Identifikasi ekstrak gula tepung umbi garut dan umbi ganyong dilakukan menggunakan kromatografi kertas. Saat proses ekstraksi monosakarida dan oligosakarida menggunakan pelarut alkohol, komponen dengan bobot molekul kecil seperti asam amino, asam organik, pigmen, vitamin, mineral dan lain sebagainya dapat ikut terekstrak (Mc Clements, 2003). Komponen tersebut harus dihilangkan dari sampel agar tidak mengganggu proses analisis gula. Pada penelitian ini digunakan Pb-asetat jenuh untuk mengendapkan pigmen. Selanjutnya pemisahan kompleks Pb-asetat dengan komponen lain dari sampel dilakukan menggunakan sentrifugasi pada 2000 rpm selama 10 menit.
Untuk identifikasi oligosakarida pada ekstrak gula tepung umbi digunakan metode kromatografi kertas. Pada penelitian yang dilakukan oleh Putri (2005), proses identifikasi gula pada ekstrak umbi talas menggunakan metode Muchtadi (1989) dengan fase diam berupa kertas selulosa dan fase bergerak yang merupakan larutan campuran yang terdiri dari 2-propanol, etil asetat dan air dengan perbandingan 7:1:2 (v/v) dan proses elusi selama 48 jam. Proses identifikasi dengan menggunakan metode tersebut kurang efektif dikarenakan ekstrak tidak terpisahkan secara sempurna/jelas dan proses elusi memakan waktu yang cukup lama, oleh karena itu proses identifikasi menggunakan metode modifikasi dari Mulimani (2005) dengan menggunakan fase diam yang sama namun berbeda dalam fase geraknya. Dengan menggunakan metode tersebut, proses identifikasi kualitatif dapat dinilai efektif karena dapat memisahkan gula-gula menjadi spot-spot yang dapat dengan jelas dibedakan. Selain itu, proses elusi berlangsung lebih cepat bila dibandingkan dengan metode Muchtadi (1989) yaitu hanya berlangsung selama 4 – 6 jam. Hasil identifikasi oligosakarida dengan metode Muchtadi dapat dilihat pada Gambar 10.
a b c d e f g
Keterangan gambar :
a = fruktosa d = rafinosa g = ekstrak garut 4 %
b = maltosa e = ekstrak ubi
c = sukrosa f = ekstrak talas
Gambar 10. Hasil kromatografi metode Muchtadi (1989) \
Tahap identifikasi menggunakan metode Mulimani (2005) didahului dengan melakukan proses kromatografi terhadap 9 gula standar yaitu glukosa, maltosa, sukrosa, fruktosa, raffinosa, oligofruktosa, inulin, maltotriose, stakhiosa. Dari hasil kromatografi 9 gula standar akan diperoleh nilai Rf dari masing-masing gula standar. Nilai Rf diukur berdasarkan jarak tempuh spot dibagi dengan jarak tempuh eluen, jarak tempuh spot dihitung dari titik tengah spot yang dihasilkan. Hasil dari proses kromatografi gula standar dapat dilihat pada Gambar 11 dan nilai Rf dari masing-masing spot gula standar dapat dilihat pada Tabel 7.
a b c d e f g h i
Keterangan gambar :
a = glukosa d = fruktosa g = inulin
b = maltosa e = rafinosa h = maltotriosa
c = sukrosa f = oligofruktosa i = stakhiosa
Gambar 11. Hasil Kromatografi Gula Standar
Tabel 7. Nilai Rf kromatografi gula-gula standar
Gula Standar Nilai Rf
Glukosa 0.26 Maltosa 0.33 Sukrosa 0.41 Fruktosa 0.49 Raffinosa 0.27 Oligofruktosa 0.27 Inulin 0.00 Maltotriose Tidak ada spot
Stakhiose 0.20 Hasil kromatografi kertas untuk gula standar yang dielusi selama 4-5 jam
didapatkan nilai Rf untuk masing-masing standar gula yang digunakan . Nilai Rf untuk masing-masing gula standar adalah 0.26 untuk glukosa, 0.33 untuk maltosa, 0.41 untuk sukrosa, 0.49 untuk fruktosa, 0.27 untuk rafinosa dan oligofruktosa, 0.00 untuk inulin, dan 0.20 untuk stakhiosa. Untuk standar maltotriose tidak didapatkan spot, hal ini dapat disebabkan konsentrasi maltotriose yang kurang, untuk dapat teridentifikasi dan tidak bereaksinya
larutan penyemprot terhadap maltotriosa. Data nilai Rf gula standar yang diperoleh akan digunakan sebagai acuan dalam identifikasi oligosakarida pada ekstrak umbi garut dan umbi ganyong.
Pada kromatografi kertas ekstrak gula tepung umbi garut, digunakan ekstrak gula yang terbagi menjadi 3 tingkat konsentrasi (dalam % TPT) yaitu 4.8 %, 2 %, dan 3 %. Sedangkan pada kromatografi kertas ekstrak gula tepung umbi ganyong, digunakan ekstrak gula yang terbagi menjadi 5 tingkat konsentrasi (dalam % TPT) yaitu 7.5 %, 3 %, 4%, 5%, dan 6 %. Kemudian dari masing-masing spot yang dihasilkan dari proses kromatografi ekstrak umbi garut dihitung nilai Rfnya. Hasil dari proses kromatografi ekstrak gula tepung umbi garut dan umbi ganyong masing-masing dapat dilihat pada Gambar 12 dan 13. Nilai Rf dari masing-masing spot ekstrak umbi garut dan ganyong masing-masing dapat dilihat pada Tabel 8 dan Tabel 9.
a b c 1 2 1 2 3 1 2 3 Keterangan gambar : a = garut TPT 4.8 %
(1) Spot gabungan sukrosa, fruktosa, olifruktosa dan rafinosa (2) Spot gula dengan BM <180
b = garut TPT 2 %
(1) Spot sukrosa
(2) Spot fruktosa
(3) Spot gula dengan BM <180
c = garut TPT 3 %
(1) Spot sukrosa
(2) Spot fruktosa
(3) Spot gula dengan BM <180
a b c d e 1 2 1 2 1 2 1 2 3 1 2 3 4 Keterangan gambar : a = ganyong TPT 7.5 %
(1) Spot gabungan sukrosa, fruktosa, olifruktosa dan rafinosa (2) Spot gula dengan BM <180
b = ganyong TPT 3 %
(1) Spot sukrosa
(2) Spot fruktosa
(3) Spot gula dengan BM <180
c = ganyong TPT 4 %
(1) Spot sukrosa
(2) Spot fruktosa
(3) Spot rafinosa
(4) Spot gula dengan BM <180
d = ganyong TPT 5 %
(1) Spot gabungan sukrosa, fruktosa, olifruktosa dan rafinosa (2) Spot gula dengan BM <180
e = ganyong TPT 6 %
(1) Spot gabungan sukrosa, fruktosa, olifruktosa dan rafinosa (2) Spot gula dengan BM <180
Tabel 8. Nilai Rf pada ekstrak gula umbi garut dalam berbagai konsentrasi Konsentrasi ekstrak
gula (dalam % TPT)
No
spot* Nilai Rf Analisis spot 1 0.42 Gabungan Raffinosa, Oligofruktosa, Sukrosa dan Fruktosa Garut 4.8 % 2 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.40 Sukrosa 2 0.49 Fruktosa Garut 2 % 3 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.41 Sukrosa 2 0.49 Fruktosa Garut 3 % 3 0.67 Gula dengan BM< 180 *) Merujuk pada Gambar 12
Tabel 9. Nilai Rf pada ekstrak gula umbi garut dalam berbagai konsentrasi Konsentrasi ekstrak
gula (dalam % TPT)
No
spot* Nilai Rf Analisis spot 1 0.42 Gabungan Raffinosa, Oligofruktosa, Sukrosa dan Fruktosa Ganyong 7.5 % 2 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.40 Sukrosa 2 0.49 Fruktosa Ganyong 3 % 3 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.28 Raffinosa 2 0.41 Sukrosa 3 0.49 Fruktosa Ganyong 4 % 4 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.42 Gabungan Raffinosa, Oligofruktosa, Sukrosa dan Fruktosa Ganyong 5 % 2 0.67 Gula dengan BM< 180 1 0.42 Gabungan Raffinosa, Oligofruktosa, Sukrosa dan Fruktosa Ganyong 6 % 2 0.67 Gula dengan BM< 180 *) Merujuk pada Gambar 13
Hasil kromatografi dari ekstrak gula tepung umbi garut yang dielusi selama 4-5 jam untuk masing-masing konsentrasi didapatkan nilai Rf dari spot-spot yang terpisahkan dari ekstrak. Pada ekstrak gula tepung umbi garut dengan konsentrasi 4.8% didapatkan bentuk spot yang melebar dengan nilai Rf sebesar 0.42, dan terdapat spot lain dengan nilai Rf sebesar 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 2% spot sudah dapat terpisah sehingga terbentuk 2 buah spot besar dan 1 spot tipis dengan nilai Rf sebesar 0.40, 0.49, 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 3% didapatkan 3 buah spot yang sama dengan ekstrak gula 2% yaitu dengan nilai Rf sebesar 0.41, 0.49, 0.67.
Pada ekstrak gula tepung umbi ganyong dengan konsentrasi 7.5% didapatkan bentuk spot yang melebar dengan nilai Rf sebesar 0.42, dan terdapat spot lain dengan nilai Rf 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 3% spot sudah dapat terpisah sehingga terbentuk 2 buah spot besar dan 1 spot tipis dengan nilai Rf sebesar 0.40, 0.49, 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 4% didapatkan 3 buah spot yang sama dengan ekstrak gula konsentrasi 3% dan 1 spot yang berbeda yaitu dengan nilai Rf sebesar 0.28, 0.41, 0.49, dan 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 5% didapatkan bentuk spot yang melebar dengan nilai Rf sebesar 0.42, dan terdapat spot lain dengan nilai Rf sebesar 0.67. Pada ekstrak gula dengan konsentrasi 6% didapatkan bentuk spot yang melebar dengan nilai Rf sebesar 0.42, dan terdapat spot lain dengan nilai Rf sebesar 0.67.
Dengan membandingkan nilai Rf dari sampel dan standar, ekstrak gula tepung umbi garut dan ganyong teridentifikasi didominasi oleh sukrosa dan fruktosa, sedangkan kandungan oligosakarida terdapat sedikit dalam ekstrak. Hal ini diperlihatkan dengan terlihatnya spot hanya pada konsentrasi 4 % untuk ekstrak umbi garut dan konsentrasi 4 %, 5 % dan 6 % untuk ekstrak umbi ganyong ,dimana pada konsentrasi 2 % dan 3 % hanya terlihat adanya sukrosa, fruktosa dan gula atau komponen lain yang memiliki nilai BM < 180. Dengan menggunakan metode yang sama, penelitian yang dilakukan Hana (2007, belum dipublikasikan) menunjukkan pada kromatografi ekstrak talas mentega, terdapat dua buah spot dengan nilai Rf masing-masing 0.35 diperkirakan gabungan sukrosa dan fruktosa, dan 0.32 diperkirakan rafinosa.
Namun warna spot rafinosa yang dihasilkan sangat tipis. Pada penelitian yang dilakukan oleh Marlis (2007, belum dipublikasikan) menunjukkan hal yang serupa dimana pada kromatografi ekstrak gula tepung umbi jalar sukuh, terdapat tiga buah spot dengan dugaan spot adalah sukrosa, fruktosa, rafinosa dan oligofruktosa dimana pada warna spot rafinosa dan oligofruktosa sangat tipis. Walaupun dalam jumlah sedikit, keberadaan dari kedua oligosakarida di dalam ekstrak gula tepung umbi mengindikasikan bahwa umbi garut dan ganyong berpotensi sebagai prebiotik.