Analisis kimia dengan metode kromatografi didasarkan pada pemisahan komponen yang terpartisi diantara dua fase dalam suatu kesetimbangan dinamis dan mengalir. Proses ini dilakukan dengan menggerakkan suatu fase secara mekanis (fase gerak), relatif terhadap fase lainnya.
Menurut Gritter et al., (1991), secara teori pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, sehingga memastikan kesetimbangan yang baik antara fase. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak harus bergerak dengan cepat sehingga difusi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada sebagian besar system kromatografi digunakan penjerap atau penyangga berupa serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak lebih cepat melalui fase diam yang terbagi pada serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Dengan dipenuhinya kedua persayaratan tersebut,
diperoleh teknik kromatografi cair yang paling kuat yakni HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Jadi pada HPLC fase gerak dialirkan dengan cepat dan hasilnya dideteksi dengan instrumen.
Komponen utama dari system HPLC adalah pompa (tekanan tetap dan volume tetap), penginjeksi, kolom (ekternal dan internal), detektor, dan rekorder atau sistem data yang terintegrasi (Rounds dan Gregor, 2003). Parameter-parameter yang akan mempengaruhi system kerja pada HPLC antara lain diameter dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran lubang pada fase diam, dan tekanan pompa.
Terdapat lima tipe HPLC yaitu normal phase chromatography, reversed phase chromatography, ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography, dan affinity chromatography (Rounds dan Gregor, 2003). Pada penilitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase chromatography (RP-HPLC). Fase diam dari HPLC jenis ini adalah senyawa nonpolar, sedangkan pase geraknya polar. Karena hal tersebutlah maka komponen yang akan kelur dahulu adalah komponen yang polar dibandingkan yang nonpolar.
Lebih dari 70% teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang menggunakan metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian, analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan karbohidrat, dan penentuan unsur-unsur pokok dari miniman ringan. Reversed phase HPLC dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk menganalisis lemak (Rounds dan Gregor, 2003).
Antioksidan, seperti butylated hydroxylanisole (BHA) dan butylated hydroxytoluene (BHT), dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis dengan menggunakan detector UV dan fluoresens secara bersamaan. Bahan pangan basah, pigmen (seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin), dan komponen fenolik (seperti vanili) dapat pula dianalisis dengan menggunakan metode RP-HPLC (Rounds dan Gregor, 2003).
Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom
RP-HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan larutan basa (karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika). Kolom RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asam tapi tetapi tidak boleh kontak terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga agar tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan komponen. Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam kolom HPLC adalah dengan menginjeksikan campuran dari 2,2’- dan 4,4’-bipiridin. Bila terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa 2,2’-bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan diidentifikasi menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil yang tidak sesuai.
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan memberikan penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Flavonoid yang merupakan bagian dari senyawa fenolik, memiliki serapan pada panjang gelombang antara 240 dan 270 nm, dan antara 320 dan 380 nm. Untuk itulah, pada deteksi komponen fenolik, detektor yang digunakan pada komponen HPLC adalah detektorUV atau UV-Vis (Lee, 2000).
Fase gerak yang biasa digunakan dalam identifikasi senyawa fenolik dengan HPLC adalah metanol, acetonitril, dan tetrahidrofuran. Penggunaan tetrahidrofuran sebagai fase gerak dalam sistem HPLC, memberikan hasil pemisahan yang terbaik diikuti oleh acetonitril, dan terakhir metanol. Namun, pada identifikasi senyawa flavonoid, fase gerak yang biasa digunakan adalah metanol dan acetonitril. Tetrahidrofuran akan memberikan hasil yang sangat signifikan berbeda bila digunakan untuk mengidentifikasi asam sinamat dalam jus jeruk (Lee, 2000).
Analisis flavonoid pada sayuran seperti yang dikemukakan Hertog et al., (a) (1992) banyak diadopsi oleh para peneliti-peneliti lain (Lee, 2000). Identifikasi flavonoid pada sayuran dilakukan dengan menggunakan fase gerak 25% acetonitril dalam buffer fosfat 0.025M. laju alirannya adalah 0.9 ml/menit. Sampel yang akan diidentifikasi akan melewati kolom Nova-Pak C18, yang
memiliki dimensi (150 x 3.9-mm ID). Detektor yang digunakan yaitu Linear Model 204 UV-Vis detector (Hertog et al., (a) (1992).
Menurut Macrae (1988), keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap komponen dengan stabilitas panas yang terbatas ataupun yang bersifat volatil. HPLC merupakan metode yang sangat sensitif, tepat, selektif, dan memiliki tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga lebih sederhana dalam pengoperasiannya. Di samping itu, HPLC banyak digunakan untuk analisis karena kemudahan injeksi, deteksi dan pengolahan data serta dapat digunakan untuk berbagai macam sampel seperti sampel cairan, padatan yang dilarutkan, maupun sampel yang labil terhadap pemanasan. Modern HPLC telah banyak diaplikasikan seperti pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan penghitungan komponen yang bervariasi.
Menurut Adamson et al., (1999) HPLC merupakan metode yang efektif untuk mendeteksi dan menghitung komponen fenol dan metode ini telah digunakan secara luas. HPLC telah digunakan dalam menghitung prosianidin dalam kakao dan coklat.
Dalam penelitian lain Mark et al., (2005) mengungkapkan bahwa HPLC merupakan metode yang telah banyak digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa polifenol seperti flavonol dan proantosianidin.
III. BAHAN DAN METODE
A. BAHAN DAN ALAT