di Laboratorium (Bibiana, 1994) dan Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium (Tedja, 2007).
1. Uji Pewarnaan Gram
Isolat ditumbuhkan pada media agar LB. Setelah berumur 18-20 jam dibuat olesan isolat di atas kaca obyek dengan cara satu ose isolat diletakkan pada kaca objek yang telah ditetesi aquades, kemudian difiksasi di atas bunsen 2 -3 kali dengan cepat supaya isolat melekat pada kaca obyek. Pewarnan Gram dilakukan terhadap hasil olesan isolat bakteri dengan cara olesan digenangi dengan ungu kristal selama satu menit, kemudian dicuci dengan air dan dibiarkan kering udara. Selanjutnya olesan digenangi dengan iodium selama dua menit, dicuci dengan air, dan setelah kering udara kemudian ditetesi dengan alkohol 95% selama 30 detik. Terakhir olesan digenangi dengan pewarna tandingan safranin selama 30 detik, dicuci dengan air dan dikeringkan dengan kertas penghisap. Bila isolat berwarna ungu termasuk Gram positif namun bila berwarna merah termasuk Gram negatif.
2. Uji Pewarnaan Spora
Prosedur pewarnaan spora dengan metode Schaeffer-Fulton digunakan untuk uji lanjut bakteri bentuk batang dan Gram positif. Dibuat preparat ulas dari ke-2 isolat lalu ditutup dengan kertas saring. Selanjutnya ulasan pada gelas objek ditetesi dengan malachite green di atas kertas saring. Meletakkan gelas objek di atas air yang sedang mendidih, membiarkan selama 5 menit dan menjaga jangan sampai mengering. Jika bagian pinggir mulai mengering ditambahkan lagi malachite green. Preparat didinginkan selama 1 menit sebelum meneruskan pewarnaan. Buang kertas saring, kemudian dicuci dengan aquades. Tetesi dengan safranin (zat warna basa) dan didiamkan selama 60 detik, safranin tidak akan masuk dalam spora. Sel vegetatif terlihat berwarna merah sedangkan spora berwarna hijau.
3. Uji Motilitas
Isolat ditanam pada media NA tegak dengan cara tusuk sedalam + 5 mm. Selanjutnya di inkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam. Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja. Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan.
4. Uji Fermentasi Karbohidrat
Untuk mempelajari kemampuan bakteri dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang disertai produksi asam atau asam dan gas. Terdiri dari Uji Glukosa, Uji Fruktosa, Uji Mannitol, Uji Xylose, Uji Sukrosa, Uji Laktosa, Uji Inositol, Uji Sorbitol, Uji Arabinosa, Uji Galaktosa, Uji Maltosa, dan Uji Dulsitol. Isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung karbohidrat. Uji positif ditandai dengan warna kuning. Khusus pada uji glukosa ditambahkan tabung Durham untuk pengamatan pembentukan gas.
5. Uji Aerob dan Anaerob Fakultatif
Isolat ditumbuhkan dalam media padat atau media cair Luria Bertani yang ditambah dengan agar bakto (Oxoid) pada tabung reaksi. Bila isolat tumbuh pada permukaan media berarti aerob dan bila pertumbuhannya menyebar berarti anaerob fakultatif.
6. Uji Katalase
Untuk menguji kemampuan bakteri penghasil enzim katalase dalam mendegradasi hydrogen peroksida. Isolat ditumbuhkan pada media LB. Hidrogen peroksida 3% diteteskan pada kaca obyek kemudian ditambahkan satu ose isolat dari media NA tersebut. Uji positif ditandai oleh terbentuknya gelembung oksigen.
7. Uji Oksidase
Untuk menguji aktivitas sitokrom oksidase bakteri. Uji oksidase dilakukan dengan cara mengenangi koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media LB dengan larutan dimetil p-fenildiamina hidroklorida 1%. Uji positif ditandai dengan
berubahnya warna koloni menjadi merah muda, lalu merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam.
8. Uji Reduksi Nitrat
Untuk menguji kemampuan bakteri mereduksi nitrat (NO3) menjadi nitrit (NO2)Isolat ditumbuhkan dalam media mengandung KNO3 diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam selanjutnya ditambahkan larutan A (asam sulfanilat) dan larutan B ( alfa-naftilamin). Uji positif ditandai perubahan warna merah atau merah muda dimana nitrit dalam media akan bereaksi dengan larutan A dan B.
9. Uji Sitrat
Untuk membedakan bakteri enterik yang mampu memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya. Isolat ditumbuhkan pada media padat Sitrat- Simmon yang merupakan media sintetik dengan Na-sitrat sebagai sumber karbon, NH4 sebagai sumber nitrogen, dan brom thymol blue sebagai indikator pH. Uji positif ditandai dengan warna media berubah dari hijau menjadi hitam dimana mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. 10. Uji Urease
Untuk menguji kemampuan bakteri yang dapat mendegradasi urea dengan enzim urease. Isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang dapat menguraikan urea menjadi amonium dan CO2. Uji positif ditandai perubahan warna dari merah jingga menjadi merah ungu merupakan petunjuk terjadinya hidrolisis urea.
11. Uji Indol
Untuk menentukan kemampuan bakteri mendegradasi asam amino triptofan. Isolat ditumbuhkan pada media yang kaya dengan triptofan. Digunakan reagen yang mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Uji positif ditandai dengan terbentuknya cincin warna merah pada permukaan media.
12. Uji Metil Red
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam mengoksidasi glukosa dengan menghasilkan asam sebagai produk akhir dan berkonsentrasi tinggi. Isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, diinkubasi dan setelah itu ditambahkan reagen metil red. Uji positif ditandai warna merah karena terjadi fermentasi asam campuran.
13. Uji Voges Proskauer
Untuk membedakan bakteri enterik antara Eschericia coli, E. aerogenes, dan E. pneumonieae. Isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa dan diinkubasi. Selanjutnya ditambahkan reagen KOH 40% serta 15 tetes larutan alpha naphtol. Uji positif ditandai perubahan menjadi warna merah.
14. Uji Hidrogen sulfida
Untuk menguji kemampuan bakteri dalam menghasilkan H2S. Produksi H2S dapat terlihat dengan menggunakan media mengandung polipeptida dan kaya akan asam amino yang mengandung sulfur dan ion Fe2+ . Isolat ditumbuhkan pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar), uji positif ditandai dengan reaksi Fe menjadi FeS yang berwarna hitam.
14. Uji Metil Red
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam mengoksidasi glukosa dengan menghasilkan asam sebagai produk akhir dan berkonsentrasi tinggi. Isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, diinkubasi dan setelah itu ditambahkan reagen metil red. Uji positif ditandai warna merah karena terjadi fermentasi asam campuran.