Percobaan II. Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis klon 143 yang berumur 1, 2, dan 3 minggu
1. Induksi Kalus Sel Endosperma Waktu Pembentukan Kalus
Induksi kalus dari cairan endosperma yang menempel pada biji mangga varietas Arumanis merupakan tahapan awal dari percobaan embriogenesis sel endosperma. Komposisi media dasar dan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang terdapat dalam media tersebut juga ikut menentukan keberhasilan induksi kalus. Hasil percobaan induksi kalus dari sel endosperma yang telah dilakukan menunjukkan bahwa eksplan yang dikulturkan dalam media induksi mulai menunjukkan pembentukan kalus sel endosperma pada umur 3 minggu setelah tanam (MST) yaitu pada media BA2 dengan umur buah 3 minggu (U3). Pada umur 3 – 14 minggu setelah tanam (MST), kalus banyak bermunculan, tetapi ada beberapa eksplan yang pertumbuhannya lambat (Tabel 5).
Tabel 5. Selang waktu pembentukan kalus sel endosperma mangga varietas Arumanis klon 143 sampai 20 MST (Minggu Setelah Tanam)
Media Selang waktu pembentukan kalus (MST)
U1 U2 U3 MA1 - - 8-14 MA2 11-12 7 6-7 MA3 4 12 6-8 MA4 - 8-12 - MA5 - - - BA1 - 7 6 BA2 - - 3-6 BA3 - - - BA4 4 - 4-6 BA5 - - 6-13
Ket : - : tidak tumbuh, U1 : buah umur 1 minggu, U2 : buah umur 2 minggu, U3 : buah umur 3 minggu, MST : minggu setelah tanam
Pada eksplan yang berasal dari buah yang berumur 1 minggu (U1), kalus baru terbentuk pada 4 MST pada media MA3 dan BA4. Sedangkan pada buah yang berumur 2 minggu (U2), kalus baru terbentuk setelah 7 MST pada media MA2 dan BA1 (Tabel 5). Dengan demikian eksplan yang berasal dari buah yang
22 berumur 3 minggu lebih baik digunakan sebagai sumber eksplan dibandingkan dengan umur buah 1 dan 2 minggu untuk induksi kalus sel endosperma.
Eksplan yang berasal dari buah yang berumur 3 minggu (U3), mengalami
induksi kalus pada hampir pada semua komposisi media BA dengan waktu pembentukan yang cenderung cepat. Penambahan glutamin dan 2,4-D menunjukkan percepatan pembentukan kalus. Hasil ini sesuai dengan hasil
penelitian Shirin et al. (2007) yang melaporkan bahwa 2,4-D dalam media kultur
dapat mempercepat terjadinya induksi kalus. Menurut Raghavan (1986), auksin meningkatkan kuantitas sel-sel embriogenik dengan cara memacu pembelahan sel untuk membentuk massa proembriogenik, serta mencegah inisiasi pertumbuhan yang teratur pada sel-sel tersebut.
Persentase Eksplan yang Membentuk Kalus
Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase eksplan yang membentuk kalus terbesar berdasarkan jumlah eksplan yang hidup diperoleh dari buah yang berumur 3 minggu (U3) sebesar 26,3%, yang berbeda nyata dengan buah yang
berumur 1 dan 2 minggu (U1 dan U2) yang hanya mencapai 3,9% dan 8,3%
(Tabel 6). Persentase eksplan yang membentuk kalus berdasarkan jumlah eksplan yang ditanam yang terbesar juga diperoleh dari buah yang berumur 3 minggu (U3) yaitu 14 % (Tabel 6).
Tabel 6. Persentase pembentukan kalus pada eksplan dari buah mangga Arumanis klon 143 umur 1, 2 dan 3 minggu
Umur Buah Persentase eksplan membentuk kalus (%)
JET JEH
1 minggu 2.8b 3.9b
2 minggu 3.8b 8.3b
3 minggu 14a 26.3 a
Ket : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT dengan α=5%.
JET : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang ditanam JEH : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang hidup
Pada eksplan sel endosperma yang berasal dari buah yang berumur 3 minggu (U3), kalus dapat terbentuk di 7 media perlakuan dengan persentase eksplan yang membentuk kalus terbanyak diperoleh pada media MA2 yaitu
23 62.5%. Eksplan yang berasal dari buah yang berumur 1 minggu (U1) hanya tumbuh pada 3 media yaitu MA2, MA3 dan BA4 sedangkan eksplan yang berasal dari buah yang berumur 2 minggu (U2) hanya tumbuh pada 4 media yaitu MA2, MA3, MA4 dan BA1 (Gambar 7). Endosperma dari buah mangga yang berumur 3 minggu merupakan eksplan yang optimal untuk diinduksi menjadi kalus. Hal ini diduga karena pada umur 3 minggu, buah mangga memiliki vigor yang lebih baik dibandingkan dengan buah yang berumur 1 dan 2 minggu. Buah yang berumur 3
minggu memiliki mesocarp yang tebal serta ukuran biji yang lebih besar. Selain
itu, buah yang berumur 3 minggu lebih mudah disimpan sebelum dilakukan percobaan. Buah mangga yang berumur 3 minggu tidak cepat rusak atau busuk sedangkan buah mangga yang berumur 1 dan 2 minggu, eksplan lebih cepat rusak dan busuk.
Gambar 7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai dengan 20 MST
Hasil pengamatan pembentukan kalus berdasarkan jumlah eksplan yang hidup (Gambar 7) menunjukkan bahwa media MA2 dan MA3 berhasil menginduksi kalus sel endosperma pada semua umur eksplan (1, 2 dan 3 minggu) dengan persentase eksplan membentuk kalus terbesar diperoleh pada media MA2 pada umur buah 3 minggu (U3) yaitu 62.5%. Respon ini diduga karena pengaruh
perlakuan kombinasi antara BAP dan NAA. Wulandari et al. (2004) menyatakan
24
BA pada media induksi kalus pada eksplan daun tanaman jeruk manis (Citrus
sinensis L.) telah mencapai keseimbangan yang tepat sehingga sel – sel terinduksi
lebih cepat untuk melakukan pembelahan terus menerus dan dihasilkan kalus yang lebih besar dan banyak.
Pada media MA1, kalus hanya terbentuk pada eksplan dari buah yang berumur 3 minggu (U3) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar 46%. Pada media MA4, kalus hanya terbentuk pada eksplan dari buah yang berumur 2 minggu (U2) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar 33.34%. Pada semua umur eksplan, media MA5 tidak mampu menginduksi pembentukan kalus endosperma (Gambar 7). Konsentrasi 2,4-D (0.25 mg/l) yang lebih rendah dibandingkan dengan BAP yaitu 1.125 mg/l diduga sebagai penyebabnya. Wattimena (1992) menyatakan bahwa untuk pembentukan kalus dibutuhkan konsentrasi auksin yang tinggi dengan konsentrasi sitokinin yang rendah.
Persentase eksplan membentuk kalus terbesar pada media BA diperoleh pada media BA2 pada eksplan dari buah yang berumur 3 minggu (U3) yaitu 58.33%. Hal ini diduga karena adanya kombinasi antara BAP dan 2,4-D yang sesuai untuk induksi kalus. Pada media BA1, induksi kalus terbentuk pada eksplan dari buah yang berumur 2 dan 3 minggu (U2 dan U3) dengan persentase eksplan membentuk kalus masing – masing sebesar 25% dan 11.11%. Pada media BA4, induksi kalus terbentuk pada eksplan dari buah yang berumur 1 dan 3 minggu (U1 dan U3) dengan persentase tertinggi pada U3 yaitu sebesar 50% sedangkan media BA5 hanya menginduksi kalus pada eksplan dari buah yang berumur 3 minggu (U3) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar 22.22%. Pada semua umur eksplan (1, 2 dan 3 minggu), media BA3 tidak mampu menginduksi pembentukan kalus endosperma (Gambar 7).
Konsentrasi BAP yang terdapat pada media BA diduga mempengaruhi persentase kalus yang dihasilkan. Pada media BA2 dan BA4, konsentrasi BAP yang digunakan sebesar 0.2 mg/l sedangkan pada media BA3 dan BA5 konsentrasi BAP yang digunakan sebesar 0.4 mg/l. Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh bahwa persentase eksplan membentuk kalus lebih banyak diperoleh pada konsentrasi BAP yang lebih rendah yaitu 0.2 mg/l. Leksonowati
25 dan Witjaksono (2011) menyatakan bahwa pembentukan kalus pada inokulum daun kentang hitam menurun dengan meningkatnya konsentrasi BA dalam medium. Persentase pembentukan kalus tertinggi (100%) didapat pada medium dengan BA terendah (0,1 mg/l).
Hasil pengamatan pembentukan kalus berdasarkan jumlah eksplan yang ditanam (Tabel 7) menunjukkan bahwa persentase eksplan membentuk kalus terbesar diperoleh pada media MA2 dan MA3 dengan umur buah 3 minggu yaitu 28%. Pada media BA, persentase eksplan membentuk kalus terbesar diperoleh pada media BA2 dari buah yang berumur 3 minggu yaitu 27.67%.
Tabel 7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai dengan 20 MST
Jenis Media
Persentase eksplan membentuk kalus (%) umur buah
1 minggu 2 minggu 3 minggu
JET JEH JET JEH JET JEH
MA1 0.00 0.00 0.00 0.00 16.67 46.00 MA2 11.00 20.00 11.00 16.67 28.00 62.50 MA3 11.00 16.67 5.67 16.67 28.00 45.84 MA4 0.00 0.00 11.33 33.34 0.00 0.00 MA5 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 BA1 0.00 0.00 6.00 25.00 5.67 11.11 BA2 0.00 0.00 0.00 0.00 27.67 58.33 BA3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 BA4 5.67 8.33 0.00 0.00 22.33 50.00 BA5 0.00 0.00 0.00 0.00 11.33 22.22
Ket : JET : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang ditanam JEH : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang hidup
Kalus dari sel endosperma yang dihasilkan pada media perlakuan dan umur buah yang berbeda tidak semuanya bersifat embriogenik. Kalus embriogenik ditunjukkan dengan warnanya yang krem kekuningan berstruktur
remah (friable) dan ditemukan adanya sel globular (Gambar 8A). Berdasarkan
hasil pengamatan, ditemukan bahwa kalus yang terbentuk pada buah yang berumur 1 minggu (U1) tidak ada yang bersifat embriogenik dan kalus yang dihasilkan berubah warna menjadi coklat kehitaman (Gambar 8B). Hal ini disebabkan karena terbentuknya senyawa fenolik. Senyawa ini sangat toksik bagi
26 tanaman dan dapat menghambat pertumbuhan. Penanggulangan pengaruh negatif dari senyawa ini dapat dikurangi dengan melakukan subkultur kalus ke media baru.
A
B
Gambar 8. Kalus yang berasal dari eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 (A) : Kalus yang embriogenik dan (B) : kalus yang tidak embriogenik
Kalus yang dihasilkan oleh eksplan dari buah yang berumur 2 minggu (U2) dan 3 minggu (U3) tidak semuanya embriogenik. Gambar 9 menunjukkan bahwa eksplan dari buah yang berumur 3 minggu, yang ditanam pada media MA3 menghasilkan persentase kalus embriogenik tertinggi yaitu 37.5%.
Gambar 9. Persentase kalus embriogenik dari eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 pada berbagai media perlakuan pada 20 MST
27 Berdasarkan hasil pengamatan dapat dilihat bahwa meskipun nilai persentase jumlah eksplan membentuk kalus pada media MA2 (B5 makro + MS
mikro + 0,2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l GA3 + 3 % sukrosa) tertinggi,
namun persentase kalus embriogenik yang diperoleh lebih rendah dibandingkan dengan media MA3 ((B5 makro + MS mikro + 0,2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA +
0,5 mg/l GA3 + 3 % sukrosa). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa media
MA3 merupakan media yang optimal untuk menginduksi kalus embriogenik. Leksonowati dan Witjaksono (2011) menyatakan bahwa penambahan NAA pada konsentrasi 0,1 mg/l dan 1 mg/l pada medium BA, cenderung meningkatkan
persentase survival inokulum daun dari tunas kentang hitam in vitro pada
konsentrasi BA rendah (0,1 mg/l), tetapi tidak berpengaruh nyata pada medium dengan BA lebih tinggi (0,5–5 mg/l). Peningkatan konsentrasi NAA pada medium dengan BA meningkatkan persentase inokulum membentuk kalus, terutama pada medium dengan konsentrasi BA rendah. Peningkatan NAA pada medium tidak hanya meningkatkan persentase inokulum membentuk kalus tetapi juga
banyaknya kalus yang terbentuk. Persentase pembentukan kalus tertinggi (100%)
didapat pada medium dengan NAA tertinggi (1 mg/l) dan BA terendah (0,1 mg/l).