Selain mutu fisik dan fisiologis benih, keseragaman dan kebenaran varietas merupakan mutu genetik yang menjadi perhatian penting untuk tanaman tahunan seperti jeruk karena proses produksi buah jeruk memerlukan waktu yang lama dan biaya yang besar. Keragaman semaian yang tampak berdasarkan morfologi semaian disebabkan oleh adanya semaian off type. Semaian off type harus di roguing untuk mempertahankan mutu benih JC.
Identifikasi Semaian Jeruk dengan Penanda Morfologi
Identifikasi semaian off type dan true to type berdasarkan penanda morfologi lebih sering digunakan karena relatif murah dan mudah. Secara umum, keragaan semaian true to type antara lain terlihat jelas pada bentuk daun yang elliptic, pangkal daun cuncate dan ujung daun obtusus seperti tampak dalam Gambar 7.
28
Gambar 7. Semaian jeruk JC true to type (no semaian 1, 2 dan 3)
Selain morfologi bentuk daun, semaian true to type dan off type diduga berdasarkan karakter kuantitatif dan kualitatif lainnya. Tabel 7 menunjukkan hasil pengamatan kuantitatif 12 semaian dengan variabel pengamatan tinggi tanaman, jumlah daun, rasio panjang dan lebar daun serta rasio panjang dan lebar pucuk daun. Tinggi dan jumlah daun menjadi indikator tinggi rendahnya vigor semaian. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa semaian no 1, 2, 3, 6, 9, 12 menunjukkan vigor yang tinggi, semaian 5, 8, 10, 11 dalam kategori vigor sedang, dan semaian 4 dan 7 termasuk dalam kategori rendah.
Tabel 7 Identifikasi semaian jeruk JC berdasarkan karakter kuantitatif No
Semaian
Tinggi Semaian
(cm) Jumlah Daun
Rasio
panjang helai daun : lebar helai daun
LAMI 1 12 13 1.96 0.69 2 9.5 14 1.89 0.67 3 9.5 14 2.05 0.61 4 5.0 9 2.58 0.70 5 8.0 9 1.75 0.69 6 9.5 12 2.60 0.93 7 4.0 14 3.08 1.62 8 8.0 10 1.67 0.68 9 12.1 18 3.47 1.10 10 9.0 8 2.63 0.93 11 8.0 7 1.04 2.25 12 12.1 10 1.44 0.52
Keterangan : LAMI = Leaf Apex Morphometric Index (rasio panjang dan lebar ujung daun). Semaian 1, 2 dan 3 merupakan sampel semaian true to type dan semaian 4-12 merupakan sampel semaian off type.
Rasio panjang : lebar helai daun mengarah kepada bentuk daun sehingga pada semaian no 11 yang berbentuk bundar mempunyai rasio yang mendekati angka 1. Semakin tinggi rasio seperti no 7 dan 9 menunjukkan bentuk daun semakin memanjang.
Identifikasi menggunakan rasio panjang dan lebar ujung daun (ujung daun) digunakan untuk membedakan morfologi daun antar sampel. Nilai LAMI dalam penelitian ini terdiri dari 4 kisaran yaitu : < 0.75 pada semaian no 1, 2, 3, 4, 5, 8
dan 12, 0.90<LAMI≤ 0.95 pada semaian no 6 dan 10, 1<LAMI≤1.15 pada semaian no 9, dan > 1.15 pada semaian no 7.
Keragaman karakter kualitatif semaian true to type dan semaian off type terlihat pada Tabel 8. Keberadaan duri dan bentuk daun dapat menjadi pembeda antara semaian true to type dan off type. Duri merupakan salah satu pertanda dalam periode juvenil jeruk dan umumnya terdapat pada semaian JC, tetapi pada sampel off type 55.55% belum atau tidak menunjukkan pertumbuhan duri. Berdasarkan IPGRI 1999, daun JC tergolong dalam bentuk daun dengan stipula lebih pendek daripada helai daun (brevipetiolate) tetapi ditemukan sampel no 9 mempunyai daun tanpa stipula (sessile).
Tabel 8 Identifikasi semaian jeruk JC berdasarkan karakter kualitatif No Duri Stipula Tipe
daun Warna pupus daun Warna daun Bentuk helai daun Bentuk pangkal daun Bentuk ujung daun Bentuk tepi daun 1 + + tunggal hm h elliptic cuncate obtusus crenate 2 + + tunggal hm h elliptic cuncate obtusus crenate 3 + + tunggal hm h elliptic cuncate obtusus crenate 4 + + trifoliata hm h elliptic cuncate obtusus crenate 5 - + tunggal hm ht lanceolate obtusus rounded dentatus 6 + + tunggal mk h elliptic cuncate obtusus crenate 7 - + tunggal hm h lanceolate cuncate rounded crenate 8 - + tunggal hm h elliptic acute acute dentatus 9 + - tunggal hm h lanceolate acute rounded crenate 10 + + tunggal hm h lanceolate acute rounded sinuate 11 - + tunggal hm h orbicular rounded rounded dentatus 12 - + tunggal hm h ovate obtusus rounded entire Keterangan : + = ada, - = tidak ada, hm = hijau muda, h = hijau, ht = hijau tua,
mk = merah keunguan, elliptic = jorong, lanceolate = bangun lanset, orbicular = bundar, ovate = bulat telur, cuncate = segitiga sungsang, obtusus = tumpul, acute = runcing, rounded = bundar, crenate = bergerigi halus, dentatus = beringgit, sinuate = bergelombang.
Karakter lain terlihat jelas berbeda adalah tipe daun trifoliata pada sampel no 4. Tipe daun trifoliata tampak jelas pada saat semaian berumur 1-3 bulan setelah tanam tetapi pada umur 6 bulan setelah tanam bentuk tipe daun trifoliata tidak terlihat dengan jelas (Gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa roguing dapat dilakukan sebelum semaian berumur tiga bulan.
30
Gambar 8 Keragaan tipe daun trifoliata pada semaian no 4 saat tiga bulan setelah tanam (A) dan 6 bulan setelah tanam (B)
Karakter warna dan bentuk daun merupakan karakter penting dan mudah digunakan dalam membedakan semaian off type dan true to type. Warna pupus daun JC pada umumnya hijau muda sedangkan pada semaian off type no 6, sejak berkecambah nampak plumula dan daun berwarna merah keunguan. Namun demikian warna merah keunguan pupus daun memudar sampai dengan umur 3 bulan setelah tanam dan tidak terlihat pada umur 6 bulan setelah tanam (Gambar 9). Roguing semaian off type berdasarkan warna pupus daun dapat dilakukan sejak awal muncul kecambah. Farida (2005) juga memperoleh semaian off type dengan pupus daun merah keunguan dalam penelitiannya dengan batang bawah JC umur 2 dan 4 bulan.
Gambar 9 Keragaan warna pupus daun merah keunguan pada semaian no 6 saat berumur satu minggu setelah berkecambah (A), tiga bulan setelah tanam (B), dan enam bulan setelah tanam (C)
Warna daun masak dapat menjadi penanda semaian off type meskipun relatif sulit membedakan perbedaan warna hijau. Pada percobaan ini hanya pada sampel no 5 tampak daun hijau tua, berbeda dengan warna daun sampel lainnya.
Bentuk daun secara umum dapat menjadi penanda morfologi semaian. Bentuk helai daun elliptic dengan pangkal daun cuncate, ujung daun obtusus dan tepi daun crenate menjadi penanda morfologi semaian JC yang bersifat true to type. Sementara itu, semaian dengan bentuk daun yang menyimpang dari bentuk daun tersebut dianggap sebagai semaian off type seperti pada semaian no 5, 7, 8, 9,10, 11 dan 12.
Berdasarkan hasil pengamatan karakter kuantitatif dan kualitatif semaian true to type dan off type dapat dibedakan dengan mudah pada beberapa karakter yaitu tipe daun, warna pupus daun dan bentuk daun. Keragaan semaian off type no 4-7 disajikan dalam Gambar 10.
A B C
Gambar 10. Keragaan daun semaian jeruk JC off type (semaian no 4-12) Identifikasi Semaian dengan Penanda Molekuler (SSR)
Amplifikasi dan separasi DNA dengan mesin PCR dengan menggunakan 6 primer dilakukan pada 12 sampel DNA semaian yang telah diindentifikasi dengan penanda morfologi dan 2 sampel DNA pohon induk sebagai pembanding. Hasil elektroforesis diperoleh 4 primer polimorfis yaitu Ag14, ATC 09, TAA15, dan TAA 27.
Bulk Segregant Analysis digunakan untuk melihat keterpautan antara penanda morfologi dan penanda SSR. Bulk Segregant Analysis hanya dilakukan pada beberapa karakter morfologi. Karakter morfologi yang digunakan yaitu : karakter LAMI < 0.75, vigor tinggi, adanya duri, bentuk daun elliptic, bentuk daun eliptic, bentuk pangkal daun acute, bentuk ujung daun obtusus, dan bentuk tepi daun dentatus. Hasil bulk segregant analysis dapat dilihat pada Tabel 9.
Hasil bulk segregant analysis menunjukkan terdapat marka yang terpaut dengan karakter LAMI < 0.75 yaitu AG14 pada ukuran pita 170bp meskipun masih terdapat kemungkinan bias 40%. Hasil penelitian Oliveira et al. (2002) menunjukkan bahwa nilai LAMI (Leaf Apex Morphometric Index) berkorelasi dengan identifikasi SSR dalam membedakan semaian true to type dengan semaian off type pada jeruk hasil persilangan. Namun demikian nilai LAMI tidak dapat dijadikan penanda tunggal dan tetap harus menggunakan penanda morfologi lainnya.
Berdasarkan hasil bulk segregant analysis tidak diperoleh marka yang 100% terpaut erat pada bentuk morfologi tertentu diduga karena terbatasnya jumlah primer yang digunakan.
32
Tabel 9 Hasil Bulk Segregant Analysis penanda SSR pada penanda morfologi LAMI < 0.75, vigor tinggi, keberadaan duri, bentuk daun elliptic, bentuk daun lanceolate, pangkal daun acute, ujung daun obtusus dan tepi daun dentatus
Lokus
Ukuran pita (bp)
Persentase Kehadiran pita (%)
LAMI Vigor Duri Bentuk daun
< 0.75 selain
< 0.75 tinggi
tidak
tinggi ada tidak elliptic
selain elliptic Ag14 170 100.0 40.0 83.3 50.0 71.4 60 100.00 50.0 160 71.4 80.0 100.0 66.7 85.7 80 66.70 83.3 ATC09 200 100.0 60.0 66.7 83.3 71.4 100 83.30 83.3 TAA15 185 85.7 60.0 66.7 83.3 42.8 60 100.00 50.0 175 85.7 80.0 100.0 66.7 85.7 80 83.33 83.3 TAA27 180 85.7 85.7 100.0 66.7 100.0 60 100.00 66.7 Lokus Ukuran pita (bp)
Persentase Kehadiran pita (%)
Bentuk daun Pangkal
daun Ujung daun Tepi daun
lanceolate selain lanceolate acute selain acute obtusus selain obtususdentatus selaian dentatus Ag14 170 25 100.0 33.3 88.8 100 57.1 100.0 66.7 160 100 75.0 60.0 77.7 80 71.4 60.0 88.8 ATC09 200 75 87.5 60.0 88.8 80 85.7 100.0 77.7 TAA15 185 50 87.5 60.0 77.7 100 57.1 100.0 66.7 175 100 75.0 100.0 77.7 80 85.7 60.0 88.8 TAA27 180 75 87.5 100.0 77.7 100 71.4 33.3 100.0
Hasil Analisis Gerombol
Oleh karena hasil bulk segregant analysis tidak sesuai dengan harapan, analisis gerombol berdasarkan penanda morfologi dan penanda SSR dilakukan untuk mengidentifikasi persamaan antara penanda morfologi dan SSR.
Hasil analisis gerombol dari seluruh data morfologi membentuk dendrogram (Gambar 11) dengan koefisien kemiripan 0.60–1 atau terdapat keragaman genetik sebesar 40%. Semaian no 1, 2 dan 3 mempunyai koefisien kemiripan 1 yang dapat diartikan bahwa semaian 1, 2 dan 3 sama berdasarkan penanda morfologi. Semain no 1, 2 dan 3 secara morfologi sama dengan semaian JC pada umumnya sehingga semaian ini merupakan semaian true to type berdasarkan penanda morfologi.
Semakin banyak persamaan morfologi antar semaian menunjukkan koefisien kemiripan yang semakin tinggi. Semaian no 4 berada dalam satu kelompok dengan semaian true to type dengan koefisien kemiripan 0.89. Semaian no 6 berada dalam satu kelompok dengan semaian true to type dengan koefisien kemiripan 0.86. Semaian no 12 mempunyai koefisien kemiripan 0.66 dengan semaian true to type. Semaian no 5, 7, 8, 9, 10, 11 berada dalam satu kelompok dan mempunyai koefisien kemiripan 0.6 dengan semaian true to type.
Gambar 11 Dendrogram berdasarkan penanda morfologi pada 12 semaian jeruk JC
Analisis gerombol terhadap semua profil DNA (SSR) dapat menghasilkan dendogram dengan koefisien kemiripan berkisar 0.63-1 atau terdapat keragaman genetik sebesar 37% (Gambar 12). Semaian no 1, 2 dan 3 berada dalam satu kelompok dengan koefisien kemiripan satu menunjukkan bahwa ketiga semaian tersebut secara genetik sama. Hasil visualisasi pita DNA (Lampiran15-18) menunjukkan bahwa semaian no 1, 2 dan 3 selalu menunjukkan keberadaan pita pada ukuran basa yang sama dengan tetuanya sehingga semaian no 1, 2 dan 3 berdasarkan penanda SSR yang digunakan dalam penelitian ini dapat diartikan sebagai semaian true to type.
Semaian no 5 berada dalam satu kelompok dengan semaian no 1, 2, dan 3 pada koefisien kemiripan 0.88. Hasil tersebut berbeda dengan hasil dendrogram berdasarkan penanda morfologi yang menunjukkan bahwa semaian no 5 mempunyai koefisien kemiripan dengan semaian true to type sebesar 0.6.
Semaian no 6 berada pada kelompok yang berbeda dan mempunyai koefisien kemiripan dengan semaian true to type 0.78. Sementara itu dendogram berdasarkan penanda morfologi menunjukkan bahwa nilai koefisien kemiripan semaian no 6 dengan semaian true to type 0.86. Semaian no 6 mempunyai banyak persamaan dengan semaian true to type kecuali pada penanda morfologi spesifik yaitu warna pupus daun merah keunguan. Penanda morfologi warna pupus merah keunguan dapat menjadi penanda semaian off type yang efektif untuk semaian JC.
Koefisien kemiripan 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1 2 3 4 6 12 7 9 10 5 11 8
34
. Gambar 12 Dendrogram berdasarkan penanda SSR pada 12 semaian jeruk JC
Semaian no 4 mempunyai koefisien kemiripan dengan semaian true to type sebesar 0.63 padahal berdasarkan dendrogram morfologi semaian no 4 mempunyai banyak kemiripan dengan semaian true to type (koefisien kemiripan 0.89). Semaian no 4 hanya mempunyai satu penanda morfologi yang berbeda dengan semaian yang lain yaitu tipe daun trifoliata. Berdasarkan hal tersebut tipe daun trifoliata dapat menjadi penanda yang efektif untuk semaian JC off type.
Semaian no 7 dan 9 mempunyai koefisien kemiripan 1 yang menunjukkan bahwa kedua semaian berdasarkan penanda SSR merupakan semaian yang identik. Kedua semaian mempunyai koefisien kemiripan 0.74 dengan semaian true to type. Sementara itu dendrogram berdasarkan penanda morfologi kedua semaian menunjukkan koefisien kemiripan 0.69. Kedua semaian mempunyai persamaan pada bentuk daun yaitu daun memanjang (rasio panjang dan lebar daun ± 3), helai daun lanceolate dengan ujung daun rounded dimana karakter-karakter tersebut berbeda dengan semaian true to type. Semaian dengan bentuk daun lanceolate dan ujung rounded merupakan salah satu penanda semaian off type yang efektif.
Semaian no 3 dan no 11 merupakan semaian yang berasal dari satu benih. Semaian no 3 berdasarkan penanda morfologi maupun penanda SSR merupakan semaian true to type. Sementara itu, semaian no 11 berdasarkan dendrogram morfologi dan SSR mempunyai koefisien kemiripan sebesar 0.6 dan 0.63. Berdasarkan kedua hal tersebut semaian no 11 diduga merupakan semaian off type yang berasal dari embrio zigotik.
Koefisien kemiripan 0.63 0.73 0.82 0.91 1.00 1 2 3 5 6 10 7 9 12 4 8 11
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
1. Benih jeruk JC mempunyai persentase poliembrioni 53.34-73.33% dengan jumlah embrio 1-6 per benih
2. Tingkat kemasakan fisiologis benih jeruk JC dicapai pada saat warna buah kuning lebih dari 90%, buah lunak, warna kulit benih krem kecoklatan dan warna embrio dominan krem.
3. Tingkat kemasakan benih tidak mempengaruhi persentase multiple seedling dan semaian off type.
4. Adanya multiple seedling dapat meningkatkan total semaian true to type jeruk JC .
5. Marka AG14 pada ukuran basa 170bp terpaut dengan marka morfologi LAMI < 0.75 dengan kemungkinan bias 40%.
6. Tipe daun tunggal, pupus daun hijau muda dan bentuk daun elliptic dengan pangkal daun cuncate, ujung daun obtusus dan tepi daun crenate secara umum dapat menjadi penanda morfologi semaian jeruk JC yang bersifat true to type. 7. Tipe daun trifoliata, warna pupus daun merah keunguan dan bentuk daun
lanceolate dengan ujung rounded dapat menjadi penanda morfologi semaian off type yang cukup efektif pada semaian jeruk JC.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan lot benih dengan persentase poliembrioni yang optimal pada jeruk batang bawah JC dan jeruk batang bawah yang lain. Analisis DNA dengan SSR perlu dilanjutkan dengan menggunakan primer lebih banyak sehingga diperoleh marka SSR yang terpaut erat dengan karakter morfologi yang dapat membedakan semaian true to type dan off type.