METODE PENELITIAN A.Jenis Penelitian
E. Identifikasi Variabel
1. Variabel bebas : Ekstrak daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.). 2. Variabel terikat: Hambatan pertumbuhan Streptococcus β hemolyticus. 3. Variabel luar :
a. Variabel terkendali : Proses ekstraksi.
b. Variabel tak terkendali : Umur tanaman, asal tanaman, dan musim.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user F. Definisi Operasional Variabel
1. Ekstrak daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.)
Ekstrak daun pacar kuku yang digunakan berasal dari hasil ekstraksi daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) dengan metode maserasi di Jurusan Farmasi Fakultas MIPA UNS. Ekstrak ini diencerkan dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% menggunakan larutan etanol 70%, dengan memakai perbandingan massa ekstrak daun pacar kuku (gr) tiap ml aquadest. Skala pengukuran variabel ini menggunakan skala rasio.
2. Hambatan pertumbuhan bakteri
Pertumbuhan bakteri dapat dilihat dari penambahan jumlah koloni pada media agar. Hambatan pertumbuhan bakteri itu diartikan baik dalam arti membunuh maupun membuat bakteri menjadi dorman. Hambatan ini dapat dilihat dari zona hambatan yang terbentuk pada pertumbuhan koloni Streptococcus β hemolyticus pada media agar darah plate yang diberi disk saring ekstrak daun pacar kuku. Sebagai kontrol positif adalah disk antibiotik Ceftriaxone 10 µg. Disk antibiotik Ceftriaxone 10 µg dipilih sebagai kontrol positif karena didapatkan paling sensitif setelah dibandingkan sensitivitasnya dengan beberapa antibiotik lainnya yang sering digunakan dalam pengobatan tonsilo-faringitis di pelayanan klinik (Eritromisin 10 µg, Penisilin 10 µg, dan Amoxicillin 10 µg). Skala pengukuran variabel ini adalah skala rasio.
3. Variabel Luar
a. Proses pengekstraksian merupakan variabel yang dapat dikendalikan. Faktor pengekstraksian ini dapat dikendalikan dengan proses maserasi sama.
b. Umur daun, asal tanaman, dan musim merupakan varibel-variabel yang tidak dapat dikendalikan. Faktor-faktor tersebut dapat mempengaruhi kandungan yang ada dalam daun pacar kuku.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user 20 G.Rancangan Penelitian Keteranan: Cakram Kosong (Kontrol Negatif) Ekstrak Etanol Pacar Kuku Cakram Suspensi Bakteri Streptococcus β Hemolyticus Standar Mc Farland 0,5 Agar darah, 37˚C, inkubasi 24 jam Ukur Diameter Zona Hambatan 50 % 75% 100% Cakram Cakram Spesimen Swab Tonsil/Faring dalam Kaldu Pepton Darah
Pengecatan Gram (Mikroskopik)
Agar darah, 37˚C, 24 jam (kultur & tes hemolise)
Tes katalase
Keterangan:
: Kontrol negatif
: Kontrol positif (Ceftriaxone dipilih setelah diadakan uji sensitivitas) : Kelompok perlakuan : Media pembenihan 25 % Cakram Cakram Antibiotik Ceftriaxone (Kontrol Positif)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user H.Instrumen dan Bahan Penelitian
1. Alat untuk kultur dan uji spesimen serta pemeriksaan uji aktivitas antibakteri:
a. Object glass b. Lampu spiritus c. Osche kolong steril d. Kapas alkohol e. Osche jarum f. Kapas lidi steril g. Jangka sorong h. Mikroskop i. Inkubator
2. Bahan untuk kultur dan uji spesimen:
a. Spesimen swab faring dari penderita faringitis b. Pewarna gram
c. Larutan aquadest d. Larutan NaCl 0,9% e. H2O2 3%
f. Media agar darah g. Kaldu pepton darah h. Disk kertas saring i. Agar Mc Conkey
3. Bahan untuk pemeriksaan uji aktivitas antibakteri:
a. Biakan bakteri Streptococcus β hemolyticus dari kultur spesimen dalam pembenihan agar darah 37˚C dalam waktu 24 jam.
b. Standart 0,5 McFarland c. Media agar darah plate
d. Ekstrak daun pacar kuku dalam disk kertas saring dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%
e. Disk antimikroba Eritromisin 10 µg, Penisilin 10 µg, Amoxicillin 10 µg, dan Ceftriaxone 10 µg.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
22 I. Cara Kerja
1. Persiapan Awal
Alat-alat yang akan digunakan secara steril dicuci bersih, kemudian dikeringkan dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
2. Pengambilan spesimen
Spesimen diambil dari swab tonsil atau faring penderita tonsilo-faringitis yang berkunjung ke Rumah Sakit Dokter Moewardi, hasil swab kemudian dicelupkan ke media transpor kaldu pepton darah, lalu diinkubasi selama 18-24 jam dalam suhu 37 oC.
3. Pengulturan spesimen dan uji hemolise
Spesimen dari kaldu pepton darah kemudian dikultur dalam agar darah dengan menggoreskan osche kolong yang telah dicelupkan ke dalam kaldu pepton darah, kemudian dieramkan pada inkubator 37˚C selama 24 jam. Setelah itu dilihat koloni yang tumbuh dan zona hemolisanya. Streptococcus β hemolyticus akan menunjukkan zona hemolisa yang jernih di sekitar koloni (Warsa, 1993).
4. Pemeriksaan mikroskopik
Setelah bakteri ditanam dalam agar darah, beberapa koloni bakteri diambil untuk dijadikan preparat pengecatan gram. Kemudian preparat dicat dengan metode pewarnaan gram, Streptococcus pada pembenihan yang baru akan berwarna ungu, kokus, berdiameter 0,5-1µm, dalam bentuk rantai yang khas, kokus agak memanjang pada arah sumbu rantai. Panjang rantai bervariasi dan sebagian besar ditentukan oleh faktor lingkungan. Rantai akan lebih panjang pada media cair dibanding pada media padat. Pada pertumbuhan tua atau kuman yang mati sifat gram positifnya akan hilang dan menjadi gram negatif. Streptokokus patogen jika ditanam dalam perbenihan cair atau padat yang cocok sering membentuk rantai panjang yang terdiri dari 8 buah kokus atau lebih (Warsa, 1993).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user 5. Uji katalase
Streptococcus tidak menghasilkan katalase (Khan, 2009). Jadi dalam percobaan katalase Streptococcustidak menghasilkan gelembung gas. Ini akan membedakannya dengan Staphylococcus.
6. Persiapan Ekstrak daun pacar kuku
Ekstrak daun pacar kuku didapatkan dengan cara merendam serbuk daun pacar kuku selama 24 jam pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Hasil rendaman disaring dengan kain flanel steril. Kemudian diuapkan sampai terbentuk massa ekstrak. Sebelum digunakan, ekstrak diperiksa sterilitasnya dengan menggunakan media agar darah plate dan Mc Conkey. Kemudian diinkubasi dalam waktu 24 jam dengan suhu 37˚C. Bila tidak ditemukan pertumbuhan kuman, maka ekstrak dinyatakan steril dan siap untuk digunakan. Ekstrak yang telah siap digunakan diencerkan dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% dengan menambahkan larutan aquadest steril. Pengenceran ini dengan perbandingan massa ekstrak daun pacar kuku (gr) tiap ml pelarut aquadest steril.
7. Persiapan disk kertas saring ekstrak daun pacar kuku
Disk kertas saring ditetesi dengan ekstrak daun pacar kuku hingga jenuh dalam konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%, kemudian dibiarkan selama 10 menit dalam cawan petri steril dan diulang sekali lagi.
8. Pembuatan Suspensi Bakteri
Beberapa oshe bakteri diambil dari biakan agar darah, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi kaldu pepton, dan dikocok sampai homogen. Kemudian dibandingkan dengan suspensi Mc Farland 0,5. Bakteri diambil dengan kapas lidi steril, digoreskan dengan merata pada media agar darah di seluruh permukaan media. 9. Pelaksanaan Uji Bakteri
Pertama, pada media agar darah plate yang telah dioleskan mikroorganisme dibiarkan dahulu lima menit supaya mengering.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
24 Masing-masing agar darah yang telah diolesi mikroorganisme diberikan empat disk perlakuan dan dua disk kontrol. Kelompok perlakuan terdiri dari disk ekstrak daun pacar kuku 25%, disk ekstrak daun pacar kuku 50%, disk ekstrak daun pacar kuku 75%, dan disk ekstrak daun pacar kuku 100%. Sedangkan kelompok kontrol terdiri dari disk aquadest sebagai kontrol negatif dan disk antibiotik Ceftriaxone 10 µg sebagai kontrol positif. Selain itu, dalam agar darah tersebut juga diletakkan tiga disk antibiotik lain untuk tes resistensi. Jadi, total ada sembilan perlakuan yang akan diberikan pada satu media pembenihan agar darah. Disk-disk tersebut diletakkan pada permukaan media pembenihan. Disk ditekan dengan menggunakan pinset pada permukaan lempengan sehingga terdapat kontak yang baik antara disk dengan lempengan agar darah. Disk tidak perlu ditekan kuat-kuat karena dapat melukai permukaan agar. Disk-disk tersebut ditempatkan dengan jarak terpencar pada media plate agar tersebut dan dicatat jenis antimikrobanya. Kemudian dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37˚C selama 24 jam. Pengujian senyawa antibakteri dilakukan setelah pengeraman dengan mengukur diameter zona hambatan yang terjadi dengan jangka sorong dalam satuan milimeter (mm).