Penelitian ini adalah untuk melihat perubahan genetik pada mutan kedelai generasi M2 dan M3 varietas Cikurai dan Malikka akibat perlakuan kolkisin dan mempermudah proses penapisan (screening) yang akan dilakukan pada generasi selanjutnya.
Pengambilan Sampel Daun
Sampel daun yang digunakan adalah daun yang berasal dari kecambah genotip mutan kedelai generasi M2 dan M3.
Isolasi dan Pemurnian DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan dengan metode CTAB yang dimodifikasi
memakai β-mercaptoethanol, PVPP, dan nitrogen cair saat penggerusan (Toruan dan Hutabarat, 1997).
Daun kedelai ditimbang masing-masing 0.2 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan kedalam mortar untuk digerus. Potongan daun yang ada dalam mortar ditambah buffer CTAB. Kedalam mortar ditambah Polyvinil Polypirolidone (PVPP) 0,1 g dan 0,5 ml
buffer CTAB, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstrak CTAB dan 10 µl ß-mercapthoehtanol, kemudian divortex hingga rata. Tabung tersebut diinkubasi kedalam penangas air bersuhu 650C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan larutan KIAA 1 ml kedalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah larutan KIAA 1 ml dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 1.5 ml dan ditambah isopropanol dingin 1 ml. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 40C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikering anginkan. Kemudian kedalam tabung ditambahkan 100 µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspense antara pellet dengan buffer TE (Orozco-Castillo et. al, 1994).
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol dingin 100% yang berisi suspense DNA dalam buffer TE dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 40C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pellet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± 200C bila tidak digunakan (Orozco-Castillo et. al, 1994).
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan 5 µl stok DNA ditambah 1 µl loading dye kedalam sumur gel agarose 0.8% yang ditambahkan 1 µl etidium bromida.
Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan kedalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running
elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan focus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Amplifikasi/ Genotyping
Amplifikasi mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur William et. al, (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 5 primer RAPD polimorfik yang digunakan berasal dari Sigma-Aldrich polimorfik.
Persiapan awal amplifikasi adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Kemudian dibuat larutan master yang terdiri atas : ddH2O 9,5 µl x 14 = 133 µl,
Go Green Tag 12,5 µl x 14 = 175 µl, Primer 1 µl x 14 = 14 µl. Dari tube diambil 23 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 13 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 µl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 360C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied
Biosystems di desain waktu, suhu, dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada tabel 1.
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu 40C bila sedang tidak digunakan.
Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR
No Tahapan Suhu Waktu Jumlah Siklus
1 Denaturasi awal 940C 2 menit 1
2 Denaturasi 940C 1 menit 45
3 Annealing 370C 1 menit 45
4 Ekstension 720C 2 menit 45
5 Ekstension akhir 720C 10 menit 1
6 Kondisi akhir PCR 40C Tak terbatas 1
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5% (b/v) dengan 2.5 µl etidium bromide.
Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 80 menit. Visualisasi DNA yang telah di elektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/ band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR-RAPD diskoring berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel masing-masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita,
profil pita diterjemahkan kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode l (ada) dan 0 (tidak ada).
Penentuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan log jarak menggunakan program regresi linier. Fragmen DNA standar (DNA landder) digunakan sebagai absis (x) dan log jarak migrasi sebagai ordinat (y). Dari persamaan ini ditentukan ukuran pasangan basa dari fragmen produk PCR berdasarkan log jarak dari fragmen tersebut.
Matriks ketidaksamaan (dissimilarity) tiap kombinasi pasangan dihitung berdasarkan Dissmilarity Index Simple Matching pada bootsraps 1000, sesuai rumus :
djj =1-
1 �∑
�1 � � �=1dengan djj ketidaksamaan antara i dan j, L jumlah lokus, π merupakan tingkat
ploidi dan m1 merupakan jumlah alel yang umum diantara I dan j untuk lokus l. Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1)
Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama, dan (ii) Neighbour-Joining Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin5.05 (Perrier dan Jacquemoundd-Collet, 2009).
Penelitian II. Pengaruh Naungan Terhadap Pertumbuhan dan Produksi