INDUKSI EMBRIOGENESIS IN VITRO SEL
ENDOSPERMA MANGGA (Mangifera indica L.)
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis saya yang berjudul Induksi Embriogenesis In Vitro Sel Endosperma Mangga (Mangifera indica L.) Varietas Arumanis Klon 143 adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk karya apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2012
Helsya Ratna Sari
NRP A253080021
ABSTRACT
HELSYA RATNA SARI. In Vitro Embryogenesis Induction from Endosperm Cells of Mango var. Arumanis clon 143 (Mangifera indica L.). Supervised by NI MADE ARMINI WIENDI and WINARSO DRAJAD WIDODO.
Mango Arumanis (Mangifera indica L) is a diploid plant with 2n=2x=40 chromosome. Embryogenesis from endosperm cells is the one opportunity to produce seedless triploid plant in mango Arumanis. The objective of this research are to obtain the optimum age of endosperm of mango seed for embryogenesis induction and to obtain the optimum medium for embryogenesis induction. This research conducted with 3 experiment are : (1) embryogenic callus induction from endosperm cells; (2) callus proliferation and (3) maturation of somatic embryo. Endosperm cells from different age of immature seed are : 1 week old, 2 weeks old and 3 weeks old from the initial fruit set was cultured in 10 medium compotition with several plant growth regulators and organic compound to induce embryogenic calli. Result of this research are : (1) Three weeks old endosperm cells from immature seed showed the best results for callus induction with percentage 26.28%, (2) Medium MA3 (B5 macro + MS micro + 0,2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA + 0,5 mg/l GA3 + 3% sucrose) was the best medium for callus
induction and somatic embryo development.
Keywords : mango. arumanis, endosperm cell, embryogenesis
RINGKASAN
HELSYA RATNA SARI. Induksi Embriogenesis In Vitro Sel Endosperma Mangga (Mangifera indica L.) Varietas Arumanis Klon 143. Dibimbing oleh NI MADE ARMINI WIENDI and WINARSO DRAJAD WIDODO.
Mangga (Mangifera indica L.) merupakan salah satu jenis buah tropika yang banyak digemari oleh masyarakat. Salah satu varietas mangga yang sangat potensial untuk dikembangkan yaitu varietas Arumanis. Mangga Arumanis memiliki beberapa keunggulan yaitu aroma yang khas serta rasanya yang manis dan segar serta ukuran buahnya yang tergolong besar dengan bobot rata–rata 400 g/buah. Namun, ukuran biji yang besar, hampir mencapai ¼ bagian dari keseluruhan bagian buahnya mengurangi ketebalan daging buahnya.
Perakitan tanaman triploid diharapkan dapat menghasilkan buah mangga
seedless, sehingga dapat meningkatkan kualitas buahnya. Perakitan tanaman
triploid dapat dilakukan secara konvensional dengan melakukan persilangan antara tanaman induk tetraploid dengan tanaman diploid. Namun hal ini sulit dilakukan karena tingkat gugur bunga dan buah yang tinggi. Selain itu masa juvenil mangga cukup panjang yaitu 3-5 tahun sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama jika perakitan dilakukan secara konvensional.
Cara lain yang dapat dilakukan untuk memperoleh tanaman triploid yaitu melalui embriogenesis sel endosperma secara in vitro. Endosperma merupakan hasil penggabungan dari satu sel gamet jantan dengan dua inti polar. Endosperma umumnya terdapat pada tanaman angiospermae yang berfungsi sebagai nutrisi bagi pertumbuhan embrio zigotik. Kultur sel endosperma secara in vitro pada mangga Arumanis diharapkan dapat menghasilkan tanaman triploid dengan jumlah kromosom 3n = 3x = 60.
Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mempelajari umur buah mangga Arumanis yang tepat untuk induksi embriogenesis sel endosperma, (2) mempelajari media yang optimal untuk menginduksi embriogenesis sel endosperma mangga Arumanis, dan (3) memperoleh umur buah yang tepat dan jenis media yang optimal dalam menginduksi embriogenesis sel endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 secara in vitro.
Penelitian ini terdiri atas dua tahap percobaan yaitu : 1) Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis yang berumur 3 minggu dan 2) Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis klon 143 yang berumur 1, 2 dan 3 minggu. Penelitian pertama merupakan penelitian pendahuluan dengan menggunakan eksplan dari buah mangga yang berumur 3 minggu. Bagian biji yang digunakan yaitu embrio zigotik, nuselus dan endosperma. Media yang digunakan terdiri atas 10 macam media yaitu MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, BA1, BA2, BA3, BA4 dan BA5. Percobaan kedua terdiri atas beberapa tahapan pelaksanan yaitu : 1) Induksi kalus sel endosperma, 2) Proliferasi kalus embriogenik, 3) Pendewasaan embrio.
baik pada eksplan nuselus maupun eksplan endosperma. Hasil penelitian II menunjukkan bahwa induksi kalus dari sel endosperma mangga yang terbaik, terjadi pada eksplan dari buah yang berumur 3 minggu, media MA3 (B5 makro + MS mikro + 0.2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA + 0.5 mg/l GA3 + 3 % sukrosa)
merupakan media yang optimal untuk menginduksi kalus embriogenik dari sel endosperma dan untuk perkembangan embrio somatik.
Kata kunci : mangga arumanis, sel endosperma, embriogenesis
©Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta Dilindungi Undang – Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan sebagian pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa seijin IPB.
INDUKSI EMBRIOGENESIS IN VITRO SEL
ENDOSPERMA MANGGA (Mangifera indica L.)
VARIETAS ARUMANIS KLON 143
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
LEMBAR PENGESAHAN
Judul Tesis : Induksi Embriogenesis In Vitro Sel Endosperma Mangga
(Mangifera indica L.)Varietas Arumanis Klon 143 Nama : Helsya Ratna Sari
NRP : A253080021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Ni Made Armini Wiendi, M.S. Dr. Ir. Winarso Drajad Widodo, M.S. Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Dekan Sekolah Pascasarjana Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, M.Sc. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc.
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT atas
anugerahNya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Tesis
ini berjudul Induksi Embriogenesis In Vitro Sel Endosperma Mangga (Mangifera
indica L.) Varietas Arumanis Klon 143. Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada :
1. Dr. Ir. Ni Made Armini Wiendi, M.S. dan Dr. Ir. Winarso Drajad Widodo,
M.S. selaku komisi pembimbing atas bimbingan dan arahannya selama
perencanaan, pelaksanaan, dan penulisan tesis.
2. Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc. selaku dosen penguji luar komisi dan
Dr. Ir. Darda Efendi, M.Si selaku perwakilan program studi atas masukan,
kritik, dan saran untuk kesempurnaan penyusunan tesis.
3. Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, M.Sc. selaku ketua Mayor Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman IPB, seluruh staf pengajar dan semua teknisi yang
telah memberikan bantuan selama penulis belajar di IPB.
4. Kelompok Tani Indramayu, Jawa Barat, Kebun Koleksi Cukur Gondang,
Pasuruan, Jawa Timur, teman – teman di Laboratorium Kultur Jaringan II IPB,
dan Bapak Joko Mulyono, Laboratorium Mikroteknik IPB atas bantuannya
selama penelitian.
5. Program RUT, KEMENRISTEK atas nama Dr. Ir. Ni Made Armini Wiendi,
M.S sebagai sumber pendanaan selama pelaksanaan penelitian.
6. Teman – teman S2 dan S3 PBT angkatan 2008 dan 2009 atas kebersamaan,
dukungan dan motivasinya selama ini.
7. Kedua orang tua tercinta, suami (Imam Rabbul Izzati) dan putra tercinta
(Muhammad Raihan Izzati) serta seluruh keluarga atas doa, restu, dan
motivasi selama penulis menempuh pendidikan.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Semoga
tulisan ini dapat bermanfaat bagi banyak pihak.
Bogor, Agustus 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Padang, pada tanggal 22 September 1984 sebagai
putri dari Bapak Syaiful Jannah dan Ibu Helmi. Penulis merupakan anak pertama
dari empat bersaudara. Pendidikan Sarjana ditempuh di Program studi
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan lulus tahun 2006.
Pada tahun 2008 penulis melanjutkan studi pada Sekolah Pascasarjana IPB
untuk mengambil program magister dengan Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi
Tanaman. Biaya penelitian diperoleh dari program penelitian Riset Unggulan
Terpadu, Kemenristek tahun 2009-2010 atas nama Dr. Ir. Ni Made Armini
Wiendi, M.S.
DAFTAR ISI
Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis yang berumur 3 minggu ... 18
Pertumbuhan Kultur dari Eksplan Embrio Zigotik, Nuselus dan Endosperma ... 19
Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis klon 143 yang berumur 1, 2 dan 3 minggu ... 21
Induksi Kalus Sel Endosperma ... 21
Proliferasi Kalus Embriogenik ... 27
Pendewasaan Embrio ... 30
SIMPULAN ... 40
DAFTAR PUSTAKA ... 41
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Komposisi media induksi kalus sel endosperma mangga Arumanis
klon 143 ... 14
2. Komposisi media perkecambahan embrio mangga Arumanis
klon 143 secara in vitro ... 17
3. Persentase kontaminasi kultur mangga Arumanis klon 143
dari eksplan biji sampai dengan 10 MST ... 18
4. Persentase eksplan yang membentuk kalus dari nuselus dan endosperma pada percobaan induksi embriogenesis in vitro sel endosperma
mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 ... 20
5. Selang waktu pembentukan kalus sel endosperma mangga varietas
Arumanis klon 143 sampai 20 MST (Minggu Setelah Tanam) ... 21
6. Persentase pembentukan kalus pada eksplan dari buah mangga Arumanis klon 143 umur buah 1, 2 dan 3 minggu ... 22
7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai
dengan 20 MST ... 25
8. Pengaruh jenis media terhadap pertambahan diameter kalus sel
endosperma mangga Arumanis klon 143 ... 28
9. Jumlah embrio fase kotiledonari yang terbentuk pada media
pendewasaan embrio somatik dari inokulum kotiledon endosperma . 37
10. Jumlah embrio somatik fase kotiledonari yang terbentuk pada media
asal dari inokulum kalus endosperma ... 37
11. Jumlah embrio somatik fase kotiledonari yang terbentuk pada media
pendewasaan dari inokulum kalus endosperma ... 38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Bagan alir penelitian induksi embriogenesis in vitro sel endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis
klon 143 ... 3
2. Buah mangga Arumanis ... 5
3. Pembentukan endosperma tanaman Angiospermae ... 6
4. Buah mangga Arumanis umur 3 minggu yang digunakan sebagai
sumber eksplan pada penelitian pendahuluan ... 12
5. Buah mangga (Mangifera indica) varietas Arumanis klon 143 yang berasal dari Kebun Buah Cukur Gondang, Balai Penelitian Buah,
Pasuruan, Jawa Timur ... 15
6. Pertumbuhan kalus yang berasal dari eksplan nuselus dan endosperma 19
7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai
dengan 20 MST ... 23
8. Kalus yang berasal dari eksplan sel endosperma mangga Arumanis
klon 143 ... 26
9. Persentase kalus embriogenik dari eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 pada berbagai media perlakuan sampai dengan
20 MST ... 26
10. Tahap perkembangan embriogenesis sel endosperma mangga
varietas Arumanis klon 143 ... 29
11. Rata – rata frekuensi proliferasi kalus embriogenik sel endosperma mangga varietas Arumanis klon 143 pada berbagai jenis media
perlakuan ... 30
12. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
fase kotiledonari pada media pendewasaan P1 ... 31
13. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
fase kotiledonari pada media pendewasaan P2 ... 31
14. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
15. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
fase kotiledonari pada media pendewasaan P4 ... 32
16. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
fase kotiledonari pada media pendewasaan P5 ... 32
17. Keragaan embrio somatik mangga varietas Arumanis klon 143
fase kotiledonari pada media pendewasaan P6 ... 33
18. Keragaan kalus embriogenik dari media M1, M4, B1, B2 dan B4
pada media pendewasaan P1 ... 34
19. Keragaan embrio somatik dari kalus embriogenik yang berasal media
M1, M4, B1, B2 dan B4 pada media pendewasaan P2 ... 34
20. Keragaan embrio somatik dari kalus embriogenik yang berasal media
M1, M4, B1, B2 dan B4 pada media pendewasaan P3 ... 35
21. Keragaan embrio somatik dari kalus embriogenik yang berasal media
M1, M4, B1, B2 dan B4 pada media pendewasaan P4 ... 35
22. Keragaan embrio somatik dari kalus embriogenik yang berasal media
M1, M4, B1, B2 dan B4 pada media pendewasaan P5 ... 36
23. Keragaan embrio somatik dari kalus embriogenik yang berasal media
M1, M4, B1, B2 dan B4 pada media pendewasaan P6 ... 36
24. Stomata mangga varietas Arumanis klon 143. (A) : stomata dari tanaman diploid, (B) : Stomata dari embrio fase kotiledonari yang
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Komposisi media Murashige dan Skoog (MS) dan Gamborg (B5) ... 45
2. Komposisi media induksi kalus sel endosperma mangga Arumanis
klon 143 ... 46
3. Komposisi media pendewasaan embrio somatik mangga Arumanis
klon 143 secara in vitro ... 46 4. Rata – rata frekuensi proliferasi kalus embriogenik sel endosperma
mangga varietas Arumanis klon 143 pada berbagai jenis media
DAFTAR PUSTAKA
Ara H, Jaiswal U, Jaiswal VS. 1999. Germination and planted regeneration from encapsulated somatic embryos of mango (Mangifera indica L.). Plant
Cell Report 19 : 166-170.
Arnold SV, Sabala I, Bozhkov P, Dyachock J, Filonova L. 2002. Developmental pathways of somatic embryogenesis. J. Plant Cell Tissue Org Cult 69 (3) : 233-249.
Cangahuala-Inocente GC, Dal Vesco LL, Steinmacher D, Torres AC, Guerra MP. 2007. Improvements in somatic embryogenesis protocol in Feijoa (Acca
sellowiana (Berg) Burret) : Induction, conversion and synthetic seeds. Sci
Hort 111 : 228-234.
Chawla HS. 2002. Introduction to Plant Biotechnology. Science Publisher, Inc.
Costa LM, Marcos JFG, Dickinson HG. 2004. More than a yolk : The short life and complex times of the plant endosperm. Plant Sci 9 (10) : 507-514.
Damayanti D, Sudarsono, Mariska I, Herman M. 2007. Regenerasi pepaya melalui kultur in vitro . J. Agrobiogen 3(2) : 49-54.
Divinkom. 2008. Media kultur jaringan. http://www.unud.ac.id/ind. (10 Juli 2009).
Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. 165 hal.
Hanayanti O. 2011. Embriogenesis sel endosperma untuk perakitan tanaman triploid mangga (Mangifera indica L) varietas gedong gincu [Thesis]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Ibrahim MSD, Rostiana O, dan Khumaida N. 2010. Pengaruh umur eksplan terhadap keberhasilan pembentukan kalus embriogenik pada kultur meristem jahe (Zingiber officinale Rosc). Jurnal Littri. 16 (1) : 37-42.
Jana MM, Nadgauda RS, Rajmohan K, dan Mascarenhas AF. 1994. Rapid somatic embryogenesis from the nucelli of monoembrionic mango varieties. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30 : 55-57.
42
Litz RE, Knight RL, Gazit S. 1982. Somatic embryos from cultured ovules of polyembryonic Mangifera indica L. Plant Cell Report 1 : 264 – 266.
Litz RE. 1997. The Mango. Botany, Production and Uses. CABInternational.
Litz RE, Hendrix RC, Moon PA, havez VM. 1998. Induction of embryogenic mango cultures as affected by genotype, explanting, 2,4-D and embryogenic nurse culture. J Plant Cell Tissue Org Cult. 53 : 13-18.
Mukherjee SK. 1950. Mango : its allopolyploid nature. Nature 166, 196-197.
Pracaya. 2007. Bertanam Mangga. Penebar Swadaya. 144 hal.
Purnamaningsih R. 2002. Regenerasi tanaman melalui embryogenesis somatik dan beberapa gen yang mengendalikannya. Buletin AgroBio 5(2) : 51-58.
Raghavan V. 1986. Embryogenesis in angiosperms : A developmental and experimental study. Cambridge Univ. Press. Cambridge.
Raghuvanshi SS, Srivastava A. 1995. Plant regeneration of Mangifera indica
using liquid shaker culture to reduce phenolic exudation. J. Plant Cell
Tissue Org Cult 41 : 83-85.
Ribeiro SMR, Queiroz JH de, Queiroz MELR de, Campos FM, Sant’ana HMP. 2007. Antioxidant in Mango (Mangifera indica L.) Pulp. Plant food for
human nutrition 62 : 13-17.
Sastrosumarjo S. 2006. Sitogenetika Tanaman. Bagian Genetika dan Pemuliaan Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Shirin F, Hossain M, Kabir MF, Roy M, Sharjer SM. 2007. Callus Induction and Plant Regeneration from Internodal and Leaf Explants of Four Pottato
(Solanum tuberosum L.) Cultivars. World Journal of Agricultural
Sciences 3 (1) : 01-06
Suryowinoto M. 1996. Pemuliaan tanaman SecaraIn Vitro. Kanisius.
Sutanto A dan Aziz M A. 2006. Induksi dan regenerasi embriogenesis somatik pepaya. J. Hort. 16 (2) : 89-95
Thomas TD, Chaturvedi R. 2008. Endosperm culture : a Novel Method for Triploid Plant Production. Plant Cell Tissue Org Cult 93 : 1-14.
43
Widiastoety D, S kusumo dan Syafni. 1997. Pengaruh tingkat ketuaan air kelapa dan jenis kelapa terhadap pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium.
J. Hort. (3) : 768 – 772.
Widiastoety D, Kartikaningrum S, dan Purbadi. 2005. Pengaruh pH terhadap pertumbuhan planlet anggrek dendrobium. J. Hort. 15 (1) : 18-21.
Wulandari S, Wan Syafii dan Yossilia. 2004. Respon eksplan daun tanaman jeruk manis (Citrus sinensis L.) secara in vitro akibat pemberian NAA dan BA.
Jurnal Biogenesis vol 1 (1) : 21-25
Zulkarnain. 2004. The production of tetraploid Swainsona formosa by colchicines mutagenesis. Zuriat (15) : 60 – 64
Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta. Bumi Aksara.
I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mangga (Mangifera indica L.) merupakan salah satu jenis buah tropika yang banyak digemari oleh masyarakat. Buah mangga banyak mengandung
nutrisi terutama vitamin, mineral dan serat. Pada saat proses pematangan, buah
mangga banyak mengandung vitamin C, sedangkan pada buah mangga yang telah
matang vitamin C terdapat dalam konsentrasi yang sedang, namun kaya akan
provitamin A, vitamin B1dan B2 (Litz 1997). Ribeiro et al. (2007) melaporkan bahwa selain mengandung antioksidan seperti asam askorbat, buah mangga juga
mengandung phenol dan karotenoid.
Salah satu kultivar mangga yang sangat potensial untuk dikembangkan
yaitu kultivar Arumanis. Mangga Arumanis banyak disukai konsumen karena
memiliki aroma yang khas serta rasanya yang manis dan segar. Keunggulan lain
yang dimiliki oleh mangga arumanis adalah bobot buahnya yang besar yaitu rata –
rata 400 g/buah.
Mangga Arumanis merupakan tanaman diploid dengan jumlah kromosom
2n = 40 (Mukherjee 1950). Mangga Arumanis memiliki tipe biji poliembrionik,
dimana dalam satu biji mangga, terdapat lebih dari satu embrio. Salah satunya
merupakan embrio zigotik dan embrio yang lainnya terbentuk dari nuselus (Litz
1997). Mangga Arumanis memiliki ukuran biji yang besar, hampir mencapai
¼ bagian dari keseluruhan bagian buahnya. Perakitan tanaman triploid diharapkan
dapat menghasilkan tanaman mangga yang seedless, sehingga dapat meningkatkan kualitas buahnya. Perakitan tanaman triploid dapat dilakukan
secara konvensional dengan melakukan persilangan antara tanaman induk
tetraploid dengan tanaman diploid. Namun metode konvensional ini sulit
dilakukan karena tingkat gugur bunga dan buah yang tinggi. Kendala lain metode
ini adalah masa juvenil mangga cukup panjang (3-5 tahun) sehingga
membutuhkan waktu yang lama.
Salah satu cara untuk mengatasi kekurangan metode konvensional adalah
2
memanfaatkan sel endosperma yang merupakan bagian dari biji yang terbentuk
dari hasil penggabungan satu sel gamet jantan dengan dua inti polar. Endosperma
umumnya terdapat pada tanaman angiospermae yang berfungsi sebagai sumber
nutrisi bagi pertumbuhan embrio zigotik.
Melalui kultur sel endosperma telah berhasil mendapatkan tanaman
triploid pada tanaman jeruk, padi, Asparagus officinalis dan Azadirachta indica.
Selain itu juga berhasil dilakukan pada Ricinus communis, Jatropha
panduraefolia dan Actinidia deliciosa (Thomas dan Chaturvedi 2008).
Umur buah yang digunakan merupakan salah satu hal yang perlu
diperhatikan dalam kultur sel endosperma karena singkatnya keberadaan
(viabilitas) sel endosperma (Costa et al. 2004). Menurut Litz (1997), sel endosperma pada tanaman mangga masih ditemukan dalam kondisi viabel pada
buah yang berumur 1 minggu sampai 8 minggu. Selanjutkan endosperma akan
digunakan untuk pertumbuhan embrio zigotik.
Selain umur buah, faktor lain yang perlu diperhatikan yaitu komposisi
media yang digunakan. Jenis media ini terkait dengan unsur hara dan zat pengatur
tumbuh yang menunjang pertumbuhan dan perkembangan endosperma. Bagan
alir penelitian induksi tanaman triploid mangga disajikan pada Gambar 1.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mempelajari umur buah mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 yang optimal untuk induksi embriogenesis sel endosperma secara in
vitro.
2. Mempelajari berbagai komposisi media untuk menginduksi embriogenesis sel
endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 secara in vitro.
3. Memperoleh umur buah yang tepat dan jenis media yang optimal dalam
menginduksi embriogenesis sel endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 secara in vitro.
Dalam jangka panjang diharapkan dapat diperoleh tanaman triploid dari
3
Hipotesis
1. Terdapat umur buah mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 yang optimal untuk induksi embriogenesis sel endosperma
2. Terdapat media yang optimal untuk menginduksi embriogenesis sel
endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143 3. Terdapat kombinasi umur buah yang tepat dan komposisi media yang paling
tepat untuk menginduksi embriogenesis sel endosperma mangga (Mangifera
indica L.) varietas Arumanis klon 143 secara in vitro.
mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143
II. TINJAUAN PUSTAKA
Mangga (Mangifera indica L.)
Mangga (Mangifera indica L.) bukanlah tanaman asli Indonesia. Mangga
yang berkembang di Indonesia diduga berasal dari India (Litz 1997). Mangga
yang biasa dikonsumsi sehari – hari seperti mangga golek, mangga arumanis,
mangga manalagi, secara taksonomi termasuk ke dalam spesies Mangifera indica
L. (Pracaya 2007). Litz (1997), menyatakan bahwa genus Mangifera yang terdiri
dari 69 spesies merupakan salah satu dari 73 genus yang termasuk ke dalam
famili Anacardiaceae.
Secara taksonomi, tanaman mangga dikelompokkan sebagai berikut:
Divisi : Spermathophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Ordo : Sapindales
Famili : Anacardiaceae
Genus : Mangifera
Spesies : Mangifera indica L.
Karakteristik Mangga Arumanis
Pohon mangga arumanis tidak begitu besar dengan tinggi lebih kurang
9 m. Mahkota pohon seperti kerucut terpotong. Daun berbentuk lonjong dengan
ujung runcing. Panjang daun bisa mencapai 45 cm. Tanaman mangga arumanis di
Indonesia berbunga pada bulan Juli–Agustus dan panen pada bulan September–
November. Buah mangga arumanis memiliki bobot rata-rata 450 g/buah dengan
panjang rata – rata sekitar 15 cm. Bentuk buahnya bulat panjang dan pada ujung
buah terdapat lekukan yang jelas terlihat. Buah yang sudah tua berkulit hijau tua
tertutup lapisan lilin halus dan pada pangkal buah berwarna hijau kekuningan
(Gambar 2A). Daging buah berwarna kuning (Gambar 2B), seratnya halus, berair
5
A
B
Gambar 2. Buah mangga Arumanis. (A) Bentuk buah mangga, (B) Warna daging buah mangga yang matang.
Pembentukan Sel Endosperma
Pada umumnya, tanaman Angioespermae mengalami pembuahan ganda.
Proses pembuahan pertama yaitu antara sel telur (n) dengan inti generatif pertama
(n) yang akan menjadi zigot (2n). Proses pembuahan kedua terjadi antara inti
generatif kedua (n) dengan dua inti polar (2n) yang akan tumbuh menjadi
endosperma (3n) (Gambar 3). Pada tanaman Angiospermae, endosperma
berfungsi untuk menyediakan makanan bagi embrio yang sedang tumbuh dan
berkembang. Endosperma merupakan jaringan seperti parenkima yang biasanya
merupakan massa yang tidak berbentuk (Suryowinoto 1996).
Secara alami, endosperma tanaman ditemukan dalam keadaan triploid.
Masa hidup endosperma pada beberapa tanaman sangat singkat, hanya saat awal
perkembangan embrio, kemudian ukurannya akan mengecil dan bahkan
menghilang seiring perkembangan embrio tersebut (Costa et al. 2004). Kultur sel
endosperma mulai dikembangkan pada tahun 1930-an (Chawla 2002). Kultur sel
endosperma dapat menggunakan endosperma yang muda maupun yang tua.
Proliferasi endosperma matang pertama kali dilaporkan oleh Rangaswamy and
Rao (1963) pada Santalum album. Juga telah berhasil dikulturkan sel endosperma
pada Ricinus communis, Jatropha panduraefolia dan Actinidia deliciosa (Thomas
dan Chaturvedi 2008). Sedangkan hasil proliferasi kultur endosperma muda
pertama kali dilaporkan oleh Lampe dan Mills (1993) pada tanaman jagung
6
didapatkan tanaman triploid pada tanaman jeruk, padi, Asparagus officinalis dan
Azadirachta indica (Thomas dan Chaturvedi 2008).
(Sumber : http://plantsrock.wikispaces.com)
Gambar 3. Pembentukan endosperma tanaman Angiospermae
Sel endosperma pada tanaman mangga masih ditemukan dalam kondisi
viabel pada buah yang berumur 1 minggu sampai 8 minggu (Litz 1997). Sel
endosperma yang diambil dari buah mangga muda berada dalam kondisi cair,
sehingga perlu dilakukan induksi kalus embriogenik terlebih dahulu, yang
kemudian dilanjutkan dengan menginduksi embrio tahap globular, torpedo,
kotiledon hingga menjadi sebuah planlet. Dari planlet tersebut dapat dilakukan uji
sitologi untuk mengetahui jumlah kromosomnya.
Embriogenesis Somatik
Embriogenesis somatik merupakan proses perkembangan embrio lengkap
dari sel–sel vegetatif yang dihasilkan dari berbagai sumber eksplan yang
ditumbuhkan pada sistem kultur jaringan (Hartman et al.1990). Teknik kultur
jaringan melalui induksi embrio somatik lebih diharapkan karena dapat berasal
dari satu sel pada jaringan somatik yang perkembangannya serupa dengan embrio
7
karena akan berkembang menjadi embrio bipolar yaitu mempunyai dua kutub
yang langsung dapat menjadi bakal tunas dan akar (Damayanti et al. 2007).
Disamping itu, untuk mendukung program pemuliaan tanaman melalui rekayasa
genetika, penggunaan embrio somatik dapat mempercepat keberhasilan dengan
peluang transformasi yang lebih tinggi karena embrio somatik dapat berasal dari
satu sel somatik. Untuk penyimpanan jangka pendek maupun jangka panjang,
embrio somatik dianggap merupakan bahan tanaman yang ideal untuk disimpan
karena bila diregenerasikan dapat membentuk bibit somatik (Purnamaningsih
2002).
Zulkarnain (2009) menyatakan bahwa kemampuan regenerasi embrio
somatik pada kultur sel, memungkinkan untuk diregenerasikannya tanaman
lengkap bila regenerasi melalui organogenesis tidak memungkinkan. Selain itu
kultur yang bersifat embriogenik dapat menghasilkan embrio dalam jumlah besar
dalam satu wadah kultur, dibandingkan dengan secara organogenesis. Embrio
somatik yang dihasilkan dapat tumbuh dan berkembang melalui tahapan yang
sama dengan embrio zigotik yaitu oktan, globular, awal hati, hati, torpedo dan
embrio dewasa.
Embrio somatik dapat terbentuk melalui dua jalur, yaitu secara langsung
maupun tidak langsung (melewati fase kalus). Arnold et al. (2002) menyatakan
bahwa secara umum, tahapan yang dilakukan dalam embriogenesis adalah:
• inisiasi kultur embriogenik pada media yang diperkaya dengan zat
pengatur tumbuh terutama auksin,
• proliferasi kultur embriogenik pada media padat atau cair,
• prematurasi pada media yang mengandung zat pengatur tumbuh dengan
konsentrasi rendah atau tanpa zat pengatur tumbuh,
• maturasi embrio somatik pada media yang dilengkapi ABA,
8
Embriogenesis Somatik Pada Mangga
Penelitian embriogenesis pada mangga pertama kali dilakukan oleh Litz et
al. (1982), yang menemukan bahwa embrio somatik dapat diinduksi dari nuselus
yang berasal dari ovul 5 kultivar mangga poliembrionik yaitu Chino, Heart, Ono,
Sabre dan Turpentine N2-1-7-2. Penelitian selanjutnya menggunakan eksplan dari
bagian yang berbeda seperti dari daun (Raghuvanshi dan Srivastava 1995), dan
buah muda pada kultivar monoembrionik (Ara et al. 1999).
Litz (1997) melaporkan bahwa media pertumbuhan tanaman yang terdiri
dari unsur hara makro dan mikro dari media MS, ditambah dengan senyawa
organik, glutamin (400 g/l), sukrosa (60 g/l), Difco Bacto agar (8 g/l), dan auksin
2,4-D (1-2 mg/l) digunakan untuk kultur embriogenesis dari eksplan nuselus.
DeWald et al. (1989) melaporkan bahwa untuk media induksi dan pemeliharaan
menggunakan modifikasi dari media B5 (Gamborg) dan media MS (Murashige
dan Skoog). Unsur hara makro berasal dari media B5 sedangkan unsur hara mikro
dari media MS, dan ditambahkan senyawa organik, glutamin (400 g/l) dan 2,4-D
(1 mg/l).
Media MS sebagai media induksi kalus pada nuselus mangga telah
digunakan oleh Ara et al. (1999). Media dasar dengan setengah konsentrasi hara
makro MS dan FeEDTA, hara mikro MS dan senyawa organik penuh, 2.74 mM
Glutamin ditambah 4.5 μM 2,4-D berhasil menginduksi kalus pada nuselus pada
minggu ketiga sampai minggu kelima (Ara et al. 1999). Perkecambahan mangga
telah berhasil dilakukan oleh Jana et al. (1994) pada mangga monoembrionik
varietas Alphonso dengan menggunakan setengah konsentrasi media MS, 5 mg/l
BA, 200 ml/l air kelapa, 20 g/l sukrosa, 4.2 g/l agar dan 2.5 g/l arang aktif, dengan
persentase embrio yang berkecambah sebesar 55.6%. Planlet yang diperoleh telah
menghasilkan akar dan tunas dalam waktu 15 sampai 21 hari.
Media Kultur Jaringan Tanaman
Keberhasilan kultur jaringan sangat dipengaruhi oleh jenis media yang
digunakan. Media kultur jaringan merupakan campuran dari unsur hara makro,
9
unsur hara makro pada media kultur jaringan antara lain unsur N, P, Ca, Mg, K,
dan S. Unsur – unsur hara ini diberikan dalam bentuk garam – garam anorganik.
Selain hara makro, dalam media kultur jaringan juga terdapat hara mikro yang
terdiri dari unsur Fe, Mn, Zn, Co, B, Cu dan Mo. Unsur – unsur ini merupakan
komponen yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisiologi yang
lainnya (Gunawan 1992).
Bahan tanaman yang digunakan dalam kultur jaringan merupakan bagian
kecil dari tanaman dan tidak merupakan suatu sistem yang lengkap. Dengan
demikian perlu ditambahkan bahan-bahan organik untuk mendukung
pertumbuhan yang optimal. Karbohidrat terutama gula, merupakan komponen
yang selalu ada dalam media tumbuh kecuali dalam media untuk tujuan yang
sangat spesifik (Gunawan 1992). Karbohidrat ini berfungsi sebagai sumber
energi.
Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan
tanaman adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine
(vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan
tanaman. Selain vitamin tersebut, juga sering ditambahkan myo inositol ke dalam
media kultur jaringan. Penambahan ini untuk memperbaiki pertumbuhan dan
morfogenesis tanaman (Gunawan 1992).
Selain pemberian vitamin, dalam media kultur jaringan juga diberikan
asam amino. Penambahan asam amino ini dapat memberikan pengaruh yang
positif terhadap pertumbuhan dan perkembangan kultur. penambahan asam amino
dapat dilihat pengaruhnya dalam mengurangi browning. Namun, ada beberapa
jenis asam amino yang dapat menghambat pertumbuhan walaupun pada
konsentrasi rendah, seperti lysine dan threonine (Gunawan 1992).
Media yang sering digunakan untuk kultur in vitro adalah media MS
(Murashige dan Skoog 1962). Terdapat dua macam media, yaitu media padat dan
media cair (Gunawan 1992). Pada umumnya jaringan dikulturkan pada media
padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar
seperti Gelrite atau Phytagel (Divinkom 2008). Agar – agar merupakan bahan
pemadat yang paling banyak digunakan. Dalam media kultur jaringan, juga sering
10
kultur. Senyawa yang ditambahkan yaitu arang aktif dan PVP (Poly vinyl
pyrolidon). Senyawa ini berfungsi untuk menyerap persenyawaan toxic yang
terdapat dalam media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur terutama
persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka saat inisiasi. Penggunaan PVP
1 % dalam media MS cair yang digoyang pada 75 rpm telah berhasil mengurangi
senyawa fenolik yang dikeluarkan pada kultur in vitro tanaman mangga
(Raghuvanshi dan Srivastava 1995).
Faktor lain yang perlu diperhatikan dalam pembuatan media tumbuh yaitu
pH media. Penyerapan bahan–bahan yang terdapat dalam media ke dalam sel
tanaman sangat dipengaruhi oleh konsentrasi larutan media dan pH (derajat
kemasaman) (Widiastoety et al. 2005). Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang
sedikit asam yaitu berkisar antara 5.5-5.8 Jika pH media lebih tinggi dari 6.0,
media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar - agar
tidak dapat memadat (Divikom 2008). Pengaturan pH dilakukan dengan
menambahkan NaOH atau KOH untuk menaikkan pH. Sedangkan untuk
menurunkan pH ditambahkan HCl.
Selain menggunakan media MS, pada kultur jaringan juga digunakan
media B5. Media ini dikembangkan oleh Gamborg dan grupnya pada tahun 1968
untuk kultur suspensi kedelai. Media B5 menggunakan konsentrasi NH4+ yang
rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM akan menghambat
pertumbuhan sel kedelai. Konsentrasi fosfat yang diberikan pada media tersebut
adalah 1mM, Ca+2 antara 1-4 mM dan Mg+2 antara 0.5–3 mM (Gunawan 1992).
Zat Pengatur Tumbuh
Dalam kultur jaringan, terdapat dua golongan zat pengatur tumbuh yang
sangat penting yaitu sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi
pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ. Interaksi dan
perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang
diproduksi oleh sel secara endogen akan menentukan arah perkembangan suatu
11
Zat pengatur tumbuh dapat digolongkan kedalam lima golongan yaitu :
auksin, sitokinin, giberelin, asam absisat dan etilen. Auksin digunakan secara luas
dalam kultur jaringan untuk merangsang pertumbuhan kalus, suspensi sel dan
organ. Auksin yang sering digunakan dalam kultur jaringan antara lain IAA
(Indole Acetic Acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA (Naphtaleine
Acetic Acid), dan IBA (Indole Butyric Acid). Auksin 2,4-D adalah yang paling
sering digunakan untuk mendorong pembentukan embrio somatik (Wattimena
1992)
Selain auksin, sitokinin juga sangat penting dalam pertumbuhan dan
perkembangan eksplan. Sitokinin berfungsi dalam pengaturan pembelahan sel dan
morfogenesis (Gunawan 1992). Selain meningkatkan pembelahan sel dan inisiasi
pucuk, sitokinin juga terlibat dalam kontrol perkecambahan biji, mempengaruhi
absisi daun dan transpor auksin, memungkinkan bekerjanya giberelin dengan
menghilangkan penghambat tumbuh serta menunda penuaan. Meskipun demikian,
baik auksin maupun sitokinin, keduanya seringkali digunakan secara bersamaan
pada medium kultur untuk menginduksi pola morfogenesis tertentu, walaupun
rasio yang dibutuhkan untuk induksi perakaran maupun pucuk tidak selalu sama
(Zulkarnain 2009). Sitokinin yang sering digunakan dalam kultur jaringan antara
lain kinetin (6-furfuryl amino purine), zeatin
(4-hydroxyl-3-methyl-trans-2-butenyl amino purine), 2-ip (N6-2-isopenthanyl adenine) dan BAP (6-benzyl
amino purine) (Gunawan 1992).
Zat pengatur tumbuh lain yang dapat mempengaruhi pertumbuhan
eksplan, yaitu giberelin. Penggunaan giberelin dalam kultur jaringan tanaman
kadang-kadang membantu morfogenesis. Tetapi dalam kultur kalus dimana
pertumbuhan sudah cepat hanya dengan auksin dan sitokinin, maka penambahan
giberelin sering menghambat. Pada umumnya giberelin terutama GA3
menghambat perakaran (Gunawan 1992).
III. BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Percobaan ini dilaksanakan dalam dua percobaan yaitu : percobaan I :
pendahuluan, yang dilakukan dari bulan Agustus 2009 sampai dengan Juni 2010
dan percobaan II : lanjutan, dilakukan dari bulan Juli 2010 sampai dengan
Oktober 2011. Percobaan dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan II,
Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian
Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan pada percobaan pendahuluan adalah biji
mangga Arumanis dari buah yang berumur 3 minggu, yang diperoleh dari
Kelompok Tani Indramayu, Jawa Barat (Gambar 4). Sedangkan bahan tanaman
pada percobaan lanjutan adalah biji mangga Arumanis klon 143 dari buah yang
berumur 1, 2, dan 3 minggu, yang diperoleh dari Kebun Buah Cukur Gondang,
Balai Penelitian Buah Pasuruan, Jawa Timur. Bagian biji yang digunakan yaitu
embrio, nuselus dan endosperma. Embrio dan nuselus digunakan sebagai kontrol.
Gambar 4. Buah mangga Arumanis umur 3 minggu yang digunakan sebagai sumber eksplan pada penelitian pendahuluan
Media tanam yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas media MS
(Murashige dan Skoog 1962) dan B5 (Gamborg) dengan kombinasi zat pengatur
13
pada media MS dan B5 disajikan pada Lampiran 1. Selain unsur hara makro dan
mikro, pada media perlakuan juga ditambahkan senyawa organik (ekstrak yeast
dan glutamin). Sumber karbon pada media menggunakan sukrosa dan sebagai
bahan pemadat digunakan agar. Bahan untuk sterilisasi eksplan digunakan
beberapa sterilan seperti alkohol, dithane, agrept, dan clorox (Natrium hypoclorite
5%).
Peralatan yang digunakan adalah laminar air flow cabinet, timbangan analitik, autoklaf, pH-meter, alat – alat diseksi (pinset, gunting, scalpel, dan mata
pisau), peralatan gelas (gelas ukur, gelas piala, erlenmeyer, cawan petri, alat
pengaduk dan botol kultur), bunsen, hand sprayer, dan mikroskop.
Metode Percobaan
Penelitian ini terdiri atas 2 percobaan. Percobaan I adalah percobaan
pendahuluan yang dilakukan untuk mempelajari perbedaan pertumbuhan eksplan
yang berasal dari sel endosperma, embriozigotik dan nuselus. Bahan tanaman
yang digunakan adalah biji mangga Arumanis klon 143 dari buah yang berumur 3
minggu. Percobaan dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap
dengan perlakuan komposisi media, yang terdiri atas 10 jenis yaitu MA1, MA2,
MA3, MA4, MA5, BA1, BA2, BA3, BA4 dan BA5 (Tabel 1). Masing – masing
perlakuan terdiri atas 8 ulangan sehingga terdapat 80 satuan percobaan. Setiap
satuan percobaan terdiri atas 1 botol kultur yang berisi 2 eksplan sebagai satuan
amatan.
Komposisi media tersebut merupakan modifikasi dari media dasar
Murashige dan Skoog (MS) dan media Gamborg (B5). Pada media MA1, MA2,
MA3, BA1, BA2, BA3, BA4 dan BA5, unsur hara makro berasal dari media
Gamborg (B5) dan unsur hara mikro berasal dari media Murashige dan Skoog
(MS). Sedangkan pada media MA4 dan MA5, unsur hara makro dan mikro
berasal dari media MS. Selain itu, semua media BA menggunakan glutamin
sedangkan pada media MA tidak ditambahkan glutamin. Pada media MA4 dan
14
Tabel 1. Komposisi media induksi kalus sel endosperma mangga Arumanis klon 143
Jenis Media Komposisi ZPT (mg/l)
BAP Kinetin IBA NAA 2,4-D GA3
Percobaan II dilakukan untuk mendapatkan umur buah dan jenis media
yang optimal untuk menginduksi embriogenesis sel endosperma mangga varietas
Arumanis klon 143. Percobaan ini terdiri atas beberapa tahapan pelaksanan yaitu :
1) Induksi kalus sel endosperma, 2) Proliferasi kalus embriogenik, dan
3) Pendewasaan embrio.
1. Induksi kalus sel endosperma
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji mangga Arumanis klon 143
dari buah yang berumur 1, 2 dan 3 minggu. Buah diperoleh dari Kebun Buah
Cukur Gondang, Balai Penelitian Buah, Pasuruan, Jawa Timur. Penentuan umur
buah mangga di hitung berdasarkan hari setelah bunga mekar (1 minggu = 7 hari
setelah bunga mekar; 2 minggu = 14 hari setelah bunga mekar; 3 minggu =
21 hari setelah bunga mekar). Bagian biji yang digunakan sebagai perlakuan
adalah endosperma, sedangkan embriozigotik dan nuselus sebagai kontrol.
Proses sterilisasi awal dilakukan di luar laminar dengan cara merendam
buah dalam campuran larutan Dithane 4 g/l dan Agrept 4 g/l selama 30 menit.
Kemudian dipindahkan ke dalam laminar dan direndam dalam alkohol 70%
selama 25 menit, dilanjutkan dengan perendaman dalam Clorox (Natrium
15
dibelah untuk diambil bijinya. Biji mangga direndam dalam larutan Clorox
dengan konsentrasi 10% selama 5 menit. Penanaman dilakukan setelah membelah
biji menjadi dua bagian. Kedua keping biji tersebut ditanam dalam satu botol.
Media yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas media dasar MS
(Murashige dan Skoog) dan B5 (Gamborg) dengan kombinasi zat pengatur
tumbuh auksin, sitokinin dan giberelin, ditambah dengan sukrosa dan agar sebagai
bahan pemadat.
Gambar 5. Buah mangga (Mangifera indica) varietas Arumanis klon 143 yang berasal dari Kebun Buah Cukur Gondang, Balai Penelitian Buah, Pasuruan, Jawa Timur. (A) umur buah 3 minggu, (B) 2 minggu dan (C) 1 minggu
Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap
Faktorial, untuk mempelajari 2 faktor perlakuan. Faktor pertama adalah umur
buah yang terdiri dari 1 minggu (U1), 2 minggu (U2) dan 3 minggu (U3) setelah
pembentukan buah (Gambar 5). Faktor kedua adalah jenis dan komposisi media
yang terdiri atas 10 macam media yaitu MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, BA1,
BA2, BA3, BA4 dan BA5, yang sama dengan komposisi media pada percobaan
pendahuluan. Total kombinasi perlakuan adalah 30 dengan 3 ulangan, sehingga
terdapat 90 satuan percobaan. Masing – masing ulangan terdiri atas 3 botol kultur
dan masing – masing botol dikulturkan 2 eksplan sehingga terdapat 540 satuan
amatan. Satu satuan amatan adalah eksplan berupa potongan biji mangga. Kultur
diinkubasi dalam ruang gelap pada suhu 22±3 °C selama 20 minggu. Peubah yang
diamati adalah waktu pembentukan kalus, persentase eksplan yang membentuk
16
2. Proliferasi kalus embriogenik
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah kalus embriogenik yang
diperoleh dari hasil induksi kalus pada percobaan sebelumnya. Percobaan ini
menggunakan Rancangan Acak Lengkap 1 faktor dengan 7 perlakuan media dan
10 ulangan, sehingga diperoleh 70 satuan percobaan. Media yang digunakan yaitu
MA1, MA2, MA3, MA4, BA1, BA2 dan BA4. Setiap satuan percobaan terdiri
dari satu inokulum, sehingga diperoleh 70 satuan amatan. Peubah yang diamati
adalah diameter kalus.
3. Pendewasaan embrio somatik
3.1. Pendewasaan embrio somatik dengan menggunakan inokulum embrio pada fase kotiledonari
Tahapan percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial,
untuk mempelajari 2 faktor perlakuan. Faktor pertama adalah media asal
inokulum, yang terdiri atas 2 macam media yaitu MA2 dan MA3. Faktor kedua
adalah media pendewasaan embrio somatik, yang terdiri atas 6 macam media
yaitu P1, P2, P3, P4, P5 dan P6. Komposisi setiap media disajikan pada Tabel 2.
Total kombinasi perlakuan adalah 12 dengan 5 ulangan sehingga terdapat 60
satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri atas satu botol kultur yang
berisi 5 embrio yang sudah memasuki fase kotiledonari sehingga diperoleh 300
satuan amatan.
3.2. Pendewasaan embrio somatik dengan menggunakan inokulum kalus embriogenik
Tahapan percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial,
untuk mempelajari 2 faktor perlakuan. Faktor pertama adalah media asal
inokulum, yang terdiri atas 5 macam media yaitu MA1, MA4, BA1, BA2 dan
BA4. Faktor kedua adalah media pendewasaan embrio somatik, yang terdiri atas
6 macam media yaitu P1, P2, P3, P4, P5 dan P6. Total kombinasi perlakuan
17
satuan percobaan terdiri atas satu botol kultur yang berisi satu inokulum sehingga
diperoleh 150 satuan amatan.
Media pendewasaan embrio somatik terdiri atas media dasar dengan unsur
hara makro berasal dari media B5 dan unsur hara mikro serta vitamin berasal dari
media MS. Media tersebut ditambahkan zat pengatur tumbuh, senyawa organik
dan sukrosa (Lampiran 3). Pada media P5 digunakan setengah konsentrasi media
dasar. Komposisi media pendewasaan embrio somatik disajikan pada Tabel 2.
Kultur dipelihara dalam ruang kultur dengan fotoperiodisitas 24 jam terang pada
suhu 22±3 °C selama 4 minggu. Peubah yang diamati adalah jumlah embrio fase
kotiledonari dan jumlah planlet yang terbentuk.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan I. Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis yang berumur 3 minggu
Percobaan I merupakan pra-penelitian. Sumber eksplan yang digunakan
pada percobaan ini yaitu biji dari buah mangga yang berumur 3 minggu setelah
pembentukan buah.
Persentase Kontaminasi
Kontaminasi yang terjadi pada eksplan cukup tinggi, terutama oleh
bakteri. Media yang digunakan tidak menginduksi kontaminasi, karena telah
disterilisasi terlebih dahulu dan dibiarkan selama beberapa hari untuk melihat ada
atau tidaknya kontaminan. Kontaminasi yang terjadi diduga karena proses
sterilisasi eksplan yang kurang tepat. Selain itu, getah dari eksplan juga
mempengaruhi tingkat kontaminasi. Pada Tabel 3 tersaji data yang menunjukkan
kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yaitu mencapai 93.8%, sedangkan
tingkat kontaminasi yang disebabkan oleh cendawan, tertinggi sebesar 25%.
Tabel 3. Persentase kontaminasi kultur mangga Arumanis klon 143 dari eksplan biji sampai dengan 10 MST
19
Pertumbuhan Kultur dari Eksplan Embrio Zigotik, Nuselus dan Endosperma
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa hingga 10 minggu setelah tanam
(MST) belum ditemukan adanya pertumbuhan pada eksplan embrio zigotik.
Eksplan nuselus dan eksplan dari sel endosperma mulai membentuk kalus pada 4
minggu setelah tanam (MST). Eksplan nuselus tumbuh melalui embriogenesis
tidak langsung, begitu juga halnya dengan eksplan dari sel endosperma. Kalus
yang dihasilkan memiliki kemiripan, yaitu berwarna kuning kehijauan dan
memiliki struktur yang remah (Gambar 6A). Hal ini menyulitkan dalam
penentuan asal kalus tersebut sehingga kalus yang berasal dari sel endosperma
ditentukan dari kalus yang tumbuh pada media bekas pindah tanam keping biji
mangga, sedangkan kalus yang menempel pada keping biji ditentukan sebagai
kalus dari eksplan nuselus (Gambar 6B).
A
B
Gambar 6. Pertumbuhan kalus (A) : kalus dari eksplan nuselus pada media BA3 pada 9 MST, (B) : kalus dari eksplan endosperma pada media BA4 pada 9 MST
Tabel 4 menunjukkan bahwa eksplan nuselus tumbuh membentuk kalus
pada media MA2, MA3, MA5, BA1, BA3, BA4 dan BA5. Persentase eksplan
yang membentuk kalus terbesar diperoleh pada media BA1 yaitu 37.5 % (6/16).
Pada eksplan endosperma, kalus terbentuk pada media MA3, BA3 dan BA4.
Persentase eksplan yang membentuk kalus terbanyak diperoleh pada media BA4
yaitu 18.75 % (3/16).
Pada Tabel 4 tersaji data yang menunjukkan bahwa persentase eksplan
yang membentuk kalus pada media BA lebih banyak dibandingkan dengan media
20
pembentukan kalus ini diduga karena pengaruh 2,4-D dalam media induksi. Hal
yang sama juga telah dilaporkan oleh Litz et al. (1998) yang telah berhasil
menginduksi kalus dari eksplan nuselus mangga dengan penambahan 2,4-D.
Selain itu, penambahan glutamin dan kombinasi 2,4-D dan BAP pada media BA
juga mempengaruhi induksi kalus. Cangahuala-Inocente et al. (2007)
mengemukakan bahwa penambahan 8 mM glutamin dan 20 μM 2,4-D ke dalam
media memberikan jumlah embrio somatik yang lebih banyak pada tanaman
Feijoa (Acca sellowiana (Berg)). Sedangkan pengaruh kombinasi antara 2,4-D
dan BAP pada media induksi kalus dapat dilihat dari hasil penelitian Sutanto dan
Aziz (2006) yang mengemukakan bahwa kombinasi dari 2,4-D 1 mg/l dan BAP
0.01 mg/l menghasilkan kalus tertinggi pada Carica papaya. Ibrahim et al. (2010)
juga menyatakan bahwa media induksi kalus yang mengandung 2% sukrosa, 100
mg/l glutamin, 1 mg/l 2,4-D, dan 3 mg/l BA berhasil menginduksi kalus
embriogenik jahe baik pada perlakuan eksplan asal rimpang yang dipanen tua
maupun muda.
Tabel 4. Persentase eksplan yang membentuk kalus dari nuselus dan
endosperma pada percobaan induksi embriogenesis in vitro sel
endosperma mangga (Mangifera indica L.) varietas Arumanis klon 143
Media
21
Percobaan II. Embriogenesis sel endosperma dari eksplan buah mangga varietas Arumanis klon 143 yang berumur 1, 2, dan 3 minggu
1. Induksi Kalus Sel Endosperma
Waktu Pembentukan Kalus
Induksi kalus dari cairan endosperma yang menempel pada biji mangga
varietas Arumanis merupakan tahapan awal dari percobaan embriogenesis sel
endosperma. Komposisi media dasar dan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang
terdapat dalam media tersebut juga ikut menentukan keberhasilan induksi kalus.
Hasil percobaan induksi kalus dari sel endosperma yang telah dilakukan
menunjukkan bahwa eksplan yang dikulturkan dalam media induksi mulai
menunjukkan pembentukan kalus sel endosperma pada umur 3 minggu setelah
tanam (MST) yaitu pada media BA2 dengan umur buah 3 minggu (U3). Pada
umur 3 – 14 minggu setelah tanam (MST), kalus banyak bermunculan, tetapi ada
beberapa eksplan yang pertumbuhannya lambat (Tabel 5).
Tabel 5. Selang waktu pembentukan kalus sel endosperma mangga varietas Arumanis klon 143 sampai 20 MST (Minggu Setelah Tanam)
Media Selang waktu pembentukan kalus (MST)
U1 U2 U3 minggu, MST : minggu setelah tanam
Pada eksplan yang berasal dari buah yang berumur 1 minggu (U1), kalus
baru terbentuk pada 4 MST pada media MA3 dan BA4. Sedangkan pada buah
yang berumur 2 minggu (U2), kalus baru terbentuk setelah 7 MST pada media
22
berumur 3 minggu lebih baik digunakan sebagai sumber eksplan dibandingkan
dengan umur buah 1 dan 2 minggu untuk induksi kalus sel endosperma.
Eksplan yang berasal dari buah yang berumur 3 minggu (U3), mengalami
induksi kalus pada hampir pada semua komposisi media BA dengan waktu
pembentukan yang cenderung cepat. Penambahan glutamin dan 2,4-D
menunjukkan percepatan pembentukan kalus. Hasil ini sesuai dengan hasil
penelitian Shirin et al. (2007) yang melaporkan bahwa 2,4-D dalam media kultur
dapat mempercepat terjadinya induksi kalus. Menurut Raghavan (1986), auksin
meningkatkan kuantitas sel-sel embriogenik dengan cara memacu pembelahan sel
untuk membentuk massa proembriogenik, serta mencegah inisiasi pertumbuhan
yang teratur pada sel-sel tersebut.
Persentase Eksplan yang Membentuk Kalus
Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase eksplan yang membentuk
kalus terbesar berdasarkan jumlah eksplan yang hidup diperoleh dari buah yang
berumur 3 minggu (U3) sebesar 26,3%, yang berbeda nyata dengan buah yang
berumur 1 dan 2 minggu (U1 dan U2) yang hanya mencapai 3,9% dan 8,3%
(Tabel 6). Persentase eksplan yang membentuk kalus berdasarkan jumlah eksplan
yang ditanam yang terbesar juga diperoleh dari buah yang berumur 3 minggu
(U3) yaitu 14 % (Tabel 6).
Tabel 6. Persentase pembentukan kalus pada eksplan dari buah mangga Arumanis klon 143 umur 1, 2 dan 3 minggu
Umur Buah Persentase eksplan membentuk kalus (%)
JET JEH
1 minggu 2.8b 3.9b
2 minggu 3.8b 8.3b
3 minggu 14a 26.3 a
Ket : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT dengan α=5%.
JET : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang ditanam JEH : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang hidup
Pada eksplan sel endosperma yang berasal dari buah yang berumur
3 minggu (U3), kalus dapat terbentuk di 7 media perlakuan dengan persentase
23
62.5%. Eksplan yang berasal dari buah yang berumur 1 minggu (U1) hanya
tumbuh pada 3 media yaitu MA2, MA3 dan BA4 sedangkan eksplan yang berasal
dari buah yang berumur 2 minggu (U2) hanya tumbuh pada 4 media yaitu MA2,
MA3, MA4 dan BA1 (Gambar 7). Endosperma dari buah mangga yang berumur 3
minggu merupakan eksplan yang optimal untuk diinduksi menjadi kalus. Hal ini
diduga karena pada umur 3 minggu, buah mangga memiliki vigor yang lebih baik
dibandingkan dengan buah yang berumur 1 dan 2 minggu. Buah yang berumur 3
minggu memiliki mesocarp yang tebal serta ukuran biji yang lebih besar. Selain
itu, buah yang berumur 3 minggu lebih mudah disimpan sebelum dilakukan
percobaan. Buah mangga yang berumur 3 minggu tidak cepat rusak atau busuk
sedangkan buah mangga yang berumur 1 dan 2 minggu, eksplan lebih cepat rusak
dan busuk.
Gambar 7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai dengan 20 MST
Hasil pengamatan pembentukan kalus berdasarkan jumlah eksplan yang
hidup (Gambar 7) menunjukkan bahwa media MA2 dan MA3 berhasil
menginduksi kalus sel endosperma pada semua umur eksplan (1, 2 dan 3 minggu)
dengan persentase eksplan membentuk kalus terbesar diperoleh pada media MA2
pada umur buah 3 minggu (U3) yaitu 62.5%. Respon ini diduga karena pengaruh
perlakuan kombinasi antara BAP dan NAA. Wulandari et al. (2004) menyatakan
24
BA pada media induksi kalus pada eksplan daun tanaman jeruk manis (Citrus
sinensis L.) telah mencapai keseimbangan yang tepat sehingga sel – sel terinduksi
lebih cepat untuk melakukan pembelahan terus menerus dan dihasilkan kalus
yang lebih besar dan banyak.
Pada media MA1, kalus hanya terbentuk pada eksplan dari buah yang
berumur 3 minggu (U3) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar
46%. Pada media MA4, kalus hanya terbentuk pada eksplan dari buah yang
berumur 2 minggu (U2) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar
33.34%. Pada semua umur eksplan, media MA5 tidak mampu menginduksi
pembentukan kalus endosperma (Gambar 7). Konsentrasi 2,4-D (0.25 mg/l) yang
lebih rendah dibandingkan dengan BAP yaitu 1.125 mg/l diduga sebagai
penyebabnya. Wattimena (1992) menyatakan bahwa untuk pembentukan kalus
dibutuhkan konsentrasi auksin yang tinggi dengan konsentrasi sitokinin yang
rendah.
Persentase eksplan membentuk kalus terbesar pada media BA diperoleh
pada media BA2 pada eksplan dari buah yang berumur 3 minggu (U3) yaitu
58.33%. Hal ini diduga karena adanya kombinasi antara BAP dan 2,4-D yang
sesuai untuk induksi kalus. Pada media BA1, induksi kalus terbentuk pada
eksplan dari buah yang berumur 2 dan 3 minggu (U2 dan U3) dengan persentase
eksplan membentuk kalus masing – masing sebesar 25% dan 11.11%. Pada media
BA4, induksi kalus terbentuk pada eksplan dari buah yang berumur 1 dan
3 minggu (U1 dan U3) dengan persentase tertinggi pada U3 yaitu sebesar 50%
sedangkan media BA5 hanya menginduksi kalus pada eksplan dari buah yang
berumur 3 minggu (U3) dengan persentase eksplan membentuk kalus sebesar
22.22%. Pada semua umur eksplan (1, 2 dan 3 minggu), media BA3 tidak mampu
menginduksi pembentukan kalus endosperma (Gambar 7).
Konsentrasi BAP yang terdapat pada media BA diduga mempengaruhi
persentase kalus yang dihasilkan. Pada media BA2 dan BA4, konsentrasi BAP
yang digunakan sebesar 0.2 mg/l sedangkan pada media BA3 dan BA5
konsentrasi BAP yang digunakan sebesar 0.4 mg/l. Berdasarkan hasil
pengamatan, diperoleh bahwa persentase eksplan membentuk kalus lebih banyak
25
dan Witjaksono (2011) menyatakan bahwa pembentukan kalus pada inokulum
daun kentang hitam menurun dengan meningkatnya konsentrasi BA dalam
medium. Persentase pembentukan kalus tertinggi (100%) didapat pada medium
dengan BA terendah (0,1 mg/l).
Hasil pengamatan pembentukan kalus berdasarkan jumlah eksplan yang
ditanam (Tabel 7) menunjukkan bahwa persentase eksplan membentuk kalus
terbesar diperoleh pada media MA2 dan MA3 dengan umur buah 3 minggu yaitu
28%. Pada media BA, persentase eksplan membentuk kalus terbesar diperoleh
pada media BA2 dari buah yang berumur 3 minggu yaitu 27.67%.
Tabel 7. Persentase eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 yang membentuk kalus pada berbagai media perlakuan sampai dengan 20 MST
Jenis Media
Persentase eksplan membentuk kalus (%) umur buah
1 minggu 2 minggu 3 minggu
JET JEH JET JEH JET JEH
MA1 0.00 0.00 0.00 0.00 16.67 46.00
MA2 11.00 20.00 11.00 16.67 28.00 62.50
MA3 11.00 16.67 5.67 16.67 28.00 45.84
Ket : JET : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang ditanam JEH : Persentase eksplan membentuk kalus dibagi jumlah eksplan yang hidup
Kalus dari sel endosperma yang dihasilkan pada media perlakuan dan
umur buah yang berbeda tidak semuanya bersifat embriogenik. Kalus
embriogenik ditunjukkan dengan warnanya yang krem kekuningan berstruktur
remah (friable) dan ditemukan adanya sel globular (Gambar 8A). Berdasarkan
hasil pengamatan, ditemukan bahwa kalus yang terbentuk pada buah yang
berumur 1 minggu (U1) tidak ada yang bersifat embriogenik dan kalus yang
dihasilkan berubah warna menjadi coklat kehitaman (Gambar 8B). Hal ini
26
tanaman dan dapat menghambat pertumbuhan. Penanggulangan pengaruh negatif
dari senyawa ini dapat dikurangi dengan melakukan subkultur kalus ke media
baru.
A
B
Gambar 8. Kalus yang berasal dari eksplan sel endosperma mangga Arumanis klon 143 (A) : Kalus yang embriogenik dan (B) : kalus yang tidak embriogenik
Kalus yang dihasilkan oleh eksplan dari buah yang berumur 2 minggu
(U2) dan 3 minggu (U3) tidak semuanya embriogenik. Gambar 9 menunjukkan
bahwa eksplan dari buah yang berumur 3 minggu, yang ditanam pada media MA3
menghasilkan persentase kalus embriogenik tertinggi yaitu 37.5%.
27
Berdasarkan hasil pengamatan dapat dilihat bahwa meskipun nilai
persentase jumlah eksplan membentuk kalus pada media MA2 (B5 makro + MS
mikro + 0,2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l GA3 + 3 % sukrosa) tertinggi,
namun persentase kalus embriogenik yang diperoleh lebih rendah dibandingkan
dengan media MA3 ((B5 makro + MS mikro + 0,2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA +
0,5 mg/l GA3 + 3 % sukrosa). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa media
MA3 merupakan media yang optimal untuk menginduksi kalus embriogenik.
Leksonowati dan Witjaksono (2011) menyatakan bahwa penambahan NAA pada
konsentrasi 0,1 mg/l dan 1 mg/l pada medium BA, cenderung meningkatkan
persentase survival inokulum daun dari tunas kentang hitam in vitro pada
konsentrasi BA rendah (0,1 mg/l), tetapi tidak berpengaruh nyata pada medium
dengan BA lebih tinggi (0,5–5 mg/l). Peningkatan konsentrasi NAA pada medium
dengan BA meningkatkan persentase inokulum membentuk kalus, terutama pada
medium dengan konsentrasi BA rendah. Peningkatan NAA pada medium tidak
hanya meningkatkan persentase inokulum membentuk kalus tetapi juga
banyaknya kalus yang terbentuk. Persentase pembentukan kalus tertinggi (100%)
didapat pada medium dengan NAA tertinggi (1 mg/l) dan BA terendah (0,1 mg/l).
2. Proliferasi Kalus Embriogenik
Berdasarkan hasil tahapan percobaan sebelumnya (induksi kalus), jumlah
kalus embriogenik yang dihasilkan sangat sedikit, untuk itu dilakukan proliferasi
kalus. Media yang digunakan pada proliferasi kalus ini sama dengan media
induksi. Kalus yang dihasilkan pada media induksi bersifat remah. Kalus ini
kemudian dipecah menjadi beberapa bagian yang kemudian ditanam pada media
asal kalus tersebut.
Pertambahan diameter kalus tiap minggu pada beberapa media mengalami
fluktuasi. Pada minggu pertama, pertambahan diameter kalus terbesar diperoleh
pada media MA1 dan BA1 dengan nilai 1.40 mm dan 1.45 mm. Pada minggu
kedua, media MA2 menghasilkan pertambahan diameter terbesar yaitu 1.85 mm.
Pada minggu ketiga media BA1 menghasilkan pertambahan diameter terbesar
yaitu 1.1 mm dan tidak berbeda nyata dengan media lainnya. Pada akhir
28
berbeda nyata dengan media MA1, MA3, MA4, BA1, BA2, dan BA4 (Tabel 8).
Berdasarkan pertambahan diameter kalus total, dapat diketahui bahwa media
MA2 menghasilkan nilai yang paling besar yaitu 5.80 mm dan berbeda nyata
dengan media yang lainnya, sehingga dapat dijadikan sebagai media yang optimal
dalam proliferasi kalus embriogenik.
Tabel 8. Pengaruh jenis media terhadap pertambahan diameter kalus sel
endosperma mangga Arumanis klon 143
Media
Pertambahan diameter kalus (mm) Pertambahan diameter kalus total (mm)
minggu minggu minggu minggu minggu
ke-1 ke-2 ke-3 ke-4 ke-4
Ket : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom peubah yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT dengan α=5%. Nilai KK merupakan hasil transformasi pada √x + 1
Proliferasi yang dilakukan pada kalus embriogenik dimedia induksi ternyata
memberikan hasil akhir yang berbeda. Pada media MA1, MA4, BA1, BA2 dan BA4,
proliferasi yang dilakukan pada umumnya hanya menambah diameter kalus. Hal ini
terlihat dari semakin besarnya diameter kalus. Pada tahapan ini, sedikit sekali
ditemukan embrio fase kotiledonari. Sedangkan pada media MA2 dan MA3, selain
menambah diameter kalus, proliferasi yang dilakukan juga menyebabkan adanya
pertumbuhan dan perkembangan embrio dari struktur globular menjadi fase jantung,
29
A
B
C
D
E
Gambar 10. Tahap perkembangan embriogenesis sel endosperma mangga
varietas Arumanis klon 143 (A. Kalus embriogenik dari sel endosperma, B. Fase globular, C. Fase Jantung, D. Fase Torpedo, E. Fase kotiledon)
Proliferasi kalus yang telah dilakukan selain untuk mengetahui ukuran
diameter kalus yang dihasilkan, juga dapat mempelajari kemampuan proliferasi
kalus tersebut jika ditanam pada media perlakuan. Nilai frekuensi proliferasi kalus
embriogenik yang disajikan pada Gambar 11 diperoleh setelah empat minggu
dikulturkan dalam media perlakuan. Pada media MA, frekuensi proliferasi kalus
tertinggi terdapat pada media MA2 dengan nilai 1.83 kali, sedangkan pada media
BA, frekuensi proliferasi kalus embriogenik tertinggi dihasilkan pada media BA1
30
Gambar 11. Rata – rata frekuensi proliferasi kalus embriogenik sel endosperma mangga varietas Arumanis klon 143 pada berbagai jenis media perlakuan
3. Pendewasaan Embrio
3.1. Pendewasaan embrio dengan menggunakan inokulum embrio fase kotiledonari
Pada tahapan pendewasaan embrio, inokulum embrio fese kotiledonari
dari media MA2 dan MA3 dipindahkan ke-6 jenis media pendewasaan (P1, P2,
P3, P4, P5 dan P6). Berdasarkan hasil percobaan, pertumbuhan inokulum pada
setiap media pendewasaan menunjukkan hasil yang berbeda. Pertumbuhan embrio
fase kotiledonari yang berasal dari media MA2 dan MA3 pada media
pendewasaan P1 dengan komposisi 1 mg/l 2,4-D, glutamin dan sukrosa 6%,
menunjukkan pembentukan kalus embriogenik (Gambar 12A dan 12B). Hal ini
diduga karena adanya kombinasi antara glutamin dan 2,4-D. Pada media P2
dengan komposisi 0,2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA dan sukrosa 3%, embrio fase
kotiledonari yang berasal dari media MA2 dan MA3 menunjukkan terbentuknya
31
Gambar 12. Keragaan embrio somatik mangga var Arumanis klon 143 fase kotiledonari pada media pendewasaan P1. (A) : inokulum berasal dari media MA2, (B) : inokulum berasal dari media MA3
A B
Gambar 13. Keragaan embrio somatik mangga var Arumanis klon 143 fase kotiledonari pada media pendewasaan P2. (A) : inokulum berasal dari media MA2, (B) : inokulum berasal dari media MA3
Pada media P3 dengan komposisi glutamin, 200 ml air kelapa, dan sukrosa
4%, embrio fase kotiledonari yang berasal dari media MA2 dan MA3 menunjukkan
pertumbuhan kotiledon yang berwarna hijau, dan menghasilkan banyak embrio
sekunder (Gambar 14A dan 14B). Pada eksplan kotiledon dari MA2, mulai terbentuk
tunas dengan bentuk tanaman rosete dan daun yang tebal. Embrio fase kotiledonari
yang ditanam pada media pendewasaan P4 dengan komposisi glutamin, 200 ml air
kelapa dan sukrosa 2% menunjukkan pertumbuhan embrio sekunder yang cukup
banyak (Gambar 15A dan 15B). Hingga akhir pengamatan, pada media P4 belum
