BAB IV. METODE PENELITIAN
4.5. Cara penelitian
4.5.3. Identifikasi struktur eurikumanon
Identifikasi struktur kimia dilakukan terhadap eurikumanon dan turunannya secara analisis spektroskopi dengan menggunakan :
a. Spektroskopi ultra violet (UV)
Eurikumanon dan turunannya dilarutkan di dalam metanol, kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV sehingga diperoleh spektra yang menggambarkan puncak absorbansi maksimum pada λ 200-800 nm. Spektra tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan adanya ikatan rangkap yang terdapat pada eurikumanon dan turunannya (Mistry, 2009; Pavia et al., 2009; Sastrohamidjojo, 2007).
b. Spektroskopi infra red (IR)
Eurikumanon dan turunannya dilarutkan di dalam metanol, kemudian diteteskan pada pellet KBr. Pellet KBr ini dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer IR.
Spektra yang dihasilkan menunjukkan adanya gugus fungsional di dalam struktur eurikumanon dan turunannya (Mistry, 2009; Pavia et al., 2009; Sastrohamidjojo, 2007).
c. Spektroskopi nuclear magnetic resonance (NMR)
Analisis spektroskopi NMR satu dimensi (1D) dan 2D dilakukan terhadap eurikumanon, sedangkan turunannya hanya dianalisis spektroskopi NMR satu dimensi (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT). Eurikumanon dan turunannya masing-masing dilarutkan di dalam metanol terdeteurisasi (CD3OD) lalu ditambahkan tetrametilsilan (TMS) sebagai standar internal. Larutan ini dimasukkan ke dalam pipet panjang yang terdapat pada instrumen NMR JEOL, sehingga muncul spektra pada pergeseran kimia tertentu.
Spektrum karbon NMR (13C-NMR) digunakan untuk menganalisis jumlah atom C, sedangkan spektrum 1H-NMR digunakan untuk mengetahui jumlah atom H pada struktur kimia eurikumanon dan turunannya.
d. Spektroskopi Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS)
Eurikumanon dan turunannya ditentukan berat molekulnya dengan dengan menggunakan alat Liquid Chromatography Mass Spectrometry Electro Spray Ionization Positive Ion (LC-MS ESI Pos Ion). Sampel eurikumanon dan turunannya dilarutkan di dalam metanol, kemudian diinjeksikan ke alat LC-MS ESI ion positif, kemudian akan muncul spektra yang menggambarkan berat molekulnya (Mistry, 2009; Pavia et al., 2009).
4.6. Semisintesis Turunan Eurikumanon
Secara umum semisintesis turunan eurikumanon adalah sebagai berikut:
eurikumanon sebanyak 50 mg (0,1225 mmol) dimasukkan ke dalam labu leher tiga yang telah dilengkapi dengan pendingin bola yang terhubung dengan air keran, termometer, corong penetes, pengaduk magnetik dan penangas es. Eurikumanon tersebut dilarutkan dengan piridin dingin 1 mL di dalam penangas es, sambil diaduk-aduk dengan menggunakan magnetic heat strirer (pengdiaduk-aduk magnetik). Setelah larut dengan sempurna ditambahkan tetes demi tetes senyawa farmakofor (metilbutirat, hidroksimetil butirat, kloroformat, etilkloroformat, benzoilklorida, klorobenzoilklorida, asetilklorida, klorasetil klorida, fluoroasetil klorida dan trifluoroasetil klorida) dalam jumlah yang sesuai yang sebelumnya telah dilarutkan di dalam 10 mL kloroform dingin dan diaduk-aduk selama 1 jam di dalam penangas es.
Campuran ini direfluks pada temperatur 500C – 550C selama ± 8 jam sambil dilakukan pemantauan hasil sintesis secara KLT setiap 2 jam. Bila hasil sintesis telah terbentuk, campuran tersebut didinginkan dengan merendam labu leher tiga di dalam air. Campuran diekstraksi dengan etilasetat 3 kali di dalam corong pemisah. Lapisan etilasetat dicuci dengan 10 mL air es sebanyak 3 kali, kemudian lapisan etilasetat ditambahkan natrium sulfat anhidrat dan disaring. Filtrat yang diperoleh dimurnikan dan dikeringkan. Hasil semisintesis selanjutnya ditentukan struktur kimianya secara analisis spektroskopi. Skema umum semisintesis turunan eurikumanon ditunjukkan pada Gambar 4.
5. ( T= 00C, aduk, 1 jam, penangas es
6. + Farmakofor (0,49 mmol) + 10 mL CHCl3 dingin
Aduk-aduk, refluks ± 8 jam, T= 500-55 0C, monitor (KLT) tiap 2 jam Ekstraksi, Etil asetat 3 x 10 mL
Lapisan Etil asetat dicuci dengan Akuades 3 x 10 mL Pisahkan lapisan Akuades dan Etil asetat
7. Loform
Gambar 4. Skema semisintesis turunan eurikumanon
Campuran Eurikumanon
(0,1225 mmol) + 1 mL piridin
dingin
Turunan eurikumanon Lapisan Etil asetat +
Na-Sulfat anhidrat Residu disaring dan dikeringkan
BAB 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Rencana Capaian Penelitian
Rencana capaian penelitian tahap I yaitu isolasi eurikumanon dari serbuk akar pasak bumi. Sasaran tersebut telah dicapai dan sesuai dengan rencana semula, meskipun terdapat beberapa hambatan dalam pelaksanaannya. Rencana capaian penelitian selanjutnya pada tahap II adalah semisintesis dan identifikasi struktur kimia turunan eurikumanon.
5.2. Hasil Penelitian dan Pembahasan
Hasil penelitian yang dicapai pada tahap I adalah : tersedianya senyawa eurikumanon sebagai bahan utama untuk semisintesis turunannya. Dalam penelitian ini isolasi eurikumanon telah berhasil dilakukan dan hasil semisintes turunannya seperti diuraikan di bawah ini:
5.2.1. Hasil isolasi eurikumanon dari serbuk akar pasak bumi
Proses isolasi eurikumanon dilakukan berdasarkan modifikasi dari Chan et al.
(2004) dan Kardono et al. (1991), yang diawali dengan pembuatan ekstrak akar pasak bumi secara maserasi dengan pelarut metanol. Ekstrak cair yang diperoleh divakum evaporasi pada temperatur 400C dan diperoleh ekstrak kental akar pasak bumi ± 50 g (5%). Keberadaan eurikumanon di dalam ekstrak dimonitor secara KLT dengan menggunakan plat aluminium silika gel GF254 yang dielusi dengan fase gerak kloroform : metanol : air (6,5 : 2,5 : 0,4) dengan pembanding eurikumanon standar dari Chromadex Inc. Hasil monitoring menunjukkan bahwa ekstrak akar pasak bumi mengandung eurikumanon berupa bercak berwarna ungu yang sejajar dengan bercak eurikumanon standar dari Chromadex Inc di bawah lampu UV pada λ 254 nm dengan nilai Rf 0,72 dan tidak berwarna pada λ 366 nm (Gambar 5).
Fraksinasi terhadap ekstrak akar pasak bumi, dilakukan secara KCV dengan menggunakan fase diam silika gel 60 dan fase gerak kloroform : metanol : air dengan ratio perbandingan 5:5:1; 3:7:1; 1:9:1. Tujuan dilakukannya fraksinasi adalah untuk mendapatkan eurikumanon yang terkonsentrasi pada fraksi tertentu. Pemantauan keberadaan eurikumanon dilakukan seperti pada ekstrak, hasilnya menunjukkan bahwa eurikumanon terkonsentrasi di dalam fraksi I dan II pada fase gerak kloroform:metanol:air (5:5:1). Kedua fraksi tersebut digabung dan dievaporasi, setelah
kering diperoleh fraksi terkonsentrasi eurikumanon (FE) sebanyak ± 20 g (2%). Profil KLT fraksi tersebut dapat dilihat pada Gambar 6.
Isolasi eurikumanon dari fraksi tersebut dilakukan secara KLT-p dengan menggunakan lempeng kaca silika gel 60 PF254 yang dielusi dengan fase gerak etilasetat : etanol : air (100 : 30 : 1). Monitoring keberadaan eurikumanon dilakukan seperti sebelumnya dan hasilnya memperlihatkan adanya pita berfluoresensi biru terang di bawah lampu UV pada λ 254 nm yang ditandai sebagai isolat 1 dan pita berwarna ungu ditandai sebagai isolat 2 (eurikumanon). Pada λ 366 nm isolat 1 berupa pita tunggal berfluoresensi biru terang, sedangkan isolat 2 tidak berpendar. Kedua isolat tersebut dikerok secara terpisah dan pemurnian terhadap isolat 2 dilakukan dengan cara yang sama dan hasilnya memperlihatkan ada dua pita yaitu berwarna ungu di bawah lampu UV pada λ 254 nm dengan nilai retensi faktor (Rf) = 0,72 dan tidak berwarna di bawah lampu UV λ 366 nm. Pita lain yang muncul pada λ 366 nm berwarna coklat muda yang ditandai dengan isolat 3. Setelah dilakukan pemisahan, kadar isolat 2 yang diperoleh ± 0,03 % dan profil KLT isolat 2 murni ditunjukkan pada Gambar 7.
EPB (254 nm) ES (254 nm) EPB (366 nm) ES (366 nm)
Gambar 5. Profil KLT EPB dan ES di bawah lampu UV pada λ 254 nm dan 366 nm dengan fase diam silika GF254 dan fase gerak kloroform : metanol : air (6,5 : 2,5 : 0,4). EPB = Ekstrak metanol akar pasak bumi; ES = Eurikumanon standar dari Chromadex Inc
FE (254 nm) E (254 nm) FE (366 nm) E (366 nm)
Gambar 7. Profil KLTp isolat 2 di bawah lampu UV pada λ 254 nm dengan fase diam silika gel 60 PF254 dan fase gerak yang terdiri dari etilasetat : etanol : air (70 : 30 : 2)
1 2
Gambar 6. Profil KLT FE dan ES di bawah lampu UV pada λ 254 dan 366 nm dengan fase diam silika GF254 dan fase gerak dari kloroform : metanol : air (6,5 : 2,5 : 0,4). FE = Fraksi eurikumanon; E = Eurikumanon standar dari Chromadex Inc; 1 = Isolat 1; 2 = Isolat 2
5.3. Identifikasi Struktur Kimia Isolat 2
Isolat 2 yang diduga sebagai eurikumanon diidentifikasi strukturnya melalui analisis spektroskopi UV, IR, NMR-1D dan 2D serta LC-MS ESI ion positif. Data berupa spektra UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT dan LC-MS ESI ion positif diperkuat dengan data analisis spektroskopi 2D yaitu, COSY, HMQC dan HMBC. Hasil interpretasi dibandingkan dengan data referensi eurikumanon yang diidentifikasi oleh peneliti lain seperti Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991); Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004) ternyata hasilnya ada kesesuaian.
5.3.1. Hasil interpretasi spektrum UV isolat 2
Spektrum UV isolat 2 memberikan serapan maksimum pada 237,5 nm (Gambar 8). Spektrum tersebut menjelaskan bahwa isolat 2 tidak banyak memiliki ikatan tidak jenuh, sehingga serapan energi elektromagnetiknya berada di daerah ultraviolet. Hal ini sejalan dengan profil KLT-p yang hanya berwarna ungu di bawah lampu UV pada 254 nm dan tidak berpendar pada 366 nm.
5.3.2. Hasil interpretasi spektrum IR isolat 2
Analisis spektrum IR isolat 2 (Gambar 9) memberi informasi berupa pita serapan pada bilangan gelombang tertentu (Tabel 1). Pita melebar pada 3379,29 menunjukkan bahwa isolat 2 memiliki gugus OH, sedangkan pita pada 1732,08 adalah serapan gugus karbonil (C=O) dari lakton. Hal ini dipertegas oleh pita pada 1055,06 yang mengindikasikan adanya gugus -C-O-C. Gugus keton (C=O) tidak jenuh α, β terlihat pada 1674,21 dan gugus C=C terdapat pada 1650.
Absorpsi ikatan rangkap Csp2-H (CH2 alifatik) yaitu gugus metilen terdapat pada 2980,02 dan dipertegas oleh serapan pada 1518,33. Gugus CH3 alifatik terdapat pada 2879,72 yaitu gugus metil dan diperkuat oleh adanya serapan pada 1381,03. Hasil analisis spektroskopi IR menyatakan bahwa isolat 2 memiliki gugus fungsional OH, C=O, -C-O-C-, C=C, -CH2 dan –CH3 pada struktur kimianya dan hal ini sesuai dengan struktur kimia senyawa eurikumanon. Gugus fungsi yang diperoleh pada penelitian ini ternyata sesuai dengan yang didapat oleh Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991);
Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004).
Tabel 1. Gugus fungsional isolat 2 berdasarkan spektrum IR No Bilangan gelombang (cm-1) Gugus fungsional
1. 3379,29 Hidroksil (OH)
2. 2980,02; 1518,33 Hidrokarbon alifatik (Csp2-H), -CH2
3. 2879,72; 1381,03 Hidrokarbon alifatik (Csp3-H), -CH3
4. 1732,08 C = O lakton
5. 1674,21 C = O keton tidak jenuh α, β
6. 1618,28 C = C
7. 1055,06 -C-O-C-
Gambar 8. Spektrum UV isolat 2
Gambar 9. Spektra IR isolat 2
5.3.3. Hasil interpretasi spektrum LC-MS ESI ion positif isolat 2
Kromatogram LC memberi informasi bahwa isolat 2 belum murni (Gambar 10).
Puncak pada waktu retensi 2,4 menit diduga berasal dari isolat 2. Analisis spektrum MS (Gambar 11) memberi informasi bahwa isolat 2 memiliki puncak ion molekul semu pada m/z 409,02 [M+H)+, sehingga bobot molekulnya adalah 408,02 dengan formula C20H24O9. Hal ini sesuai dengan yang diperoleh Chan et al. (1986); Kardono et al.
(1991); Tada et al. (1991) dan Kuo et al. (2004).
Hanifah Isolat 2 LC MS –ESI pos ion Vol injection 20 ul
Flow 1 ml/min
Eluent MeOH+Water = 90 + 10 Operating by : Puspa D N Lotulung
Gambar 10. Kromatogram LC isolat 2
Gambar 11. Spektrum MS isolat 2
5.3.4. Hasil interpretasi spektrum 1H-NMR isolat 2
Analisis spektroskopi NMR merupakan analisis yang sangat penting dalam menentukan kerangka struktur kimia suatu senyawa, karena spektra yang muncul memberi gambaran tentang jumlah dan jenis atom hidrogen maupun karbon (Pavia et al., 2009; Mistry, 2009). Identifikasi isolat 2 dilakukan secara spektroskopi NMR satu dimensi (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) dan dua dimensi (COSY, HMQC, HMBC).
Spektrum 13C-NMR isolat 2 (Gambar 12) memperlihatkan adanya 20 signal resonansi yang memberikan informasi adanya 20 atom karbon. Spektrum DEPT (Gambar 13) memberi informasi bahwa isolat 2 memiliki 8 atom karbon kuarterner, 7 gugus metin, 3 metilen dan 2 gugus metil. Secara garis besar data tersebut sesuai dengan struktur eurikumanon.
Signal yang paling downfield (δ 6,06, 1H) pada spektrum 1H-NMR (Gambar 14) merupakan resonansi proton posisi 3 cincin 3-sikloheksen-2on (cincin A). Dua signal masing-masing dengan tinggi integrasi 1H yang muncul pada δ 5,56 dan 5,44 berasal dari dua proton metilen terminal pada posisi 21 yang tidak ekivalen. Proton metin pada posisi 7 yang terikat pada oksigen δ-lakton yang muncul pada δ 4,80 (1H) berupa triplet (J = 2,6 Hz), karena mengadakan kopling dengan dua proton metilen pada posisi 6. Signal resonansi pada δ 4,73; 4,31; dan 3,96 masing-masing berupa singlet (1H) berturut-turut berasal dari proton metin hidroksi pada posisi 12; 1 dan 15. Dua buah doublet masing-masing dengan tetapan kopling 9,1 Hz dan tinggi integrasi 1H pada δ 3,89 dan 3,74 merupakan signal resonansi proton metilen yang tidak ekivalen pada cincin tetrahidrofuran posisi 20. Proton metin pada posisi 9 muncul singlet (1H) pada δ 3,07, sedangkan proton metin pada posisi 5 muncul sebagai doublet (broad) pada δ 3,03. Dua buah multiplet (1H) yang muncul pada δ 2,07 dan 2,34 merupakan signal resonansi dua proton metilen pada posisi 6, sedangkan 2 buah singlet (3H) pada δ 2,03 dan 1,20 berasal dari dua buah gugus metil pada posisi 18 dan 19.
5.3.5. Hasil interpretasi spektrum 13C-NMR isolat 2
Pada spektrum 13C-NMR, signal pada 198,95 dan 174,65 berturut-turut merupakan resonansi gugus karbonil keton pada posisi 2 dan karbonil lakton pada posisi 16. Resonansi empat karbon oleifenik pada posisi 3 dan 4 serta 13 dan 21 berturut-turut muncul pada δ 126,04; 165,26; 146,23; serta 121,64. Karbon metin hidroksi (C-1, C-12, C-14, dan C-15) memperlihatkan resonansinya berturut-turut pada δ 84,40; 80,92; 79,44 dan 71,82. Karbon metin hidroksi pada posisi 11 yang terikat pada oksigen tetrahidrofuran muncul pada δ 109,27. Signal resonansi karbon metin hidroksi yang terikat pada oksigen δ lakton muncul pada δ 77,19. Signal yang muncul
pada δ 53,21; 48,12 dan 46,58 berasal dari 3 karbon kuarterner pada posisi 8, 9 dan 10, sedangkan karbon metin (C-5), metilen (C-6) dan 2 karbon metil (C-18 dan C-19) berturut-turut muncul pada δ 42,90; 26,19; 23,01 dan 10,14.
Pada spektrum 1H-1H COSY (Gambar 15), adanya cross peak antara signal resonansi proton pada δ 5,43 dan 5,55; δ 3,73 dan 3,89 serta δ 2,02 dan 2,28 memperlihatkan adanya kopling geminal berturutturut antara H21a dengan H21b; H -20a dengan 20b dan 6a dengan 6b. Kopling visinal terdapat antara 5 dan H-6a serta H-7 dengan H-H-6a dan H-6b terlihat dengan adanya cross peak berturut-turut antara signal resonansi pada δ 3,03 dengan δ 2,02; δ 4,79 dengan δ 2,02 dan δ 2,28.
Verifikasi kerangka eurikumanon dapat dilihat pada spektrum HMQC (Gambar 16) yang menggambarkan korelasi antara 1H-13C dan beberapa korelasi penting yang mendukung kerangka karbon eurikumanon dapat dilihat pada Gambar 17 dan 18.
Keberadaan cincin sikloheksenon (cincin A) ditunjukkan dengan adanya korelasi antara signal resonansi H-3 dengan C-1, C-5 dan C-18; signal H-1 dengan C-2, C-5, C-9 dan C-10 serta H-5 dengan C-4. Adanya kopling sejauh tiga ikatan antara H-7 dengan C-5 dan C-9, H-6b dengan C-7 dan C-8 serta adanya long range coupling antara H-6b dengan C-9 memberi konfirmasi bahwa terdapat cincin sikloheksana (cincin B), sedangkan keberadaan cincin C (sikloheksena) yang mengandung metilen terminal ditunjukkan dengan adanya korelasi antara signal resonansi H-21a dengan C-14 serta korelasi antara H-21b dengan C-13 maupun C-C-14.
Korelasi antara H-15 dengan C-14 menunjukkan keberadaan cincin δ lakton (cincin D), sedangkan adanya kopling antara H-20a dengan C-7 dan C-14 dan antara H-20b dengan C-8, C-9 dan C-14 memberi informasi adanya cincin tetrahidrofuran (cincin E). Berdasarkan analisis spektroskopi tersebut di atas, maka dapat dipastikan bahwa isolat 2 adalah eurikumanon. Data yang diperoleh pada penelitian ini ada kemiripan dengan data yang dilaporkan Kardono et al. (1991); Kuo et al. (2004), Tada et al. (1991) dan Chan et al. (1986).
Gambar 16. Spectrum HMBC isolat 2 (eurikumanon)
Tabel 2. Perbandingan geseran kimia atom H pada spektrum 1H-NMR antara eurikumanon referensi dan isolat 2 dalam satuan ppm Posisi Tada
Catatan: Struktur kimia isolat 2 ditetapkan berdasarkan analisis spektra COSY, DEPT, HMBC and HMQC
Tabel 3. Perbandingan geseran kimia atom C pada spektrum 13C-NMR antara eurikumanon referensi dan isolat 2 dalam satuan ppm Posisi
Atom C
Tada C5H5N 75 MHz
Chan C5H5N 175 MHz
Ping CH CD3OD 75 MHz
Kardono C5H5N 175
Isolat 2 CD3OD 125
C-1 84,5 85,0 84,5 84,50 84,40
C-2 197,5 198,0 197,4 197,40 198,95
C-3 126,1 126,6 126,0 126,03 126,04
C-4 162,6 163,1 162,5 162,53 165,26
C-5 42,2 42,7 42,1 42,18 42,90
C-6 25,7 26,2 25,6 25,69 26,19
C-7 75,9 76,4 75,8 75,83 77,19
C-8 52,6 53,1 52,5 52,57 53,21
C-9 47,7 48,3 47,7 47,69 48,12
C-10 45,9 46,5 45,9 45,91 46,58
C-11 109,7 110,1 109,5 109,55 109,27
C-12 81 81,5 80,9 80,96 80,92
C-13 147.8 148,5 148,0 147,99 146,23
C-14 79,4 79,9 79,3 79,34 79,44
C-15 71,8 72,3 71,7 71,75 71,82
C-16 173,8 174,4 173,8 173,82 174,65
C-17 - - - - -
C-18 22,4 23 22,4 22,41 23,01
C-19 10,4 10,9 10,3 10,39 10,14
C-20 67,7 68,2 67,6 67,64 68,12
C-21 119,5 119,9 119,3 119,29 121,64
Table 7. Data 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC dan HMBC isolat 2 Catatan: Struktur kimia isolat 2 ditetapkan berdasarkan analisis spektra
COSY, DEPT, HMBC and HMQC
Table 4. Data 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC dan COSY isolat 2
Catatan : Struktur kimia isolat 2 ditetapkan berdasarkan analisis spektra COSY, DEPT, HMBC and HMQC
Berdasarkan analisis spektra UV, IR, LCMS-ESI ion positif, NMR, COSY, DEPT, HMQC dan HMBC, maka isolat 2 dinyatakan sebagai eurikumanon (Gambar 4) dengan formula C20H24O9, berat molekul 408,02 dan titik lebur 2540-2570C. Hal ini sesuai dengan eurikumanon yang diperoleh Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991); Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004).
5.4. Hambatan
Proses isolasi isolat 2 atau eurikumanon dilakukan secara kromatografi lapisan tipis preparatif (KLT-p) dengan menggunakan fase diam silika gel PF254 dan fase gerak etilasetat-etanol-air (100 : 30 : 1). Ketika dilakukan pemantauan di bawah lampu UV pada λ 254 nm diperoleh satu bercak berupa garis berwarna ungu dan tidak berpendar pada λ 366 nm. Akan tetapi pada λ 366 nm didapat senyawa lain yang berwarna coklat muda dan ditandai dengan isolat 3 . Isolat 3 ini sangat dekat dengan isolat 2 dan sangat sulit dipisahkan meskipun sudah dilakukan dengan metode multiple elution dan Simplex Lattice Design (SLD). Akhirnya pemisahan isolat 2 dari isolat 3 dilakukan dengan penggantian fase gerak kloroform – metanol - air (80 : 20 :1) dengan penambahan beberapa tetes asam klorida pekat.
Farmakofor yang digunakan pada semisintesis turunan eurikumanon pada proposal direncanakan menggunakan metilbutirat, hidroksimetil butirat, kloroformat, etilkloroformat, benzoilklorida, klorobenzoilklorida, asetilklorida, klorasetil klorida, fluoroasetil klorida dan trifluoroasetil klorida. Namun pada pelaksanaannya digunakan tionil klorida, asetil klorida, asam klorasetat, asam trikloro asetat, asam trifluoro asetat, asam propionat, butiril klorida, asam metil butirat, valeril klorida, isovaleril klorida, benzoil klorida, klorbenzoil klorida, para-metoksibenzoil klorida, nitrobenzoil klorida dan suksinat anhidrida. Hal ini disebabkan karena beberapa farmakofor sudah tidak diproduksi lagi.
5.5. Hasil Semisintesis Turunan Eurikumanon
Salah satu upaya untuk mendapatkan antimalaria baru turunan eurikumanon dengan potensi yang lebih baik dan tingkat keamanan yang tinggi, dapat dilakukan melalui modifikasi struktur senyawa eurikumanon sebagai senyawa penuntun. Pada penelitian ini digunakan 15 jenis farmakofor yaitu, tionil klorida, asetil klorida, asam klorasetat, asam trikloro asetat, asam trifluoro asetat, asam propionat, butiril klorida, asam metil butirat, valeril klorida, isovaleril klorida, benzoil klorida, klorbenzoil klorida, para-metoksibenzoil klorida, nitrobenzoil klorida dan suksinat anhidrida. Kromofor yang digunakan tidak sesuai dengan rencana awal seperti yang tercantum pada proposal, karena beberapa farmakofor sudah tidak diproduksi lagi, sehingga dilakukan penggantian dengan farmakofor lain. Jumlah turunan hasil semisintesis semuanya 15 dan ditambah dengan 1 senyawa penuntun yaitu eurikumanon, dengan demikian ada 16 senyawa yang akan diuji pada Hibah Insentif SINAS yang akan datang (2015).
Pada penelitian ini telah berhasil dilakukan substitusi pada kerangka eurikumanon dan dihasilkan 15 senyawa turunannya. Eurikumanon dan 15 senyawa
tersebut telah ditentukan strukturnya. Eurikumanon memiliki struktur molekul unik yang berbeda dengan antimalaria yang sudah ada. Senyawa ini tidak memiliki atom nitrogen dan mempunyai 5 gugus alkohol alisiklik. Gugus alkohol alisiklik ini dapat diesterifikasi dan eurikumanon ester yang terbentuk, diperkirakan dapat menurunkan polaritasnya sehingga akan memudahkan penetrasinya ke dalam membran lipid menuju target site pada reseptor yang terdapat pada Plasmodium. Reaksi esterifikasi terhadap eurikumanon dengan farmakofor tersebut diatas merupakan reaksi asilasi oksigen.
Atom H dari gugus OH alisiklik eurikumanon akan tersubstitusi dengan farmakofor yang digunakan dan esterifikasi ini dapat terjadi di beberapa gugus OH apabila tidak menggunakan gugus pelindung. Pada reaksi ini karbon karbonil dari asam karboksilat, asil klorida dan anhidrida asam karboksilat (farmakofor) sangat peka terhadap serangan atom H dari gugus OH alisiklik eurikumanon. Senyawa turunan eurikumanon yang dihasilkan dari proses esterifikasi dengan farmakofor tersebut diatas adalah sebagai berikut:
5.5.1. Eurikumanon diklorida (12,15- klor eurikumanon) a. Hasil semisintesis eurikumanon diklorida
Eurikumanon diklorida merupakan hasil semisintesis eurikumanon dengan tionil klorida yang berlangsung secara bertahap melalui reaksi Darzen. Hasil semisintesis diperoleh kristal tidak berwarna, bentuk segi empat, tidak berbau dengan titik lebur antara 254- 2560C. Formula eurikumanon diklorida adalah C20H18Cl2O5, BM 409,39.
Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata 60,10% dan diperkirakan mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon diklorida seperti pada Gambar 19.
b. Identifikasi struktur eurikumanon diklorida
Kromatogram LC memperlihatkan puncak eurikumanon diklorida dengan kemurnian 91,18% (Gambar 20). Puncak eurikumanon diklorida muncul pada waktu retensi 2,3 menit dan hasil analisis spektrum MS (Gambar 21) menunjukkan bahwa eurikumanon diklorida memiliki puncak ion molekul semu pada harga m/z 410,09 [M + H]+.
O
Gambar 19. Mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon diklorida
Gambar 20. Kromatogram LC eurikumanon diklorida (91,18%)
EurikumanonTionil klorida
Eurikumanon klorosulfat
Eurikumanon diklorida
91,18%
Gambar 21. Spektrum MS eurikumanon diklorida (m/z 410,0967)
5.5.2. Eurikumanon monoasetat (15-monoasetil eurikumanon) a. Hasil semisintesis eurikumanon monoasetat
Esterifikasi terhadap eurikumanon menggunakan asetil klorida, diawali dengan serangan atom H dari gugus OH alisiklik eurikumanon ke atom karbon karbonil asetil klorida yang sangat reaktif dan menghasilkan senyawa intermediet tetrahedral.
Selanjutnya pasangan elektron bebas dari oksigen memaksa keluar ion klorida (gugus pergi) dan menghasilkan eurikumanon monoasetat dengan formula C22H26O10, BM 450,03. Eurikumanon monoasetat yang dihasilkan berupa senyawa kolloid berwarna kuning muda, berbau khas dengan titik lebur antara 222- 2250C. Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata 55,25% dan diperkirakan mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monoasetat seperti pada Gambar 22.
b. Identifikasi struktur eurikumanon monoasetat
Kromatogram LC memperlihatkan puncak eurikumanon monoasetat dengan kemurnian 60,94% (Gambar 23). Puncak eurikumanon monoasetat muncul pada waktu retensi 3,0 dan hasil analisis spektrum MS (Gambar 24) menunjukkan bahwa eurikumanon monoasetat memiliki puncak ion molekul semu pada harga m/z 452,08 [M + 2H]+.
C-CH3
Gambar 22. Mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monoasetat
Gambar 23. Kromatogram LC eurikumanon monoasetat (60,94%)
0 4 8 12 16 20
Gambar 24. Spektrum MS eurikumanon monoasetat (m/z 452,0841)
5.5.3. Eurikumanon monoklor asetat (15- monoklor asetil eurikumanon) a. Hasil semisintesis eurikumanon monoklor asetat
Eurikumanon monoklor asetat merupakan hasil esterifikasi eurikumanon dengan asam klorasetat yang berlangsung pada suhu 00C. Produk yang dihasilkan memiliki formula C22H25ClO10, BM 484,56. Senyawa tersebut berupa senyawa kolloid berwarna coklat muda, berbau khas dengan titik lebur antara 224- 2270C. Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata 55,25% dan diperkirakan mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monoklor asetat adalah sebagai berikut (Gambar 25)
O
Gambar 25. Mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monoklor asetat
Asam klorasetatEurikumanon
Eurikumanon monoklor asetat
b. Identifikasi struktur eurikumanon monoklor asetat
Hasil analisis terhadap kromatogram LC, memberi informasi bahwa eurikumanon monoklor asetat hasil semisintesis (Gambar 26) memiliki kemurnian 35,36% pada puncak waktu retensi 1,9 menit. Hasil analisis spektrum MS (Gambar 27) memberi informasi bahwa senyawa tersebut memiliki puncak ion molekul semu pada harga m/z 485,56 [M + H]+.
Gambar 26. Kromatogram LC eurikumanon monoklor asetat (35,36%)
Gambar 27. Spektrum MS eurikumanon monoklor asetat (m/z 485,56)
0 3.4 6.8 10.2 13.6 17.0
Retention Time (Min)
0 580.3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
% Intensity
BPI=>NR(2.00) T1.9
T2.1
T8.4
T3.0 T3.8
35,36%
5.5.4. Eurikumanon monotriklor asetat (15- monotriklor asetil eurikumanon) a. Hasil semisintesis eurikumanon monotriklor asetat
Eurikumanon monotriklor asetat merupakan hasil esterifikasi eurikumanon dengan asam triklorasetat yang berlangsung di dalam penangas es. Produk yang dihasilkan memiliki formula C22H23Cl3O10, BM 553,89. Senyawa tersebut berupa senyawa kolloid berwarna coklat tua, bentuk segi empat pipih, berbau khas dengan titik lebur antara 226- 2280C. Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata 53,25%
dan diperkirakan mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monoklor asetat (Gambar 28) adalah sebagai berikut:
O
Gambar 28. Mekanisme reaksi semisintesis eurikumanon monotriklor asetat
b. Identifikasi struktur eurikumanon monotriklor asetat
Kromatogram LC memperlihatkan puncak eurikumanon monotriklor asetat memiliki kemurnian 66,49% (Gambar 29). Puncak eurikumanon monotriklor asetat muncul pada waktu retensi 1,9 menit dan hasil analisis spektrum MS (Gambar 30) menunjukkan bahwa eurikumanon monotrriklor asetat memiliki puncak ion molekul semu pada harga m/z 554,94 [M + H]+.
Eurikumanon Asam triklor asetat
Eurikumanon monotriklor asetat
Gambar 29. Kromatogram LC eurikumanon monotriklor asetat (66,49%)
Gambar 30. Spektrum MS eurikumanon monotriklor asetat (m/z 554, 94)
5.5.5.Eurikumanon monotrifluoro asetat (15- monotrifluoro asetil eurikumanon) a. Hasil semisintesis eurikumanon monotrifluoro asetat
Eurikumanon monotrifluoro asetat merupakan hasil esterifikasi eurikumanon dengan asam trifluoro asetat yang berlangsung pada suhu 00C. Produk yang
Eurikumanon monotrifluoro asetat merupakan hasil esterifikasi eurikumanon dengan asam trifluoro asetat yang berlangsung pada suhu 00C. Produk yang