REGENERASI TUNAS Abstract
4.3.1 Induksi Pembentukan Kalus pada Enam Media Kalus
Pembentukan kalus merupakan salah satu tahapan dalam pembentukan tanaman pada kultur antera tomat (Gresshoff dan Doy 1972; Zagorska et al. 1998; Segui-Simarro dan Nuez 2005; Motallebi-Azar 2010) yang juga ditemukan pada berbagai kultur antera tanaman seperti cabai (Muswita 2003), terung (Khatun et al. 2006) dan padi (Dewi et al. 2001; Dewi et al. 2007, 2009; Safitri et al. 2010). Antera ditanam pada petri yang berisi 25 ml media, kemudian diinkubasi gelap selama 6 minggu untuk menginduksi pembentukan kalus (Gambar 6a). Kalus yang terbentuk memiliki morfologi yang sama. Kalus berwarna putih kekuningan, transparan dengan struktur remah, kompak (Gambar 6b) dan lunak (Gambar 6c).
Gambar 6 Induksi pembentukan kalus tomat. Inokulasi antera pada media induksi kalus (a), struktur kalus kompak, berwarna putih (b), struktur kalus lunak, transparan dan berwarna putih kekuningan (c).
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa media yang digunakan mempengaruhi lamanya inisiasi kalus, sedangkan genotipe maupun interaksi keduanya tidak mempengaruhi lamanya inisiasi kalus. Genotipe dan media secara tunggal mempengaruhi jumlah kalus yang dihasilkan, sedangkan interaksi keduanya tidak mempengaruhi jumlah kalus. Genotipe, media, maupun interaksi keduanya tidak mempengaruhi pertambahan diameter kalus dan jumlah tunas yang dihasilkan (Tabel 3).
Tabel 3 Hasil analisis ragam pengaruh genotipe dan media terhadap jumlah kalus, diameter kalus, dan jumlah tanaman pada kultur antera tomat
Sumber Keragaman Percobaan 1 Percobaan 2 Kuadrat Tengah Lamanya Inisiasi Kalus (HST) Jumlah Kalus per petri Diameter Kalus (mm) Jumlah Tunas Genotipe 0.1 4.0** 0.5 0.0020 Media 0.2 6.7** 0.0 0.0008 Genotipe x Media 0.2 0.6 0.1 0.0008 KK 16.5 17.9 23.6 7.1000
**= berbeda nyata pada taraf α 1%
c b
Perbedaan respon genotipe terhadap lamanya inisiasi kalus, jumlah kalus dan persentase jumlah kalus pada genotipe yang berbeda disajikan pada Tabel 4. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kalus pertama terbentuk setelah kultur diinkubasi selama 26.4 hari (Tora) dan 27.7 hari (Ratna dan Permata). Jumlah kalus paling tinggi dihasilkan oleh genotipe Permata sebesar 5.5 berbeda dengan genotipe Tora dan Ratna yaitu 2.8 dan 2.4, sedangkan jumlah kalus genotipe Tora dan Ratna tidak berbeda diantara keduanya. Efisiensi pembentukan kalus dari setiap genotipe yang dikulturkan pada enam media induksi kalus dinyatakan dengan persentase jumlah kalus terhadap jumlah antera. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa genotipe Permata memiliki efisiensi pembentukan kalus paling tinggi yaitu sebesar 27.3%, kemudian genotipe Tora 14.0% dan Ratna 12.0%. Perbedaan jumlah kalus antara genotipe tomat hasil kultur antera juga dilaporkan oleh Zamir et al. (1980), Zagorska et al. (1998),Asoliman et al. (2007), dan Motallebi-Azar et al. (2010). Tabel 4 Perbedaan respon lamanya inisiasi kalus, jumlah kalus dan persentase
jumlah kalus pada genotipe tomat yang berbeda
Genotipe Lamanya inisiasi
kalus (HST)
Jumlah kalus per petri Persentase jumlah kalus (%)× Tora 26.4 2.8 b 14.0 Ratna 27.7 2.4 b 12.0 Permata 27.7 5.5 a 27.3
×= Data tidak dianalisis. Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama adalah berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf α 5%.
Berdasarkan perbedaan respon lamanya inisiasi kalus, jumlah kalus dan persen jumlah kalus pada media yang berbeda disajikan pada Tabel 5. Tidak ada perbedaan yang nyata dalam inisiasi kalus antara media M1, M2, M3, M4 dan M5, kecuali media M6, dimana media M6 tidak menginduksi kalus sama sekali. Kalus pertama terbentuk setelah kultur diinkubasi selama 25.0 hari, yaitu terjadi pada media DBMI + 5 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1 NAA (M1), dan kalus paling lama terbentuk setelah 28.6 hari, yaitu pada media DBMI + 1 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1
NAA (M2), sedangkan pada media M6 kalus tidak terbentuk sama sekali.
Pembentukan kalus pada kultur antera tomat yang dilaporkan oleh Asoliman et al.
(2007) dan Motallebi-Azar (2010) terjadi setelah 4 minggu atau 28 hari kultur.
Jumlah kalus yang dihasilkan oleh media DBMI + 5 mg L-1 Kinetin + 2 mg
L-1 NAA (M1) tidak berbeda dengan DBMII + 1 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1 NAA (M2) yaitu berturut-turut 7.9 dan 6.6, namun keduanya berbeda dengan media lainnya. Respon beragam yang ditunjukkan oleh media terhadap jumlah kalus menunjukkan bahwa media menentukan keberhasilan induksi kalus. Hal ini seperti
yang dikemukakan oleh Zagorska et al. (1998), bahwa komposisi media merupakan
23
Tabel 5 Perbedaan respon lamanya inisiasi kalus, jumlah kalus dan persen jumlah kalus tomat pada media yang berbeda
Media induksi kalus (M)
Lamanya inisiasi
kalus (HST) Jumlah kalus
Persentase jumlah kalus (%)× M1 25.0 7.9 a 39.7 M2 28.6 6.6 a 33.0 M3 27.4 3.2 b 16.0 M4 26.4 1.8 bc 9.0 M5 27.6 1.8 bc 9.0
×= Data tidak dianalisis. Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama adalah berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf α 5%.
Media M6 tidak menginduksi kalus dapat disebabkan karena kombinasi dan konsentrasi ZPT yang digunakan belum sesuai dengan genotipe yang digunakan.
Shtereva et al. (1998) menyatakan bahwa bahwa kombinasi 2ip dan IAA lebih baik
dibanding kombinasi Zeatin dan IAA dalam induksi kalus maupun organogenesis dalam kultur antera tomat. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian ini, bahwa Media M4 dengan kombinasi 2ip dan IAA menghasilkan kalus 1.8 sedangkan M6 dengan kombinasi Zeatin dan IAA tidak menghasilkan kalus sama sekali.
Efisiensi pembentukan kalus paling tinggi dihasilkan oleh media DBMI + 5 mg L-1 kinetin + 2 mg L-1 NAA (M1) dan DBMII + 1 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1
NAA (M2) berturut-turut sebesar 39.7% dan 33.0%. Media DBMI + 5 mg L-1
Kinetin + 2 mg L-1 NAA juga dilaporkan menginduksi kalus secara optimal pada
berbagai genotipe yang digunakan dalam penelitian-penelitian sebelumnya (Gresshoff dan Doy 1972; Summers et al. 1992; Motallebi-Azar 2010). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa media DBMI + 5 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1 NAA dapat digunakan untuk berbagai genotipe tomat. Beragamnya jumlah kalus dan efisiensi pembentukan kalus ketiga genotipe pada media yang digunakan menunjukkan bahwa genotipe yang berbeda membutuhkan media yang berbeda. Kondisi ini mengakibatkan sulitnya memperoleh media yang universal untuk kultur antera tomat.
Gambar 7 menunjukkan modus data jumlah antera berespon yang berkalus per kuncup pada masing-masing genotipe. Modus data menunjukkan bahwa dalam satu kuncup bunga yang terdiri atas lima antera, paling banyak hanya 1 hingga 2 antera yang berespon menghasilkan kalus. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan jumlah kalus tidak hanya terjadi pada tingkat genotipe, namun terjadi pada tingkat yang lebih rendah yaitu antar antera dalam satu kuncup yang sama.
Gambar 7 Modus data jumlah antera bersepon per kuncup pada tiap genotipe tomat
4.3.2 Induksi Pembentukan Tunas pada Dua Media Regenerasi
Kalus yang berkembang pada media induksi tunas memiliki morfologi yang bervariasi. Kalus lunak, mengandung banyak air, berkembang lambat, kemudian mencokelat dan akhirnya mati (Gambar 8a). Kalus remah, berwarna hijau, berkembang lebih cepat dengan tipe perkembangan kalus ke arah vertikal. Kalus seperti ini memiliki bagian yang mudah dipisahkan dan bagian yang sulit dipisahkan. Kalus yang berada paling atas dari permukaan kalus lebih mudah terpisah dibandingkan kalus yang mendekati permukaan media (Gambar 8b-c). Kalus seperti ini terus berkembang hingga menembus dasar media, kemudian mencokelat dan mati. Kalus kompak, dengan arah perkembangan lebih dominan melebar kesamping memiliki struktur yang kompak dan sulit dipisahkan. Terdapat struktur halus berwarna putih yang menutupi permukaan kalus (Gambar 8d). Kalus seperti ini lebih lama mengalami pencokelatan. Struktur halus berwarna putih yang terbentuk bila diamati menyerupai serabut atau bulu yang mengandung banyak air.
Gambar 8 Penampilan kalus yang berkembang pada media induksi tunas tomat. Kalus lunak, mengandung banyak air (a), kalus kompak, remah (b dan c), dan kalus kompak, memiliki sturktur bulu halus berwarna putih (d) Kalus yang tidak menginduksi tunas, namun terus berproliferasi dapat disebabkan karena faktor genetik dari tanaman tomat maupun faktor eksternal berupa zat pengatur tumbuh. Menurut Davies (2004), zat pengatur tumbuh dalam mempengaruhi perkembangan jaringan tanaman dipengaruhi oleh hormon endogen yang tersedia, letak zat pengatur tumbuh dari jaringan target, serta sensitivitas dan responsivitas dari jaringan tanaman. Tomat merupakan spesis rekalsitran in vitro, yang diduga menjadi penyebab rendahnya respon jaringan tanaman terhadap media kultur khususnya zat pengatur tumbuh. Rekalsitran in vitro adalah keadaan dimana eksplan yang dikultur memberi respon yang sangat rendah terhadap lingkungan kultur yang diberikan atau sulit merespon. Hal ini dipengaruhi oleh faktor utama yaitu genotipe. Rekalsitran in vitro pada tomat dapat disebabkan karena rendahnya
0 10 20 30 40 50 60 1;2 2;3 3;4 4;5 MO DU S DA T A
RANGE JUMLAH ANTERA BERESPON PER KUNCUP
Tora Ratna Permata d c b a Mo d u s Data 1-2 2-3 3-4 4-5
25
sensitivitas dan responsivitas dari jaringan tanaman sebagai akibat pengaruh faktor genetik dari tanaman tomat. Rendahnya sensitivitas dan responsivitas tomat juga dapat menyebabkan pergerakan zat pengatur tumbuh menjadi lambat untuk mencapai jaringan target.
Kalus yang berhadapan dengan media kultur memiliki bagian berwarna hijau lebih banyak dibanding dengan bagian lainnya (Gambar 9a dan c), serta tidak terdapat serabut putih seperti pada bagian permukaan kalus (Gambar 9b dan d). Kalus yang berwarna hijau menunjukkan adanya proses pembentukan klorofil pada masa sel kalus, yang lama kelamaan membesar dan menjadi kalus kompak. Bagian kalus yang berwarna putih mengandung banyak air dan terlihat seperti serabut- serabut halus. Kalus tipe ini menjadi sebuah ciri khas pada kalus tomat yang tidak ditemui pada kalus dari tanaman lain. Hal ini diduga menjadi salah faktor yang menghambat morfogenesis kalus menjadi tunas.
Gambar 9 Penampilan kalus tomat yang berhadapan dengan media kultur. Penampilan kalus dari bagian permukaan atas (a dan c) dan permukaan bagian bawah (b dan d)
Pertambahan diameter kalus, lamanya inisiasi tunas, jumlah tunas dan persen jumlah tunas terhadap jumlah kalus pada tiga genotipe tomat dan dua media regenerasi disajikan pada Tabel 6. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pertambahan diameter kalus Tora, Ratna dan Permata selama 2 minggu, yaitu berturut-turut sebesar 2.8 mm, 1.4 mm dan 2.0 mm. Pertambahan diameter kalus pada media MS + 1 mg L-1 Zeatin + 0.125 mg L-1 IAA dan MS + 0.25 mg L-1 Zeatin
berturut-turut adalah 2.0 dan 2.1 mm.
Bertambahnya diameter kalus pada media induksi tunas dapat disebabkan oleh faktor genetik, dimana genotipe yang digunakan memiliki daya regenerasi yang rendah, sehingga kalus terus berproliferasi tanpa adanya inisiasi tunas. Selain itu, diduga keseimbangan konsentrasi dan jenis ZPT dalam penelitian ini belum sesuai dengan genotipe yang digunakan sehingga belum mampu menginduksi
munculnya tunas secara optimal. Hal ini seperti yang dikemukan oleh Zagorska et
al. (2004), bahwa jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan menentukan respon
kultur antera tomat.
Pembentukan tunas pertama kali muncul setelah berumur 57.0 hari, yaitu ditunjukkan oleh genotipe Tora, kemudian 60.0 hari pada genotipe Permata. Genotipe Ratna tidak menghasilkan tunas sama sekali. Segui-Simarro dan Nuez (2005) melaporkan bahwa tunas pertama kali muncul setelah 42 hari. Hal ini
d c
b a
menunjukkan bahwa lamanya inisiasi tunas dapat dipengaruhi oleh genotipe yang digunakan.
Genotipe maupun media yang digunakan menunjukkan respon yang sama dalam menghasilkan tunas. Genotipe Permata menghasilkan tunas paling banyak, yaitu 0.04 sedangkan genotipe Ratna tidak menghasilkan tunas sama sekali (Tabel 6). Tunas hanya muncul sekali pada tiap kalus, dimana tidak terjadi inisiasi tunas
baru selama pertumbuhan tunas pertama. Media MS + 1 mg L-1 Zeatin + 0.125 IAA
mg L-1 dan MS + 0.25 mg L-1 Zeatin dapat menginduksi tunas berturut-turut
sebanyak 0.03 dan 0.01 tunas. Rendahnya pembentukan tunas dapat disebabkan karena pengaruh genotipe, juga karena kombinasi jenis dan konsentrasi ZPT yang belum sesuai dengan genotipe yang digunakan. Zamir et al. (1980) melaporkan bahwa kombinasi Zeatin dan IAA dapat menghasilkan tanaman melalui kultur antera tomat. Sebaliknya, meunurut Shtereva et al. (1998), kombinasi 2ip dan IAA lebih baik dari kombinasi Zeatin dan IAA.
Tabel 6 Pertambahan diameter kalus, lamanya inisiasi tunas, jumlah tunas dan persen jumlah tunas terhadap jumlah kalus pada tiga genotipe tomat dan dua media regenerasi
Perlakuan Pertambahan diameter kalus (mm) Lamanya inisiasi tunas (HST) Jumlah tunas Persentase jumlah tunas terhadap jumlah kalus (%) Genotipe Tora 2.8 57.0 0.02 2.1 Ratna 1.4 0.0 0.00 0.0 Permata 2.0 60.0 0.04 4.2 Media R1 2.0 68.0 0.01 1.4 R2 2.1 58.0 0.03 2.8
Efisiensi pembentukan tunas paling tinggi mencapai 4.2% yaitu dihasilkan oleh genotipe Permata. Efisiensi pembentukan tunas genotipe Tora dan Ratna lebih rendah yaitu berturut-turut 2.1% dan 0.0%. Efisiensi pembentukan tunas paling tinggi dihasilkan oleh media MS + 0.25 mg L-1 Zeatin yaitu sebesar 2.8%,
sedangkan media MS + 1 mg L-1 Zeatin + 0.125 mg L-1 IAA menghasilkan efisiensi pembentukan kalus 1.4% (Tabel 6). Penelitian Motallebi-Azar (2010)
menggunakan media MS + 1 mg L-1 Zeatin + 0.125 mg L-1 IAA dan Seguì-Simarro
(2005) pada media MS + 0.25 mg L-1 Zeatin mampu menghasilkan tanaman hingga
aklimatisasi. Walaupun menurut Shtereva et al. (1998) bahwa kombinasi IAA dan
Zeatin menghasilkan organisasi yang rendah bila dibandingkan dengan kombinasi 2ip dan IAA, namun hasil penelitian ini menunjukkan kebalikannya bahwa Zeatin tunggal maupun kombinasinya dengan IAA dapat menghasilkan tunas. Hal ini mendukung hasil penelitian terdahulu, bahwa keberhasilan kultur antera tomat sangat ditentukan oleh genotipe yang digunakan (Gresshoff dan Doy 1972; Zagorska et al. 1998; Motallebi-Azar 2010).
Pertumbuhan tunas genotipe Permata pada media MS + 1 mg L-1 Zeatin +
0.125 mg L-1 IAA (R1) ditunjukkan pada Gambar 10. Tunas berasal dari kalus yang telah berwarna kecokelatan. Tunas yang muncul berwarna hijau muda
27
(Gambar 10a). Bakal daun muncul dari permukaan kalus, memanjang membentuk daun, namun tidak terlihat adanya batang (Gambar 10b-d).
Gambar 10 Pertumbuhan tunas tomat Permata pada media R1. Bakal tunas muncul pertama kali setelah 68 hari dikultur (a). Pertumbuhan bakal daun setelah 8 hingga 46 hari dikultur (b). Perkembangan daun setelah 67 hari dikultur (c). Tunas mengalami pencokelatan setelah 3 bulan dikultur (d)
Bakal tunas pada media MS + 1 mg L-1 Zeatin + 0.125 mg L-1 IAA tumbuh
cepat di hari-hari pertama pertumbuhan yaitu saat berumur 8 hingga 46 hari (Gambar 10a-b), kemudian pertumbuhan melambat setelah tunas mencapai umur 67 hari atau 2 bulan. Tangkai daun memanjang dari permukaan kalus tanpa adanya batang. Daun tidak membuka sempurna dan urat serta tulang daun tidak begitu jelas terlihat (Gambar 10c). Tunas kemudian mengalami pencokelatan setelah 3 bulan dikultur (Gambar 10d). Pencokelatan pada tunas diawali pada bagian pangkal tunas, kemudian menyebar ke seluruh bagian tunas yang menandai akhir pertumbuhan tunas. Tunas ini tidak diregenerasikan pada media perakaran karena daun tidak terbentuk sempurna. Terdapat spot cokelat pada beberapa bagian daun yang menandai matinya jaringan.
Bakal tunas genotipe Permata pada media MS + 0.25 mg L-1 Zeatin juga menunjukkan pertumbuhan yang baik dihari-hari pertama kemunculan (Gambar 11). Tunas yang terbentuk juga abnormal. Daun memanjang, runcing pada bagian ujung, tepi daun menggulung ke bagian dalam, serta bentuk daun bengkok. Tunas pertama muncul berwarna hijau agak tua (Gambar 11a). Tunas menunjukkan pertumbuhan yang cepat setelah 11 hingga 28 hari disubkultur (Gambar 11b-c). Pertumbuhan tunas akhirnya terhenti setelah tunas berumur 106 hari atau sekitar 3 bulan (Gambar 11d). Bagian ujung daun mengalami pencokelatan, sedangkan permukaan daun mulai berubah dari hijau menjadi kuning.
d c
b a
Gambar 11 Pertumbuhan tunas tomat Permata pada media R2. Pembentukan tunas 60 HST (a), pertumbuhan tunas selama 11 hari setelah sub kultur (b), tunas berumur 28 hari setelah disubkultur (c), keseluruhan tunas mengalami pencokelatan setelah berumur 138 hari atau 3 bulan (d)
Pertumbuhan tunas genotipe Tora pada media MS + 0.25 mg L-1 Zeatin (R2)
ditunjukkan pada Gambar 12. Tunas yang tumbuh berasal dari kalus yang remah dan telah berwarna cokelat tua kehitaman. Tunas yang tumbuh berwarna hijau dan terlihat lunak(Gambar 12a). Tunas tumbuh baik setelah 14 hari disubkultur (Gambar 12b-c), kemudian mengalami pencokelatan setelah berumur 91 hari atau 13 minggu (Gambar 12d). Bentuk tunas yang abnormal mengakibatkan pertumbuhan tunas melambat dan akhirnya mati. Tunas yang abnormal juga
ditemukan dalam penelitian Zagorska et al. (1998) dan Seguì-Simarro dan Nuez
(2005). Tunas yang abnormal hanya mampu bertahan hingga 6 minggu kemudian mati. Kalus yang tidak menghasilkan tunas terus berproliferasi dan akhirnya mati.
Gambar 12 Pertumbuhan tunas tomat Tora pada media R2. Bakal tunas muncul pertama kali setelah 57 hari dikultur (a), tunas setelah 14 hari disubkultur (b, c). Tunas mengalami pencokelatan setelah berumur 91 hari atau 13 minggu (d)
Penampilan jaringan daun yang abnormal ditunjukkan pada Gambar 13. Tepi daun menggulung ke arah permukaan daun sehingga terlihat menyerupai tabung, berukuran panjang, bengkok serta berwarna hijau muda (Gambar 13a). Daun memiliki jaringan palisade dan parenkim yang belum terbentuk sempurna, serta
d c b a d c b a
29
jumlah stomata sedikit (Gambar 13b). Stomata saat diamati berada dalam bentuk yang normal dengan beberapa sel penjaga (Gambar 13c). Hal ini menunjukkan bahwa ketidaknormalan daun yang terbentuk disebabkan juga karena pembentukan jaringannya yang tidak optimal. Hal ini dapat menjadi dugaan bahwa tunas yang dihasilkan adalah haploid dengan melihat jumlah stomata dan pertumbuhan tunas yang abnormal, dimana jumlah stomata yang teramati hanya sebanyak 3 stomata, sedangkan jumlah stomata pada daun tanaman tomat diploid adalah 18 stomata per cm2 (Gaswanto et al. 2009).
Gambar 13 Penampilan jaringan daun yang abnormal hasil kultur antera tomat Permata. Bentuk daun yang diamati di bawah mikroskop (a), jaringan palisade dan stomata (b), stomata dan sel-sel penjaga (c)
Dari segi jumlah stomata, ukuran stomata, bentuk dan ukuran daun pada penelitian ini, maka dapat diduga bahwa tunas yang dihasilkan melalui kultur antera tomat adalah haploid. Salah satu ciri penampilan tanaman haploid adalah memiliki jumlah stomata lebih sedikit dibandingkan tanaman diploidnya. Selain itu, tanaman haploid juga memiliki penampilan morfologi yang berbeda dengan tanaman diploidnya. Tanaman haploid hasil kultur antera padi misalnya, memiliki tinggi yang lebih rendah dari tanaman diploidnya (Dewi et al. 2010), ukuran daun lebih kecil dan sempit, serta jumlah anakan lebih banyak. Tanaman tomat haploid hasil kultur antera ditunjukkan oleh Zagorska et al. (1998), dimana tanaman memiliki bentuk yang abnormal, kerdil, dan memiliki ukuran daun yang lebih sempit.
4.4 Kesimpulan
Tomat Permata memiliki daya kultur antera yang lebih baik dibandingkan genotipe Tora dan Ratna dalam jumlah kalus maupun jumlah tunas. Media yang
paling baik menginduksi kalus adalah media M1: DBMI + 5 mg L-1 kinetin + 2 mg
L-1 NAA (39.7%). Media yang paling baik menginduksi tunas adalah media R2:
MS + 0.25 mg L-1 Zeatin (2.8%).